用于红细胞灭活过程的改进的猝灭方法[0001]本申请是申请号为200580045313.8、申请日为2005年10月31日、发明名称为“用于红细胞灭活过程的改进的猝灭方法”的中国发明专利申请的分案申请。[0002]相关申请的交叉参考[0003]本申请要求2004年10月29日提交的美国临时申请顺序号60 / 623，177的优先权利益，将该文献完整地引入本文作为参考。发明领域[0004]本发明的领域涉及使用于处理血液制品的反应性亲电子化合物猝灭以使可能的病原体污染物灭活的方法。特别地，将亲核化合物，诸如硫醇类，用于使红细胞组合物中的反应性亲电子化合物猝灭。[0005]发明背景[0006]通过血液制品和其它生物材料传播疾病仍然是严重的健康问题。尽管在供血者筛选和血液检测方面已经取得了显著进展，但是诸如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人免疫缺陷病毒(HIV)这类病毒在检测过程中因病毒或病毒抗体低水平而仍然可能逃脱血液制品中的检测。除病毒的危害外，目前还没有在指定用于输血的血液中用于检测非病毒微生物，诸如细菌或原生动物存在的足够的经许可的试验。迄今未知病原体可能在供血中很普遍并且呈 现疾病传播的威胁的风险仍然存在，正如在识别HIV通过输血传播的风险前实际发生的。[0007]已经将化学物质导入血液或血浆以便使病原体灭活，此后临床应用该血液制品。一般，对几乎没有或无红细胞内含物的血液制品而言，诸如血小板和血浆，使用光化学活化的化合物诸如补骨脂素。就含有红细胞的血液制品而言，已经研发了无需光活化的用于病原体灭活的化合物。这些化合物一般具有与病原体，更具体地说是与病原体核酸反应的亲电子基团。例如，美国专利US5，055，485中描述了使用芳基二醇环氧化物使细胞中的病毒和含有蛋白质的组合物失活。可以使用原位产生亲电子试剂的其它化合物。LoGrippo等评价了芥子CH3-N(CH2CH2Cl)2在病毒灭活中的应用。LoGrippo 等,Proceedings of the SixthCongress of the International Society of Blood Transfusion, Biblio theca Haemato logica(Hollander, ed.)，1958，pp.225-230。更有意义的是，美国专利 US6, 410，219 和US5, 691, 132中描述了具有核酸祀向成分以及与该核酸反应的未电子成分的化合物在使病原体灭活中的应用，将这些文献披露的内容引入本文作为参考。美国专利US6，514，987中描述了类似的化合物，其中该化合物中核酸靶向成分通过可水解连接基与反应性亲电子成分连接，将该文献披露的内容引入本文作为参考。美国专利US6，136，586和US6，617，157中描述了使用乙烯亚胺寡聚体和相关化合物使病原体灭活，将这些文献披露的内容引入本文作为参考。这些乙烯亚胺衍生的化合物一般具有提供反应性亲电子成分的氮丙啶基团和提供化合物的核酸靶向的多胺成分。一般类别的带有与核酸反应的亲电子或类似基团的靶向核酸的化合物用于使血液、血液制品和各种生物来源样品中的病原体灭活。
[0008]在一定程度上关注的是，尽管设计这些化合物与核酸特异性地反应，但是它们仍然可能与血液中的其它成分反应，诸如蛋白质或细胞膜。这些副反应是不利的，并且可能导致不良作用，诸如可以由免疫系统识别的蛋白质修饰和细胞膜改变。当反复使用这类经处理的血液制品时，它们可能使受血者对经处理的血液制品产生免疫反应。美国专利US6, 709，810中描述了使这类灭活病原体的化合物猝灭以便降低任何这类不良副反应的水平的方法，将该文献披露的内容引入本文作为参考。然而，尽管这类方法显著地减少了不需要的副反应，但是进一步减少不需要的免疫反应是需要的。使用这类化合物处理红细胞的近期临床试验已经显示出了这类不良事件的可能性。在V.1.Techno logies, Inc.于2003年11月17日发表的新闻稿中，介绍了他们的用于红细胞的I NACTINETM病原体减少系统(Pathogen Reduct ion System)的III期长期试验因涉及对INACTINE?处理的红细胞的抗体反应而被停止。在Cerus Corporation于2003年9月4日发表的新闻稿中，指出了在两位研究患者对用S-303处理的红细胞产生抗体后，他们自愿停止其病原体灭活的红细胞程序的III期试验，所述S-303是用于其红细胞病原体灭活系统的化合物。一般使用间接抗球蛋白试验检测这类抗体，所述的间接抗球蛋白试验可以在没有对实际抗体性质或同质性的详细了解的情况下进行。这类测定法本领域技术人员众所周知的且非常灵敏，从而能够检测低至每个RBC中500个分子。检测这些抗体的最常用方法是通过将患者血清与为输注用候选物的RBC制品混合并且检测凝集反应是否发生来进行的。这称作RBC单位与患者血清的交叉配血。通过包含与抗体交叉反应的抗-人免疫球蛋白提供更高的灵敏度。这提高了 RBC表面上IgG或其它抗体之间的反应性。最终，可以通过在反应介质中包含增强抗体彼此之间的on-rate的增效剂而获得甚至更高的检测灵敏度(AABB手册第13版)。例如，这类测定法比例如流式细胞计量测定法更为灵敏并且甚至可以在其它方法显示不存在任何潜在抗体时观察到。这类现象发生在临床试验中并且常常与可能具有较高的产生这些抗体的趋势的特殊患者群体相关。
