专利名称：一种分离培养多种病毒的方法—种分罔培养多种病毒的方法技术领域本发明属生物技术领域，涉及病毒的分离培养方法，具体涉及一种分离培养多种病毒的方法。尤其是用于分离培养多种病毒的MHV混合细胞液氮保存方法；该方法中包括冻存液的配方、液氮保存时间、经液氮保存细胞复苏的形态和分离培养主要呼吸道病毒、肠道病毒阳性分尚率。现有技术公开了有关病毒性传染病传播速度快、范围广、社会危害影响大。近几十年来，新的确认的病毒性传染病不断出现，同时已被控制的一些传染病又死灰复燃，人类与传染病的斗争形势仍旧十分严峻。对于传染性疾病尤其是爆发疫情有效的鉴别诊断是公共卫生应急诊断的前沿技术，因此，及时准确诊断感染病原体对社会民心的稳定至关重要。有研究报道，采用MDCK细胞、HEp-2细胞和VeiO细胞的三系混合细胞，可用于分离培养主要的呼吸道病毒如流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等，人肠道病毒属的肠道病毒EV71、CA16。当前，国内采用混合细胞瓶分离培养多种病毒的研究较少，主要受制于实验条件和繁复操作；且有限的研究也仅限于二种或三种细胞计数制备后，直接用于多种病毒的分离培养。现有的病毒的分离培养方法远不能解决目前传染性疾病爆发疫情的公共卫生应急的需求。发明内容本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种分离培养多种病毒的方法，尤其是用于分离培养多种病毒的MHV混合细胞液氮保存方法；该方法包括冻存液的配方、液氮保存时间、经液氮保存细胞复苏的形态和分离培养主要呼吸道病毒、肠道病毒阳性分离率等，能为临床病毒性疾病快速诊断、实验室病毒性传染病监测提供切实的可操作性的方法。本发明方法中，采用MEM冻存液，通过T75细胞瓶制备混合细胞MHV单层细胞，单层细胞经EDTA-胰酶消化，直接悬浮于冷冻保存液中，制成细胞数为IXlO6Ail的冷冻保存液细胞悬液，所述的冷冻保存液保存MHV混合细胞，在液氮中保存4个月，细胞复苏后存活率达到 99.20% 99.60%。本发明方法中，所述的保存的混合细胞MHV包括MDCK、HEp-2, Vero三种细胞，其中，每种细胞的细胞数为3.33X 105/ml，分装NUNC冷冻保存管(型号:1.8ml/管)；混合细胞瓶在冷冻保存管中经液氮保存4个月后复苏，用于分离培养常见呼吸道病毒、肠道病毒。本发明方法中，所述的MEM冻存液为含20%胎牛血清、8% DMSO的MEM培养液；
本发明方法中，选用 的培养基为细胞培养常用培养基，培养条件在可控的温度和CO2浓度下。
本发明方法中，经液氮保存4个月的MHV混合细胞复苏后，倒置显微镜观察细胞显示其折光度好，经37°C培养24h细胞形态良好；用于分离培养病毒，本发明的实施例中，分别用于对甲、乙型流感病毒、腺病毒、EV71病毒分离培养，结果显示，分离培养结果满意。
具体而言，本发明的一种分离培养多种病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(I)制备冷冻保存液:
胎牛血清(GIBC0，货号8114318)6ml ；DMS0(USEN) 2.4ml ;ρΗ7.2MEM 基础培养液(GIBC0，货号778445) 21.6ml，分别加入至50ml无菌塑料管内，制备成含20%胎牛血清、8%DMSO的MEM混合细胞冻存液；
(2)制备MHV混合细胞冷冻保存管:
将MDCK、HEp-2、Vero三株细胞系分别在T75细胞瓶中长成单层细胞后经EDTA-胰酶消化，加入步骤(I)的冷冻保存液悬浮细胞，分别对MDCK、HEp-2、Vero细胞悬液计数后混合，制成细胞数为I X 106/ml的细胞悬液，其中，每株细胞的细胞数分别为3.33 X 105/ml ;将上述混合细胞悬液分装至NUNC冷冻保存管，1.5ml/管；
(3)冷冻程序:
将上述1.5ml/管的冷冻保存管，置程序冷冻盒内(Thermo)，然后将程序冷冻盒置入-80°C冰箱，经24h冷冻后，取出冻存管，置入液氮罐抽屉中，液氮保存分别为I个月、2个月、3个月和4个月；
(4)液氮冻存的MHV细胞复苏和计数:
