专利名称：一种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖的制备方法及应用的制作方法一种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖的制备方法及应用技术领域本发明属于生物工程与技术领域，更具体涉及一种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖的制备方法。还涉及一种美味牛肝菌多糖在抗菌中的用途，多糖可广泛应用于医药、食品等工业上做抗菌剂的原料。美味牛肝菌又称大脚菇、白牛肝菌，是担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，牛肝菌科的一种，主要分布于我国河南、台湾、黑龙江、四川、贵州、云南、西藏、内蒙古、福建等地区。是一种可食用真菌，其营养物质丰富，含有多种维生素，氨基酸，多糖和矿物质。该菌具有降血脂，提高免疫力等功效。此外，其水提物对小白鼠肉瘤S-180的抑制率为100%，对艾氏腹水癌的抑制率为90%。目前部分研究集中在驯化菌种和人工栽培子实体，但由于人工栽培技术不足，加上栽培困难，生长周期长，易受季节控制。使得其子实体活性物质产量低，难以推广。而采用深层发酵制备菌丝体可以克服以上不足。发明内容本发明的目的是在于提供了一种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖的制备方法， 方法易行，操作简便，低温、短时、高效，制取的多糖具有较好的抗菌性。现有的具有抗菌性的多糖多为从植物中所提取的如香菇子实体，紫茎泽兰，乌饭树树叶，山莓叶，蒲公英，微藻等中提取多糖。与这些植物多糖相比，本发明通过发酵法得到的多糖具有周期短、方便生产、不受季节限制等优点。本发明的另一个目的是在于提供了一种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖在制备治疗或预防细菌药物中的应用，其主要优点在于该多糖是一种可食用可药用的水溶性多糖。一种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖的制备方法，其步骤是美味牛肝菌菌体的制备方法方法A(1)将美味牛肝菌(编号ACCC50559，由中国农业微生物菌种保藏中心提供)接种于固体斜面培养基，于25°C恒温培养6天，得到斜面种子。固体斜面培养基为(％)马铃薯18-24，葡萄糖1.0-3.0，酵母粉1.0-2.0，琼脂1. 5-2. 5，蛋白胨0. 4-0. 6，磷酸二氢钾0.05-0. 15，七水硫酸锌 0. 03-0. 07。
(2)取培养后的斜面4-5环(用接种环在斜面上取菌种4-5环)接种到一级液体种子培养基，在250ml三角瓶，装液量为IOOml，加10颗玻璃珠，于120r/min，25°C培养60小时。所述的培养基中各组分及其含量分别为(％)马铃薯18-24，葡萄糖1.0-3.0，酵母粉1.0-2. 0，琼脂 1. 5-2. 5，蛋白胨 0. 4-0. 6，磷酸二氢钾 0. 05-0. 15，七水硫酸锌 0. 03-0. 07。
(3)将培养60h后的一级液体种子按10%的接种量接种到二级液体种子，在250ml 三角瓶，装液量为100ml，加10颗玻璃珠，于^°C，150r/min培养40h。所述的培养基与一级液体种子相同。
(4)将培养40h后的二级液体种子按5%的接种量接种发酵，在250ml三角瓶，装液量为100!111，于观1，1801·/!^!!培养98h。所述的发酵培养基成分为(％ ):马铃薯8_12， 蔗糖1-3，蛋白胨0. 4-0. 8，磷酸二氢钾0. 2-0. 4，七水硫酸镁0. 1-0. 3，碳酸钙0. 1-0. 3。
(5)将菌丝体与发酵液分离，清水冲净，于50°C烘干后研磨得到菌丝体干粉。以上培养基PH均为自然pH。
方法B
步骤(1)-(3)与方法A中(1)-(3)相同
(4)将培养40h后的二级液体种子按5%的接种量接种发酵，在250ml三角瓶， 装液量为100!111，于观1，1801·/!^!!培养98h。所述的发酵培养基成分为(％):酵母膏 0. 8-1. 2，蛋白胨 1. 8-2. 2，葡萄糖 1. 8-2. 2。
(5)将菌丝体与发酵液分离，清水冲净，于50°C烘干后研磨得到菌丝体干粉。以上培养基PH均为自然pH。
