检测菌体活细胞的方法及其应用以及引物与试剂盒的制作方法[0002]现有的研究证明，益生菌菌体的死细胞也可在机体中发挥益生功能，但是死细胞不能在胃肠道中定植，一段时间后会随着排泄物被排出体外；而菌体活细胞可定植于胃肠道中并源源不断的分泌益生因子，从而能够对机体发挥更好的益生效果，因此，对益生菌菌体的活细胞的检测尤为重要。[0003]在现有的技术中，一般采用平板计数法检测菌体活细胞数，但是平板计数法操作繁琐且持续时间长，不能快速获得检测结果。而且对于含有多种菌体的样品(如肠道内容物)来说，根本很难利用平板计数法实现特定菌体活细胞的计数。[0004]随着分子生物学的发展，检测技术也得到了突飞猛进的发展，近些年发展起来的分子生物学方法如特异性引物设计技术、杂交探针技术、PCR-ELISA技术、16S RNA技术、TGGE/DGGE技术、RAPD技术和FISH技术，这些技术的发展实现了含有多种菌体的样品特定菌体的定性和定量检测，但是这些方法只能检测样品中特定菌体的总数量，均难以实现特定菌体的活细胞计数。[0005]叠氮溴化丙锭(PMA)和叠氮溴化乙锭(EMA)是两种对DNA和RNA具有高度亲和力的光敏染料。PMA和EMA可选择性的进入细胞膜破损的非活性细胞内部，并与非活性细胞的DNA共价结合，在强光的照射下通过叠`氮基团与DNA进一步形成牢固的共价结合，从而抑制其PCR反应，由于PMA和EMA会被阻隔在活性菌体的完整细胞膜之外，使得定量PCR(qPCR)只能检测到细胞壁完整的活菌体，而细胞壁不完整的非活性细胞菌体则无法检测到。以上过程均完成于DNA提取之前，未与DNA结合的游离PMA和EMA在强光的照射下与水分子反应从而被除去，对后续的PCR和DNA测定不会造成影响，最后利用qPCR完成对细菌活细胞的检测。因此，PMA和EMA与qPCR的结合可以成为对活细胞量化分析强有力的工具。然而Nocker等(2006)通过对李斯特菌的研究发现，EMA具有较强的细胞毒性，因而会在很大程度上影响检测结果，所以EMA并不是理想的检测材料；而PMA对各种菌体活细胞的毒害作用及其使用浓度缺乏理论基础，尚待进一步研究。[0006]长双歧杆菌BBMN68 菌株(Bifidobacterium longum subsp.longum BBMN68)分离自长寿老人的粪便中，是一株具有良好益生功能的的益生菌，研究发现，该菌株具有良好的耐酸耐胆盐性能、良好遗传稳定性、对机体安全无毒害作用、提高巨噬细胞的吞噬作用、促进小鼠胃肠道消化吸收功能、增强小鼠肠道免疫屏障、调节机体免疫系统、延缓秀丽线虫的衰老等功能，可以看出该菌株对人体健康有着重要的意义，所以研究检测该菌株的菌体活细胞的检测方法特别是试剂盒具有重要的价值。
[0007]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测待测样品中菌体的活细胞的方法及其应用以及引物与试剂盒。[0008]为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种检测待测样品中的菌体的活细胞的方法及其在检测肠道内容物的菌体活细胞数中的应用，所述待测样品为含有或不含有上述菌体的活细胞的悬浊液，其特征在于，该方法包括以下步骤:
[0009](I)将所述待测样品与PMA接触，相对于每ml的所述待测样品，PMA的用量为65-75 μ g，优选为68-72 μ g，所述接触包括依次进行暗处理和光处理；对接触后的产物进行提取DNA的操作，得到DNA样品；
[0010](2)在能特异性地使所述菌体的DNA得到扩增的条件下，对所述DNA样品进行PCR扩增的操作，获得扩增产品；
[0011](3)根据所述扩增产品中菌体DNA的扩增产物的量判断待测样品中菌体活细胞的数量，其中，所述菌体DNA的扩增产物的量越多，则指示待测样品中菌体活细胞的数量越多。
[0012]另一方面，本发明提供一种引物，其特征在于，该引物包括SEQ ID N0:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。
[0013]再一方面，本发明提供一种检测待测样品中的菌体的试剂盒，该试剂盒包括PCR扩增试剂和引物，其特征在于，所述菌体为长双歧杆菌BBMN68菌株(Bifidobacteriumlongum subsp.longum BBMN68),该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年11月26日，保藏号为CGMCC N0.2265，所述引物包括SEQ IDNO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。