取上述置入液氮罐冻存分别为I个月、2个月、3个月和4个月的MHV混合细胞管，置入37°C水浴溶解复苏后，细胞悬液低速离心，500转/min，离心5min ;弃上清，用含5%胎牛血清MEM生长液重悬细胞沉淀，并吸入至灭菌细胞瓶，悬浮细胞液用台盼蓝染色后在显微镜下进行活细胞计数；结果显示，所述的冻存液冻存的MHV混合细胞，经4个月液氮冻存后，细胞存活率在99.20 % 99.60 %左右，即:初始冻存I X 106/ml细胞共计3ml，复苏后加入24ml的5%胎牛血清生长液，活细胞计数在1.24 XlOVml以上；
(5)制备MHV混合细胞板:
将上述复苏的混合细胞悬液分装24孔培养板中，Iml/每孔，置37°C、5% C02温箱中培养，24h、48h分别在倒置显微镜观察MHV混合细胞汇合形态、铺满单层百分率；
(6)分尚培养多种病毒
取步骤(5)的复苏的MHV混合细胞制备的细胞培养板分离培养多种病毒；
本发明的实施例 中，采用长成80%左右的细胞单层，用于分离培养常见呼吸道流感病毒、腺病毒和人肠道病毒EV71。
本发明中，对鼻咽拭标本进行处理:鼻咽标本4°C、2000r/min离心5min去除沉淀，0.22微米孔径滤膜过滤除菌或以青/链霉素、两性霉素处理4小时后接种混合细胞瓶，同时设立细胞阴性对照；
接种标本24h以后，开始在倒置显微镜下观察培养细胞致细胞病变效应；
本发明中，观察了致细胞病变效应:所采用的液氮罐中冻存4个月的MHV混合细胞，经复苏制备的混合细胞培养板；当培养物中存在对某一种细胞高敏感度的致病变的病毒，在倒置显微镜下可观察到该种细胞的病变效应，并提供信息:1)培养物可能有致细胞病变的病毒或毒素，2)可能是呼吸道的流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒以及人肠道病毒；
本发明中，检测了特异病毒蛋白，该检测依据某细胞的致细胞病变效应，推测其可能的感染病毒，可进一步采用单克隆免疫荧光鉴定该病毒属或病毒型；
本发明中，采用复苏的MHV混合细胞制备的细胞培养板，用于培养16株流感病毒、10株腺病毒、14株人EV71病毒,7株人肠道病毒属病毒、3株CA16病毒,培养物经培养48h后，均能观察到致细胞病变效应，其中的16株流感病毒、10株腺病毒、14株EV71病毒，单克隆免疫荧光染色均为阳性。
实验结果显示，本发明方法能克服现有技术中(尤其是目前临床实验室不具有制备混合细胞的能力)MHV混和细胞在分离培养主要呼吸道病毒和主要肠道病毒时的缺陷，可为临床病毒性疾病快速诊断、实验室病毒性传染病监测中多种病毒病原(尤其在2种或3种细胞系)的分离培养提供切实的可操作性，可用于保存分离培养多种病毒的MHV混合细胞。进一步的解决目前传染性疾病爆发疫情的公共卫生应急的需求，尤其适用于临床实验室的传染性疾病的检测。
为了便于理解，下面通过附图和具体实施例对本发明的用于分离培养多种病毒的MHV混合细胞液氮保存方法进行详细的描述。需要特别指出的是，具体实施例和附图仅是为了说明，显然本领域的技术人员可以根据本文说明，对本发明进行各种修正或改变，这些修正和改变也将纳入本专利范围之内。


图1显示了本发明中液氮冻存4个月复苏MHV细胞(24h)。
图2显示了本发明中液氮冻存4个月复苏MHV细胞(48h)。
图3显示了本发明中甲HlNl流感病毒污染咽拭子MHV混合细胞(48h)。
图4显示了本发明中季节性HlNl流感病毒污染咽拭子MHV混合细胞(48h)。
图5显示了本发明中甲H3N2流感病毒污染咽拭子MHV混合细胞(48h)。
图6显示了本发明中B型流感病毒污染咽拭子MHV混合细胞CPE (48h)。
图7显示了本发明中对照组MHV混合细胞(48h)。
图8显示了本发明中甲HlNl流感病毒污染咽拭子MHV-抗甲流感病毒McAb*200。
图9显示了本发明中B型感病毒污染模拟咽拭标本MHV-抗B流感病毒McAb*200。
图10显示了本发明中对照组MHV-抗甲流感病毒McAb*200。
图11显示了本发明中腺病毒污染咽拭子MHV混合细胞CPE (48h)。
图12显示了本发明中对照组MHV混合细胞(48h)。
图13显示了本发明中腺病毒污染咽拭子MHV-抗腺病毒McAb*200。
图14显示了本发明中对照组MHV-抗腺病毒McAb*200。