美味牛肝菌提取方法
方法A
(1)将美味牛肝菌菌丝体磨碎，加入去离子水进行超声，浓缩液体，加入乙醇沉淀收集美味牛肝菌多糖粗沉淀物；
(2)美味牛肝菌粗多糖沉淀物用水溶解，再用sevag法反复除去游离的蛋白质，直到检测不到蛋白质，浓缩，用乙醇沉淀，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物；
(3)去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物经透析的方法分离，除去小分子杂质，得到多糖分子量在2500-8000道尔顿之间的美味牛肝菌多糖精制提取液，浓缩，加入乙醇沉淀， 得到精制沉淀物
(4)美味牛肝菌多糖精制沉淀物经干燥得到美味牛肝菌多糖精制提取物；
方法B
(1)将美味牛肝菌菌丝体磨碎，加入去离子水进行浸提，浓缩液体，加入乙醇沉淀收集美味牛肝菌多糖粗沉淀物；
(2)美味牛肝菌粗多糖沉淀物用水溶解，再用sevag法反复除去游离的蛋白质，直到检测不到蛋白质，浓缩，用乙醇沉淀，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物；
(3)去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物经透析的方法分离，除去小分子杂质，得到多糖分子量在2500-8000道尔顿之间的美味牛肝菌多糖精制提取液，浓缩，加入乙醇沉淀， 得到精制沉淀物。
(4)美味牛肝菌多糖精制沉淀物经干燥得到美味牛肝菌多糖精制提取物；
美味牛肝菌提取方法中
所述方法AB中醇析沉淀使用的醇为75% _95%的醇，醇的用量为浓缩液的2_4倍体积量，所述的醇为乙醇。
所述方法AB中的浓缩为将提取液浓缩至原体积的1/2-1/4，浓缩采用在50_55°C， 0. 08-0. 09MPa下的减压浓缩。
所述方法AB中使用sevag法除去蛋白质的具体方法为=Sevag溶液为三氯乙酸和正丁醇按体积比5 1混合，sevag溶液和粗多糖溶液按体积比1 2混合，震摇20min，去除蛋白沉淀，反复进行3-7次。
所述干燥为加热恒温干燥。
通过上述方法制备的一种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖在制备治疗或预防细菌药物中的应用，美味牛肝菌多糖在抑制细菌方面有较好的效果。所述细菌为金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、枯草芽孢肝菌(Bacillus subtilis)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、巨大芽孢杆菌 (Bacillus magaterium)肺炎双球杆菌(Pneumococcus)在抗菌的用途中，美味牛肝菌多糖的用量为l-10mg/ml。
采用本发明方法得到的美味牛肝菌多糖呈乳白色，溶于热水。
由上述方法所制得的美味牛肝菌多糖进行以下抗菌实验
实施例1
—种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖的制备方法，其步骤是
A将美味牛肝菌(编号ACCC50559，由中国农业微生物菌种保藏中心提供)接种于固体斜面培养基，于25°C恒温培养6天，得到斜面种子。固体斜面培养基为(％):马铃薯 20，葡萄糖2. 0，酵母粉1. 4，琼脂2，蛋白胨0. 6，磷酸二氢甲0. 1，七水硫酸锌0. 05。
B 取培养后的斜面4-5环接种到一级液体种子培养基，在250ml三角瓶，装液量为100ml，加10颗玻璃珠，于120r/min，25°C培养60小时。所述的培养基中各组分及其含量分别为(％ )马铃薯20，葡萄糖2. 0，酵母粉1. 4，蛋白胨0. 6，磷酸二氢甲0. 1，七水硫酸锌 0. 05。
C将培养60h后的一级液体种子按10%的接种量接种到二级液体种子，在250ml 三角瓶，装液量为100ml，加10颗玻璃珠，于^°C，150r/min培养40h。所述的培养基与一级液体种子相同。
D将培养40h后的二级液体种子按5%的接种量接种到IOL发酵罐中，发酵罐装料系数为0. 7，罐压为0. 04或0. 05或0. 06或0. 07MPa。于，180r/min培养72h后放罐。所述发酵培养基成分为(％):马铃薯10，蔗糖2，蛋白胨0.6，磷酸二氢钾0.3，七水硫酸镁0.2，碳酸钙0.2。