[0009]因此，对进一步减少通过亲电子基团与病原体反应的灭活病原体的化合物的不需要的亲电子副反应，同时保持灭活病原体的化合物灭活有害病原体的能力的方法存在需求。具体地，对使红细胞 中灭活病原体的化合物猝灭的改进方法存在需求。需要这种新方法显著降低因用灭活病原体的化合物处理而对红细胞产生不良免疫反应的风险。
[0010]发明概述
[0011]本发明提供了在使灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的副反应猝灭的改善条件下用灭活病原体的化合物处理红细胞组合物的各种方法。在某些实施方案中，通过调节pH和/或增加猝灭剂浓度来改善猝灭。
[0012]本发明在一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括:a)提供:i)包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；ii)包含巯基的猝灭剂；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；和b)混合灭活病原体的化合物和猝灭剂与包含红细胞的组合物，其中所得混合物在适合于使灭活病原体的化合物与红细胞结合充分猝灭的PH范围内。在另一个实施方案中，该方法包括步骤c)调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，该处理导致至少llog,也可以至少21og或至少31og的病原体污染物灭活。在某些实施方案中，红细胞组合物含有白细胞，并且所述的处理导致至少llog，也可以至少21og或至少31og的白细胞灭活。在某些实施方案中，将猝灭剂与包含红细胞的组合物混合，此后添加灭活病原体的化合物。在某些实施方案中，调节包含红细胞的组合物的pH，此后与灭活病原体的化合物和猝灭剂混合。在某些实施方案中，在添加灭活病原体的化合物后调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，通过添加猝灭剂调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，猝灭剂、灭活病原体的化合物和包含红细胞的组合物的混合物在室温下就具有约6.8-8.5的pH，也可具有约7.0-8.5，也可具有约7.2-8.5或约7.2-8.0的pH。在某些实施方案中，将猝灭剂、灭活病原体的化合物和包含红细胞的组合物的混合物孵育适当的时间间隔，诸如约30分钟-48小时，也可以约2-24小时，也可以约8-24小时。在另一个实施方案中，所述的孵育在约1°C -30°C，也可以在约18°C -25°C的温度范围内或在约室温下。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，则猝灭剂的浓度在约2mM-约40mM，也可以在约4mM_约40mM，也可以在约4mM-约30mM，也可以在约5mM_约30mM，也可以约IOmM-约30mM的范围内，也可以为约20禮。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，则一旦混合了三种成分，则猝灭剂在所得混合物中的浓度大于约2mM,至少约4mM,至少约5mM,至少约IOmM或至少约15mM。在某些实施方案中，一旦混合了三种成分，则猝灭剂与灭活病原体的化合物的摩尔比为约10: 1-约400: 1，也可以为约10: 1-约200: 1，也可以为约20: 1-约200: 1，也可以为约50: 1-约200: 1，也可以为约100: I。在某些实施方案中，猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在某些实施方案中，猝灭剂为包含至少一种半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的肽。在一个优选的实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽。在某些实施方案中，中和猝灭剂并且添加中和的猝灭剂以调节红细胞组合物的pH。在某些实施方案中，中和的猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在某些实施方案中，中和的猝灭剂为包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的肽。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物包含核酸结合基团。在某些实施方案中，核酸结合基团为嵌入剂，诸如吖啶基。在某些实施方案中，核酸结合基团为多胺。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物包含通过可水解键与反应性亲电子基团连接的核酸结合基团。在某些实施方案中，核酸结合基团为嵌入剂且反应性亲电子基团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。在一个优选的实施方案中，猝灭剂为中和的谷胱甘肽，其中用约2当量的合适的碱中和质 子化的谷胱甘肽，并且灭活病原体的化合物为β -丙氨酸、Ν-(吖唳_9_基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。