[0014]通过上述技术方案，实现了菌体活细胞的定性定量检测，且本发明的检测方法特异性强，检测结果误差小。另外，本发明提供的引物和试剂盒能够用于特异地检测长双歧杆菌BBMN68菌株，为长双歧杆菌BBMN68菌株的进一步研究提供了技术支持。
[0015]本发明的其他特征和优点将在随后的
【具体实施方式】
[0016]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0017]在本发明中，“lux”即勒克斯，为光照强度的单位，光照强度指光照的强弱，以单位面积上所接受可见光的能量来量度。
[0018]本发明提供了一种检测待测样品中的菌体的活细胞的方法，所述待测样品为含有或不含有上述菌体的活细胞的悬浊液，其特征在于，该方法包括以下步骤:
[0019](1)将所述待测样品与PMA接触，相对于每ml的所述待测样品，PMA的用量为65-75 μ g，优选为68-72 μ g，所述接触包括依次进行暗处理和光处理；对接触后的产物进行提取DNA的操作，得到DNA样品；
[0020](2)在能特异性地使所述菌体的DNA得到扩增的条件下，对所述DNA样品进行PCR扩增的操作，获得扩增产品；
[0021](3)根据所述扩增产品中菌体DNA的扩增产物的量判断待测样品中菌体活细胞的数量，其中，所述菌体DNA的扩增产物的量越多，则指示待测样品中菌体活细胞的数量越多。
[0022]本发明的发明人发现，步骤(1)中，当PMA的用量在上述65-75 μ g范围内时，PMA不会对菌体活细胞产生毒害作用，且能够获得精准的检测结果；而当PM的用量在上述优选的68-72 μ g范围内时，能够获得更加精准的检测结果。
[0023]根据本发明，步骤(1)中，所述暗处理使得PMA能够与非活性细胞(死细胞)中的DNA或裸露的DNA充分结合；所述光处理使得未与DNA结合的游离PMA与水分子反应从而将游离的PMA除去。因此，所述暗处理的条件可以在较宽范围内选择，只要使待测样品中非活性细胞中的DNA与PMA结合即可，优选情况下，所述暗处理的条件包括光照强度在0.01 Iux以下、温度为20-30°C和时间为2-10min ;进一步优选包括光照强度在0.0Ollux以下、温度为25-30°C和时间为4-8min。同样地，所述光处理的条件可以在较宽范围内选择，只要使得未与DNA结合的游离PMA与水分子反应从而将其除去即可，优选情况下，所述光处理的条件包括光照强度为5 X IO3-L 01 X 104lux、温度为0_10°C和时间为2_6min，进一步优选包括光照强度为6.2父103-8.8父10311?、温度为0_5°C和时间为3_5min。
[0024]根据本发明，步骤(1)中，对所述提取DNA的方法的没有特别限定，可以参照现有技术进行，例如，可以直接参照检测时所使用DNA提取试剂盒的说明书进行，也可以按照《植物基因工程》(何光源著，科学出版社，2007年出版)中所述的方法进行。
[0025]根据本发明，步骤(2)中，对所述DNA样品进行PCR扩增的操作的条件可以在较宽条件下进行，只要能特异性地使所述`菌体的DNA得到扩增即可。本领域技术人员可以理解的是，此处“特异性地”指的是仅能使要检测的菌体的DNA扩增的特定条件，而为了实现要检测的菌体的DNA特异性地扩增，可以通过选择特定的引物实现，例如，如果要检测待测样品中大肠杆菌的活细胞数，则应当选择只能特异性地扩增大肠杆菌的DNA的引物来进行PCR扩增操作。
[0026]根据本发明，所述方法可以用于检测各种待测样品中各种特定的菌体的活细胞，如上所述，只要选择合适地引物即可。在优选情况下，本发明的方法特别适用于长双歧杆菌的检测，因此优选所述菌体为长双歧杆菌，更优选地，所述菌体为长双歧杆菌BBMN68菌株(Bifidobacterium longum subsp.longum BBMN68),该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.2265。