E将菌丝体与发酵液分离，清水冲净，于50°C烘干后研磨得到菌丝体干粉。
F取粉碎的美味牛肝菌菌丝体适量，加入50倍量的去离子水，在53或M或55或 56°C超声8. 5min。重复3次，合并3次提取液，将提取液在7000rpm下离心8min。滤液在减压(0. 08-0. 09MPa)浓缩至原体积的1/3，搅拌下向浓缩提取液中加入3倍体积95% (ν/ν)乙醇，将浓缩提取液中的多糖沉淀出，收集美味牛肝菌菌丝体多糖粗沉淀物；向多糖粗沉淀物中加入去离子水溶解，使之充分复溶，用sevag法去蛋白，重复进行，直到检测不出蛋白质。减压浓缩后，加入3倍体积95% (ν/ν)乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗涤，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物，将多糖沉淀溶于水，用去离子水透析，得到分子量在3000-8000 道尔顿之间的美味牛肝菌多糖精制液，在搅拌下再加入3倍体积95% (ν/ν)乙醇沉淀，静置析出沉淀，干燥得到美味牛肝菌精制多糖固体，该多糖颜色为乳白色。
以上培养基ρΗ均为自然ρΗ (ρΗ6-7)。
实施例2
—种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖的制备方法，其步骤是
实施例2步骤A-E与实施例1中步骤A-E相同
F取粉碎的美味牛肝菌菌丝体适量，加入50倍量的去离子水，在53或M或55或 56°C浸提2h。重复3次，合并3次提取液，将提取液在7000rpm下离心8min。滤液在减压(0. 08-0. 09MPa)浓缩至原体积的1/3，搅拌下向浓缩提取液中加入3倍体积95% (ν/ν) 乙醇，将浓缩提取液中的多糖沉淀出，收集美味牛肝菌菌丝体多糖粗沉淀物；向多糖粗沉淀物中加入去离子水溶解，使之充分复溶，用sevag法去蛋白，重复进行，直到检测不出蛋白质。减压浓缩后，加入3倍体积95% (ν/ν)乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗涤，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物，将多糖沉淀溶于水，用去离子水透析，得到分子量在3000-8000道尔顿之间的美味牛肝菌多糖精制液，在搅拌下再加入3倍体积95% (ν/ν)乙醇沉淀，静置析出沉淀，干燥得到美味牛肝菌精制多糖固体，该多糖颜色为乳白色。
以上培养基ρΗ均为自然ρΗ (ρΗ6-7)。
实施例3
一种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖的制备方法，其步骤是
实施例3步骤A-C与实施例1中步骤A-C相同
D将培养40h后的二级液体种子按5%的接种量接种到250mL三角瓶进行发酵培养72h，装液量为100ml，温度为^°C，转速为180r/min。所述的发酵培养基成分为(％ ) 酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2。
E将菌丝体与发酵液分离，清水冲净，于50°C烘干后研磨得到菌丝体干粉。
F 取粉碎的美味牛肝菌菌丝体适量，加入50倍量的去离子水，在52或53或M 或55或56°C超声8. 5min。重复3次，合并3次提取液，将提取液在7000rpm下离心8min。 滤液在减压(0. 08-0. 09MPa)浓缩至原体积的1/3，搅拌下向浓缩提取液中加入3倍体积95% (ν/ν)乙醇，将浓缩提取液中的多糖沉淀出，收集美味牛肝菌菌丝体多糖粗沉淀物；向多糖粗沉淀物中加入去离子水溶解，使之充分复溶，用sevag法去蛋白，重复进行，直到检测不出蛋白质。减压浓缩后，加入3倍体积95% (ν/ν)乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗涤，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物，将多糖沉淀溶于水，用去离子水透析，得到分子量在 3000-8000道尔顿之间的美味牛肝菌多糖精制液，在搅拌下再加入3倍体积95% (ν/ν)乙醇沉淀，静置析出沉淀，干燥得到美味牛肝菌精制多糖固体，该多糖颜色为乳白色。
