一种金霉素降解菌株的筛选方法

李艳菊, 肖思颖, 董晓霞, 蒋耘晨, 袁聪颖

2012年7月25日

2012年2月13日

2012年2月13日

北京理工大学

C12N1/00GK102604832SQ20121003125

金霉素 菌株 降解 筛选

1.一种金霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于具体步骤如下1)金霉素降解菌株的分离采集金霉素菌渣与废水，将菌渣加入到蒸馏水中，混合，提取菌渣浸出液；分别吸取废水和菌渣浸出液，依次涂布于金霉素含量不同的无机盐固体培养基平板上，置于28°C -30°C条件下遮光培养2-7天，得到不同菌落；2)菌株纯化将步骤I)分离得到的菌落，分别在含有金霉素的无机盐固体培养基平板上划线，进一步分离和纯化；此步骤重复1-2次，直至得到单一菌落；然后将单菌落依次接入含有金霉素的无机盐液体培养基中，置于28°C -30°C，160-170r/min振荡条件下，遮光培养1_3天，得到单一菌落培养液；3)菌株降解功能验证将步骤2)得到的培养液，分别在金霉素为唯一碳源且金霉素浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线，28°C -30°C避光培养2-7天；能够生长的菌株即为能够以金霉素为唯一碳源的降解菌株；4)菌株降解活性测定将步骤3)得到的能在金霉素为唯一碳源生长的菌株，分别转接到活化培养基上进行活化；然后将活化的菌液按1% -3%的接种量，转接到以金霉素为唯一碳源且浓度适宜的无机盐液体培养基中，28°C -30°C,160-170r/min震荡暗培养1_3天，最后用高效液相色谱法测定各菌株对金霉素的降解率；试管斜面保存不同浓度降解率高的菌株，4V储存2.根据权利要求I所述的一种金霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于步骤I)中菌渣和蒸馏水的添加比例为Ig 10ml，吸取废水和菌渣浸出液的体积均为200-400 μ I3.根据权利要求I所述的一种金霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于步骤I)中培养基中金霉素含量为I. Og/L-15. Og/L4.根据权利要求I所述的一种金霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于步骤I)中无机盐固体培养基的组成为(NH4)2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，NaCl 0. 2g，CaCl2O. lg，FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g，葡萄糖 2g，琼脂 13g ;将上述物质溶于 1000ml 蒸馏水中，115°C湿热灭菌15-20min ;在倒平板前，在培养基中添加金霉素，添加浓度依次为 O. lg/L、l. Og/L,2. Og/L,3. Og/L,4. Og/L,5. 0g/L、10. Og/L 和 15. 0g/L，摇匀5.根据权利要求I所述的一种金霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于步骤2)中无机盐固体培养基的组成为(NH4) 2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，NaCl 0. 2g，CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g，葡萄糖 5. 0g/L，琼脂 13g/L ;将上述物质溶于 1000ml蒸懼水中，115°C湿热灭菌15_20min ;倒平板前,加入2. 0g/L金霉素,摇勻6.根据权利要求I所述的一种金霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于步骤2)中无机盐液体培养基组成为(NH4) 2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，NaCl0.2g，CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g，葡萄糖 5. Og/L ;将上述物质溶于 1000ml 蒸馏水中，115°C湿热灭菌15-20min，待冷却到室温后，加入2. 0g/L金霉素，摇匀7.根据权利要求I所述的一种金霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于步骤3)中无机盐固体培养基组成为(NH4) 2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 5g， NaClO. 2g，CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA 0. 015g,琼脂 13g ;将上述物质溶于 1000ml 蒸馏水中，121 °C湿热灭菌20min ;在倒平板前，分别加入金霉素为O. lg/L、5. 0g/LU0. Og/L、 15. Og/L,配成4个金霉素梯度的培养基,摇勻8.根据权利要求I所述的一种金霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于步骤4)中细菌活化培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，其配方为牛肉膏3.0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. Og, 琼脂13. Og ;将其溶于IOOOmL蒸馏水中，121 °C湿热灭菌20min9.根据权利要求I所述的一种金霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于步骤4) 中真菌活化培养基为马丁氏培养基，其组成为葡萄糖10. 0g，蛋白胨5. 0g, KH2PO4O. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 5g ;将其溶于IOOOmL蒸馏水中，115°C湿热灭菌15_20min10.根据权利要求I所述的一种金霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于用如下步骤代替步骤I)和步骤2) 1)菌种富集采集菌渣与废水，称取废渣10g，置于250mL三角瓶中，加入IOOml蒸馏水，在摇床上摇匀，提取浸出液；吸取IOmL废水样与菌渣浸出液，分别接入装有IOOml富集培养基的250mL 的三角瓶中，280C -300C，170r/min震荡条件下，暗培养2_3天；然后取5ml培养液转入新的相同的培养基中，在相同的培养条件下继续富集培养一次；无机盐液体富集培养基组成为葡萄糖2g，(NH4)2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 5g, NaCl 0. 2g, CaCl2O. lg, FeSO4O. Olg, EDTA0. 015g，琼脂 13g ;将上述物质溶于1000ml蒸馏水中，分装到250mL三角瓶中，115°C湿热灭菌15_20min，在超净工作台中添加金霉素，添加浓度依次为 0. lg/L、l. 0g/L、2. 0g/L、3. 0g/L、4. 0g/L、5. 0g/L、10. Og/L 和 15. 0g/L，摇匀；2)菌株分离吸取200 μ I上述富集培养液，分别一一对应涂布于上面所述8种不同金霉素浓度的无机盐固体培养基平板上，置于28°C -30°C条件下遮光培养2-7天；无机盐固体培养基组成为葡萄糖2. 0g，(NH4) 2S042. 0g, K2HPO4O. 5g，KH2PO4O. 5g， MgSO4 ·7Η20 0. 5g，NaCl 0. 2g, CaCl2O. lg，FeSO4O. 01g，EDTA0. 015g，琼脂 13. 0g，溶于 1000ml 蒸馏水中；115°C湿热灭菌15-20min ;在倒平板前，在培养基中添加金霉素，添加浓度与无机盐液体富集培养基相同

本发明涉及一种金霉素降解菌株的筛选方法，属于微生物降解抗生素残留技术领域