[0027]本发明的发明人经过研究发现，当所述PCR扩增所使用的引物包括SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID N0:2所示的反向引物时，能够特异地检测上述保藏号为CGMCCN0.2265的菌株，因此优选所述PCR扩增所使用的引物包括SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物。
[0028]根据本发明，只要将所述待测样品制备成悬浊液的形式进行检测即可实现本发明的目的，对制备悬浊液的方法没有特别限定，可以使用常规使用的各种方法例如稀释或浓缩，所述制备悬浊液的方法为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。优选情况下，所述待测样品中菌体的活细胞的量在103-101(lCFU/ml范围内，在该优选情况下，检测结果更加准确。
[0029]根据本发明，步骤(3)中，所述扩增产品中菌体DNA的扩增产物的量可以通过现有的各种方法测定，且根据不同的需求可以设计不同的方法。例如，如果只是想粗略地检测待测样品中菌体的活细胞数，可以通过将菌体DNA的扩增产品进行琼脂糖凝胶电泳，然后观察条带的粗细来判断；为了获得较精确的数据，优选情况下，可以通过实时荧光定量PCR并绘制标准曲线并计算获得，标准曲线的绘制可以参照《分子克隆实验指南(上册)》(Sambrook, J等编著，黄培堂等译，科学出版社，2002年8月出版)，例如，还可以将具有不同菌体的活细胞数的标准品(104CFU/ml、105CFU/ml、106CFU/ml、107CFU/ml、108CFU/ml、109CFU/ml)分别按照以上描述的方法进行实时荧光定量PCR检测，参照实时荧光定量PCR试剂(DRR081A，购自宝生物工程有限公司)的说明书中的方法，得到循环数(Ct值)，根据结果绘制活细胞数与循环数(Ct值)的标准曲线，将待测样品测得的Ct值代入根据标准曲线所得的线性方程，从而得到待测样品中菌体的活细胞数。
[0030]本发明提供了一种引物，该引物包括SEQ ID N0:1所示的正向引物和SEQID N0:2所示的反向引物。本发明的引物可以特异性地扩增长双歧杆菌BBMN68菌株(Bifidobacterium longum subsp.longum BBMN68)的 DNA。已知序列的引物的制备方法为本领域技术人员所公知，例如可以委托专门的公司(如Invitrogen公司)合成得到,故在此不再赘述。
[0031]本发明提供了一种检测待测样品中的菌体的试剂盒，该试剂盒包括PCR扩增试剂和引物，其特征在于，所述菌体为长双歧杆菌BBMN68菌株(Bifidobacterium longumsubsp.longum BBMN68),该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.2265，所述引物包括SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID N0:2所示的反向引物。
[0032]本发明中，只要所述引物为上述引物即可实现本发明的目的，PCR扩增试剂是指能使引物和模板发生PCR扩增所用的常规的试剂，对所述PCR扩增试剂没有特殊限定，例如，所述PCR扩增试剂可以包括PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs，且在所述PCR扩增试剂中，以上各物质的种类和浓度为本领域常规使用的种类和浓度，且均可以通过商购获得。
[0033]本发明中，考虑到进行PCR扩增之前还需要进行DNA的提取操作，优选情况下，所述试剂盒还包括PMA和DNA提取试剂。所述DNA提取试剂可以为本领域常规使用的各种用于提取DNA的试剂，例如可以包括Tris-SDS、Tris-饱和酚、酚/仿/异丙醇(25:24:1)、RNase、异丙醇和乙酸钠等。另外，上述各个DNA提取试剂的浓度也可以为本领域常规使用的浓度。
[0034]本发明还提供了上述方法在检测肠道内容物的菌体活细胞数中的应用。将本发明的方法用于检测肠道内容物的菌体活细胞数时，误差小，且方便快捷。所述肠道内容物可以为人或动物的排泄物即粪便，也可以为直接从人或动物胃肠道中取出的物质。
[0035]以下将通过测试例和实施例对本发明进行详细描述。以下测试例或实施例中，DNA提取所使用的试剂盒为细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号为DP302-02)，提取DNA的方法参照试剂盒说明书；所用引物均由Invitrogen公司合成；突光定量PCR试剂(购自宝生物工程有限公司，货号为DRR081A)。