[0013]本发明在一个另外的方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括:a)提供:i)包含核酸结合基团和反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；ii)包含半胱氨酸或合适的半胱氨酸衍生物的猝灭剂；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性山)混合猝灭剂与包含红细胞的组合物，其中添加猝灭剂将该混合物的pH调节至合适的pH ;和c)混合灭活病原体的化合物与包含红细胞的组合物,其中病原体如果存在于包含红细胞的组合物中，那么它被灭活至少llog，也可以至少21og，也可以至少31og。在某些实施方案中，所述的红细胞组合物含有白细胞，并且所述的处理导致至少llog，也可以至少21og或至少31og的白细胞被灭活。在某些实施方案中，将猝灭剂在与灭活病原体的化合物混合前与包含红细胞的组合物混合。在某些实施方案中，将猝灭剂在与灭活病原体的化合物混合后与包含红细胞的组合物混合。在某些实施方案中，将猝灭剂和灭活病原体的化合物与包含红细胞的组合物同时或基本上同时，诸如彼此在约I分钟内混合。在某些实施方案中，将猝灭剂和包含红细胞的组合物的混合物孵育约1-30分钟，此后与灭活病原体的化合物混合。在某些实施方案中，所述的孵育在约1°C -30°C，也可以在约18°C _25°C温度范围内或在约室温下。在某些实施方案中，将猝灭剂、灭活病原体的化合物和包含红细胞的组合物的混合物孵育适当的时间间隔，诸如约30分钟-48小时，也可以约2-24小时，也可以约8-24小时。在另一个实施方案中，所述的孵育在约1°C _30°C，也可以在约18°C _25°C的温度范围内或在约室温下。在某些实施方案中，在将猝灭剂与包含红细胞的组合物混合时适当的PH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或约7.2-8.0的范围内，如在室温下测定的。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，那么该混合物的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或约7.2-8.0的范围内，如在室温下测定的。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，那么猝灭剂的浓度在约2mM-约40mM，也可以在约4mM_约40mM，也可以在约4mM_约30mM，也可以在约5mM-约30mM，也可以在约IOmM-约30mM的范围内，也可以为约20mM。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，那么猝灭剂与灭活病原体的化合物的摩尔比为约10: 1-约400: 1，也可以为约10: 1-约200: 1，也可以为约20: 1-约200: 1，也可以为约50: 1-约200: 1，也可以为约100: I。在某些实施方案中，猝灭剂为包含至少一种半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的肽。在一个优选的实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽。在某些实施方案中，猝灭剂被中和或呈对组合物的PH进行所需调节的形式。在某些实施方案中，通过向猝灭剂中添加I当量，也可以约为2当量的碱中和猝灭剂。在某些实施方案中，猝灭剂呈中和的形式，诸如合适的盐。在某些实施方案中，猝灭剂被中和。在某些实施方案中，中和的猝灭剂为包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的中和的肽。在一个优选的实施方案中，
[0014]中和的肽为中和的谷胱甘肽。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物的核酸结合基团为嵌入剂，诸如吖啶基。在某些实施方案中，核酸结合基团为多胺。在某些实施方案中，核酸结合基团通过可水解的键与反应性亲电子基团连接。在某些实施方案中，核酸结合基团为嵌入剂并且反应性亲电子基团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。在某些实施方案中，核酸结合基团为 多胺并且亲电子基团为吖啶基或吖丙啶?基。在一个优选的实施方案中，猝灭剂为中和的谷胱甘肽并且灭活病原体的化合物为β -丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。
[0015]本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括下列顺序的步骤:
a)提供:i) β -丙氨酸、Ν-( Π丫卩定-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯；ii)中和的谷胱甘肽；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；b)将中和的谷胱甘肽与包含红细胞的组合物混合；c)将该混合物孵育合适的时间间隔；和d)将丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯与中和的谷胱甘肽和包含红细胞的组合物的混合物混合，其中如果病原体存在于包含红细胞的组合物中，那么它被灭活至少llog,也可以至少21og,也可以至少31og。在某些实施方案中，所述的红细胞组合物包含白细胞,并且所述的处理导致至少llog，也可以至少21og或至少31og的白细胞被灭活。在某些实施方案中，将中和的谷胱甘肽作为合适的盐提供。在某些实施方案中，通过用约I当量的碱，也可以约2当量的碱中和质子化的谷胱甘肽提供中和的谷胱甘肽。在某些实施方案中，中和的谷胱甘肽在溶解状态中。在某些实施方案中，中和的谷胱甘肽为固体，诸如冻干粉和合适的盐。在某些实施方案中，用于孵育与谷胱甘肽混合的红细胞的时间间隔为约1-30分钟，也可以为约5-20分钟，其中孵育在约I °C -30°C，也可以在约18°C_25°C范围内的温度下或在约室温下进行。在某些实施方案中，在与β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯混合后，将该混合物孵育合适的时间间隔，诸如约30分钟-48小时，也可以约2-24小时，也可以约8-24小时。在另一个实施方案中，孵育在约1°C -30°C，也可以在约18°C -25°C的温度范围内或在约室温下进行。在某些实施方案中，在混合丙氨酸、Ν-(吖啶-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯时，谷胱甘肽在混合物中的浓度在约5mM-约30mM的范围内，并且β-丙氨酸、N_(吖啶_9_基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯的浓度在约0.05mM-约0.5mM的范围内。在某些实施方案中，在混合β -丙氨酸、Ν-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯时，谷胱甘肽在混合物中的浓度在约IOmM-约30mM的范围内，并且β -丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯的浓度在约0.05mM-约0.3mM的范围内。在某些实施方案中，在混合β -丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯时，谷胱甘肽在混合物中的浓度为约20mM，并且3-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯的浓度为约0.2mM。
[0016]本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括:(a)提供:i)包含为或形成反应性亲电子基团的官能团的灭活病原体的化合物；ii)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与灭活病原体的化合物的反应性亲电子基团反应；和iii)包含红细胞的组网，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；和(b)将灭活病原体的化合物和猝灭剂与包含红细胞的组合物混合，其中猝灭剂在所得混合物中的浓度大于2mM，其中所得混合物在室温下的pH在约6.7或6.7以上的范围内。在某些实施方案中，所得混合物在室温下的pH在约7.0-8.5的范围内。
[0017]本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括:将下列成分与红细胞组合物混合:(a)灭活病原体的化合物，其中灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或形成能够与核酸反应的亲电子基团的官能团；(b)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与亲电子基团反应 ；和(C)与不含碱的混合物相比，降低包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物、猝灭剂和碱的混合物中灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应水平的足量的合适的碱。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应是灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。
[0018]本发明在另一个实施方案中提供了处理红细胞组合物的方法，包括将下列成分与红细胞组合物混合:(a)灭活病原体的化合物，其中灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或形成能够与核酸反应的亲电子基团的官能团；(b)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与亲电子基团反应；和(C)与不含碱的混合物相比，增加包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物、猝灭剂和碱的混合物的pH的足量的合适的碱。在某些实施方案中(例如在某些实施方案中，其中猝灭剂为酸性化合物)，加入足量的合适的碱以便将混合物的PH增加到至少约为不含碱或猝灭剂的混合物的PH。