图15显示了本发明中EV71病毒污染咽拭子MHV细胞CPE (48h)。
图16显不了本发明中人肠道病毒属病毒污染咽拭子MHV混合细胞CPE (48h)。
图17显示了本发明中CA16病毒污染咽拭子MHV混合细胞CPE (48h)。
图18显示了本发明中对照组MHV混合细胞(48h)。
图19显示了本发明中EV71病毒污染咽拭子MHV-抗肠道病毒McAb*200。
图20显示了本发明中对照组MHV-抗肠道病毒McAb*200。

实施例1
I)取T75细胞瓶长成单层的MDCK细胞(7代 12代)、HEp_2细胞和Vero细胞，先用PH7.0PBS平衡盐溶液冲洗一遍，加0.25% EDTA-胰蛋白酶消化，吸去EDTA-胰蛋白酶，加入5ml含20%胎牛血清、8% DMSO的MEM混合细胞冻存液，用弯嘴滴管打匀细胞，取上述细胞液900ul加入2ml小塑料管，然后加台盼蓝IOOul染色，取IOul上述染色细胞滴入白细胞计数板计数(染成蓝色的为死细胞)，得到计数结果后，向每种细胞瓶内补充MEM混合细胞冻存液，每一种细胞活细胞数控制为I X 106/ml。
2)将细胞数均计数为I X 106/ml MDCK、HEp_2和Vero细胞等体积混匀，此时，每一种细胞的细胞数为3.33X 105/ml，将上述混合细胞悬液分装NUNC冷冻保存管，1.5ml/管。冷冻保存管置程序冷冻盒内(Thermo)，然后将程序冷冻盒置入-80°C冰箱，经24h冷冻后，将冻存管从程序冷冻盒中取出，迅速置入液氮罐抽屉中，液氮保存。分别在I个月、2个月、3个月和4个月时间段，从液氮罐中取出2支(共计3ml)MHV混合细胞冷冻保存管，将取出的保存管迅速置入37°C水浴，快速溶解复苏。然后将MHV细胞管内细胞悬液吸入15ml离心管中低速离心，500转/min，离心5min。弃上清，用含5%胎牛血清MEM生长液悬浮沉淀，并吸入至灭菌细胞瓶，总体积为24ml。采用台盼蓝染色液对复苏悬浮细胞染色，并在显微镜下进行活细胞计数，活细胞数均在1.24X 10 5/ml以上。将上述复苏的混合细胞悬液分装24孔培养板中，Iml/每孔，置37°C、5% C02温箱中培养，24h、48h分别在倒置显微镜观察MHV混合细胞汇合形态、铺满单层百分率。
结果如图1和图2所示，所述的冻存液(20 %胎牛血清；8 % DMSO的MEM培养液)，冻存的MHV混合细胞瓶，经液氮保存4个月复苏，台盼蓝染色计数，细胞复苏存活率在99.20%以上；倒置显微镜观察细胞折光度好，经37°C培养24h细胞形态良好；细胞单层铺满60%左右。48h培养，细胞单层铺满100%。
实施例2
I)取实验室_80°C保藏的流感病毒16株，吸取每株流感病毒液0.4ml加入至IOml灭菌试管内，再加入3.6ml病毒运输液(I: 10稀释)，随机采集16名志愿者咽拭子分别置入上述含有流感病毒IOml灭菌试管内，模拟临床咽拭子标本。咽拭标本2000r/min离心5min去除沉淀,上清液加入青/链霉素(终浓度100ug/ml)、两性霉素(0.5ug/ml)处理4h后，每份标本取0.2ml分别接种至经48h培养，混合细胞长成单层的24孔细胞培养板中，每份病毒样品和阴性对照平行做2孔。置37°C，5% CO2温箱中孵育lh，让病毒吸附到细胞上，弃上清液，加入病毒培养液Iml/孔，置37°C，5% CO2温箱中培养。24h后开始观察混和细胞板中阴性对照组和病毒接种组细胞形态，观察CPE产生。
2)接种标本组混合细胞孔CPE++ +++后，吸取出对照组和标本组细胞悬液，并同时刮下对照组、标本组细胞滴于12孔玻片上每份样品做2孔。自然干燥，冷丙酮-甲醇固定，pH7.0PBS平衡盐溶液清洗3次后，依次向各样品的2孔中，分别加入甲型、乙型流感病毒单克隆抗体10ul，37°C湿盒孵育30min，PBS盐溶液清洗3次，晾干，滴加荧光镜油，在荧光显微镜下观察荧光颗粒。
结果显示，MDCK、HEp-2、Vero混合细胞瓶分离培养模拟甲型流感病毒咽拭标本9份(2株甲HlNl型，5株季节性HlNl型，2株H3N2型流感病毒)和模拟乙型流感病毒咽拭标本7份，所有已知阳性模拟标本，在接种48h后，在倒置显微镜下均观察到细胞病变效应，(如图3，4，5，6，7所示)；在荧光显微镜下观察到流感病毒特异荧光颗粒(如8，9，10所示)O