以上培养基ρΗ均为自然ρΗ (ρΗ6-7)。
实施例4
一种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖的制备方法，其步骤是
实施例4步骤A-C与实施例1中步骤A-C相同
D将培养40h后的二级液体种子按5%的接种量接种到250mL三角瓶进行发酵培养72h，装液量为100ml，温度为^°C，转速为180r/min。所述的发酵培养基成分为(％ ) 酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2。
E将菌丝体与发酵液分离，清水冲净，于50°C烘干后研磨得到菌丝体干粉。
F取粉碎的美味牛肝菌菌丝体适量，加入50倍量的去离子水，在52或53或讨或 55或56°C浸提池。重复3次，合并3次提取液，将提取液在7000rpm下离心8min。滤液在减压(0. 08-0. 09MPa)浓缩至原体积的1/3，搅拌下向浓缩提取液中加入3倍体积95%(ν/ν)乙醇，将浓缩提取液中的多糖沉淀出，收集美味牛肝菌菌丝体多糖粗沉淀物；向多糖粗沉淀物中加入去离子水溶解，使之充分复溶，用sevag法去蛋白，重复进行，直到检测不出蛋白质。减压浓缩后，加入3倍体积95% (ν/ν)乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗涤，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物，将多糖沉淀溶于水，用去离子水透析，得到分子量在3000-8000 道尔顿之间的美味牛肝菌多糖精制液，在搅拌下再加入3倍体积95% (ν/ν)乙醇沉淀，静置析出沉淀，干燥得到美味牛肝菌精制多糖固体，该多糖颜色为乳白色。
将上述实施例1-4所得的多糖进行抗菌实验
方法利用打孔器将滤纸制成直径为6mm的圆形纸片，121°0,30πι η灭菌备用，利用去离子水将美味牛肝菌多糖分别配制成l、2、4、8、10mg/ml的溶液，滤膜除菌备用，以不加多糖为空白对照。用移液枪分别吸取0.2ml各种菌悬液到平皿培养基上，涂布均勻。将滤纸片分别在各浓度的美味牛肝菌多糖溶液中浸泡lOmin，取出晾干5min后贴在各浓度的平皿培养基上，每个平皿中贴3个。再置于恒温培养箱中，细菌于37°C培养Mh。取出后测量其抑菌圈直径，计算其平均值。其多糖的抗菌性见表1:
本发明的美味牛肝菌多糖的制备方法和用途已通过具体的实施例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明的内容适当改变工艺条件来实现相应的其它目的，都被视为在本发明之内。
本发明美味牛肝菌多糖的测定方法如下
准确称取IOOmg分析纯葡萄糖(预先在105°C烘干到恒重)置于小烧杯中，用少量去离子水溶解后定量转移到IOOml的容量瓶中，以去离子水定容至刻度，摇勻，其浓度为 lmg/ml。吸取该溶液10ml，用去离子水稀释至100ml，即为0. lmg/ml的标准溶液。取标准溶液0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2ml，补水至^iil，加入5%苯酚溶液1ml，混勻，迅速加入浓硫酸5ml，25°C保温25min，冷却后490nm比色，绘制标准曲线。取美味牛肝菌多糖样品，按标准液配制的方法配制样品液，测定吸光度，从标准曲线计算多糖含量。
表1美味牛肝菌多糖对各种菌的抑制作用


本发明公开了一种美味牛肝菌菌体中水溶性活性多糖的制备方法及应用，其制备步骤为其步骤是(1)将美味牛肝菌接种于固体斜面培养基，得到斜面种子；(2)取培养后的斜面接种到一级液体种子培养基中培养；(3)将培养的一级液体种子接种到二级液体种子中培养；(4)将培养的二级液体种子接种发酵；(5)将菌丝体与发酵液分离，得到菌丝体干粉；(6)将菌丝体干粉进行超声浸提，浓缩液体，收集美味牛肝菌多糖粗沉淀物；美味牛肝菌粗多糖沉淀物用水溶解，除去游离的蛋白质，浓缩，用乙醇沉淀，沉淀物干燥得到去蛋白后的美味牛肝菌胞内多糖沉淀物，所述的一种美味牛肝菌水溶性胞内多糖在制备治疗或预防细菌药物中的应用。本发明方法易行，操作简便，低温、短时、高效，制取的多糖具有较好的抗菌性。