[0036]所用的菌株来源如下:长双歧杆菌BBMN68菌株取自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.2265，该菌株已经由CN101649303A公开；长双歧杆菌Mitsuoka IV-9购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(中心保藏编号为CICC6201)；动物双歧杆菌 BB12 (Bifidobacterium animal is subsp.Lactis)购自科汉森公司。[0037]测试例I
[0038]本测试例用来说明本发明的引物可以特异地扩增长双歧杆菌BBMN68菌株的DNA。
[0039]分别提取长双歧杆菌BBMN68菌株、长双歧杆菌Mitsuoka IV-9菌株和动物双歧杆菌BB12菌株(菌株细胞总量均为IO9CFU)的DNA，得到DNA样品100 μ L，取DNA样品I μ L(以干重计)、引物(由SEQ ID NO:1所示的正向引物和SEQ ID NO:2所示的反向引物等重量混合得到)共IOpmol、DNA聚合酶预混液(ΚΡ201-12，天根生化科技(北京)有限公司)10 μ L和H2O 8 μ L放入PCR仪中进行PCR，控制PCR条件为:94°C预变性3min，然后进行94°C变性308，601:退火88，721:延伸20s的30次循环，72°C延伸5min。
[0040]将PCR获得的扩增产品分别进行琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶电泳的结果可以看出:长双歧杆菌BBMN68菌株的DNA对应的PCR扩增产品有明显的条带，而长双歧杆菌Mitsuoka IV-9菌株和动物双歧杆菌BB12菌株的DNA对应的PCR扩增产品没有明显的条带。
[0041]从以上结果可以看出，本发明的引物可以特异性地扩增长双歧杆菌BBMN68菌株的 DNA。
[0042]实施例1
[0043](I)将培养上述三个菌株获得的培养液分别稀释成不同浓度(如下表1所示)的悬浊液进行平板计数。其中，所用培养基为MRS液体培养基(成分为10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母浸粉、10g/L的牛肉膏、20g/L的葡萄糖、0.5g/L的半胱氨酸盐酸盐、0.lg/L的吐温-80、
0.58g/L的七水硫酸镁、2g/L的柠檬酸氢二铵、0.25g/L的一水硫酸锰、5g/L的乙酸钠，2g/L的无水磷酸氢二钾，且pH值为6.3 `;购自北京奥博星生物技术有限公司)；菌株的培养条件包括:接种量为1% (IO7CFU/ m I)、温度为37°C、pH值为6.5、培养时间为12h (厌氧静置培养)；稀释所用的稀释液为厌氧稀释液(成分为4.5g/L的KH2PO4,6.0g/L的Na2HPO4.12H20，
0.5g/L的半胱氨酸盐酸盐，0.5g/L的吐温-80，且pH值为7.5);平板计数的方法参照《微生物实验教程》(咸洪泉、郭立忠，高等教育出版社，2010年出版)进行。
[0044](2)对获得的各个稀释度的悬浊液(均取Iml)进行提取DNA的操作，得到各个稀释度的悬浊液的DNA样品，其中各个稀释度的悬浊液提取的DNA样品的总体积相等，均为100μ L ；
[0045](3)将上述得到的DNA样品lyL、引物(如下表1所示，正向引物与反向引物等量混合)共IOpmol、荧光定量PCR试剂(添加量参照其说明书)和H2O 7.6 μ L放入实时荧光定量PCR仪(ABI PRISM 7000，英国Techne公司)中进行PCR，控制PCR条件为:94°C预变性3min，94°C变性30s，65°C退火8s，72°C延伸20s的35次循环，72°C延伸5min，获得各个稀释度悬浊液中菌体DNA的扩增产品并得到Ct值(Ct值为扩增产物的荧光强度达到所设定的阈值(本发明中所设定的阈值相同，均以最大荧光强度的10%为阈值)时PCR反应所进行的循环，通过与扩增仪连接的电脑软件中的自动读数得到)；
[0046](4)以Ct值为横坐标，菌体的活细胞数为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线方程如表1中所示。
[0047]表1
[0048]