实施例3
I)取实验室_80°C保藏的腺病毒10株，吸取每株腺病毒液0.4ml加入IOml灭菌试管中，加入3.6ml病毒运输液(I: 10稀释)，随机采集10名志愿者咽拭子分别置入上述含有腺病毒IOml灭菌试管内，模拟临床咽拭子标本。咽拭标本2000r/min离心5min去除沉淀,上清液加入青/链霉素(终浓度100ug/ml)、两性霉素(0.5ug/ml)处理4h后，每份标本取0.2ml分别接种经48h培养，混合细胞长成单层的24孔细胞培养板中。另取0.2ml病毒运输液接种于混合细胞板中作为阴性对照。每份病毒样品和阴性对照平行做2孔。置37°C，5% CO2温箱中孵育lh，让病毒吸附到细胞上，弃上清液，加入病毒培养液1ml，置37°C，5%CO2温箱中培养。24h后开始观察混和细胞瓶中阴性对照组和病毒接种组细胞形态，观察CPE产生。
2)接种标本组混合细胞孔CPE++ +++后，吸取对照组和标本组细胞悬液，并同时刮下对照组、标本组细胞滴于12孔玻片上每份样品做2孔。自然干燥，冷丙酮-甲醇固定，pH7.0PBS盐溶液清洗3次后，每孔加入腺病毒单克隆抗体IOul，37°C湿盒孵育30min，PBS平衡盐溶液清洗3次，晾干，滴加荧光镜油，在荧光显微镜下观察荧光颗粒。
结果显不，MDCK> HEp-2、Vero混合细胞板分离培养模拟腺病毒咽拭标本10份，10份已知阳性模拟标本，在接种混合细胞培养板48h后，在倒置显微镜下，均观察到致细胞病变效应(如图11，12所示)；在荧光显微镜下观察到腺病毒特异荧光颗粒(如图13，14所示)O
实施例4
I)取实验室-80°C保藏的14株EV71病毒,7株人肠道病毒属病毒、3株CA16病毒，吸取每株病毒液0.4mI加入IOml灭菌试管,加入3.6ml病毒运输液(1: 10稀释)，随机采集24名志愿者咽拭子分别置入上述含有病毒IOml灭菌试管内，模拟临床咽拭子标本。咽拭标本2000r/min离心5min去沉淀,上清液加入青/链霉素(终浓度100ug/ml)、两性霉素(0.5ug/ml)处理4h后，每份标本取0.2ml分别接种经48h培养，混合细胞长成单层的24孔细胞培养板中。每份病毒样品和阴性对照平行做2孔。置37°C，5%C02温箱中孵育lh，让病毒吸附到细胞 上，弃上清液，加入病毒培养液11111，置371:，5(% CO2温箱中培养。24h后开始观察混和细胞孔中阴性对照组和病毒接种组细胞形态，观察CPE产生。
2)接种标本组混合细胞瓶CPE++ +++后，在分离的EV71病毒孔中吸取出对照组和标本组细胞悬液，并同时刮下对照组、标本组细胞滴于12孔玻片上每份样品做2孔。自然干燥，冷丙酮-甲醇固定，PH7.0PBS盐溶液清洗3次后，每孔加入肠道病毒属特异单克隆抗体10ul，37°C湿盒孵育30min，PBS盐溶液清洗3次，晾干，每孔再加二抗:1: 100倍稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG，37°C湿盒孵育30min，PBS盐溶液清洗3次，晾干，滴加荧光镜油，在荧光显微镜下观察荧光颗粒。
结果显示，MDCK、HEp_2、Vero混合细胞板分离培养模拟EV71病毒咽拭标本14份，7株人肠道病毒属病毒、3株CA16病毒，共24份已知阳性模拟标本，在接种混合细胞培养板48h后，在倒置显微镜下均观察到细胞病变效应(如图15，16，17，18所示)；在荧光显微镜下观察到EV71病毒特异突光颗粒(如图19,20所示)。


本发明属生物技术领域，涉及一种分离培养多种病毒的方法。尤其是用于分离培养多种病毒的MHV混合细胞液氮保存方法；本方法中，采用MEM冻存液，通过T75细胞瓶制备混合细胞MHV单层细胞，经EDTA-胰酶消化，直接悬浮于冷冻保存液中，在液氮中保存4个月后，细胞复苏后存活率达到99.20％～99.60％。本发明方法能克服现有技术中MHV混和细胞在分离培养多种病毒时的缺陷，可为临床病毒性疾病的快速诊断、实验室病毒性监测中多种病毒病原的分离培养提供切实的可操作性，尤其适用于呼吸道流感病毒、腺病毒和人肠道病毒EV71分离培养。能解决目前传染性疾病爆发疫情的公共卫生应急的需求，和临床实验室的病毒性传染性疾病的检测。