[0019]本发明在一个另外的方面中提供了在有猝灭剂存在下在用灭活病原体的化合物处理包含红细胞的组合物的过程中改善灭活病原体的化合物与红细胞不需要的副反应的猝灭的方法，其中猝灭剂包含巯基，并且其中灭活病原体的化合物包含为或形成与猝灭剂的巯基反应的亲电子试剂的官能团，其中该方法包括增加包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物和猝灭剂的反应混合物的pH。在某些实施方案中，该方法进一步包括增加猝灭剂在反应混合物中的浓度的步骤。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应为灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。
[0020]在上述方法各自的某些实施方案以及本文所述的其它方法中，该方法进一步包括降低灭活病原体的化合物在混合物中的浓度的步骤。
[0021]在上述方法各自的某些实施方案以及本文所述的其它方法中，在离体条件下处理所述的红细胞组合物。在上述方法各自的某些实施方案以及本文所述的其它方法中，在体外处理所述的红细胞组合物。
[0022]还提供了通过上述各方法以及本文所述的其它方法生产的红细胞组合物。
[0023]本发明在另一个方面中提供了试剂盒，诸如用于处理红细胞组合物的一次性试剂盒。这些试剂盒可以用于人工操作、自动化操作或人工和自动化操作。在某些实施方案中，该试剂盒包括:包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物，包括其任何盐；包含巯基的猝灭剂，包括其任何盐；和I或2当量的合适的碱，其中当量意指与试剂盒中猝灭剂的摩尔量相当的摩尔量。在一个优选的实施方案中，该试剂盒包含:丙氨酸、Ν-(吖啶-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯，包括其任何盐；谷胱甘肽，包括其任何盐；和I或2当量的合适的碱，其中当量意指与试剂盒中谷胱甘肽的摩尔量相当的摩尔量。在某些实施方案中，丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯或其任何盐为固体形式。在某些实施方案中，β _丙氨酸、N-( B丫卩定-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯或其任何盐为溶液形式。在某些实施方案中，谷胱甘肽或任何盐为固体形式。在某些实施方案中，谷胱甘肽或任何盐为溶液形式。在某些实施方案中，I或2当量的碱为固体形式。在某些实施方案中，I或2当量的碱为溶液形式。在某些实施方案中，谷胱甘肽或其任何盐和I或2当量的碱作为混合物存在。在某些实施方案中，谷胱甘肽或其任何盐与I或2当量的碱的混合物为均匀性混合物。在某些实施方案中，该均匀性混合物为固体形式。在某些实施方案中，该均 匀性混合物为溶液形式。在某些实施方案中，所述的试剂盒包含用于溶解为固体形式的@-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯或其任何盐的溶液。在某些实施方案中，所述的试剂盒包含用于溶解为固体形式的谷胱甘肽或其任何盐的溶液。在某些实施方案中，所述的试剂盒包含用于溶解为固体形式的I或2当量的碱的溶液。在某些实施方案中，所述的试剂盒包含用于溶解为固体形式的猝灭剂或其任何盐和I或2当量的碱的溶液。在某些实施方案中，所述的试剂盒包含用于溶解猝灭剂和I或2当量的碱的混合物的溶液。在某些实施方案中，试剂盒中的固体或溶液进一步包括可接受的赋形剂、辅助剂、稀释剂或稳定剂。
[0024]本发明在一个方面中提供了例如用于处理红细胞组合物以灭活病原体的试剂盒，包含:包含核酸结合配体和为或形成亲电子基团的官能团的灭活病原体的化合物(包括其任何盐)；包含巯基的猝灭剂(包括其任何盐)；和至少约I当量的碱，其中当量意指与试剂盒中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，该试剂盒包含约I或约2当量的合适的碱。
[0025]本发明在一个方面中提供了用于处理红细胞组合物以灭活病原体的试剂盒，包含:核酸结合配体和为或形成亲电子基团(例如(PIC-1)的官能团，包括其任何盐；和包含巯基的中和的猝灭剂(例如中和的谷胱甘肽)，包括其任何盐。
[0026]本发明在另一个方面中包括一种组合物，其包含:红细胞；包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；和包含能够与亲电子基团反应的亲核基团的猝灭剂，其中猝灭剂的浓度在约2mM-40mM，也可以在约4mM-40mM，也可以在约5mM-30mM，或在约10mM-30mM的范围内，并且该组合物的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或约
7.2-8.0的范围内。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和包含巯基的猝灭剂。优选的实施方案包括一种组合物，其包含红细胞。0-丙氨酸4-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯和浓度范围在约2mM-40mM的谷胱甘肽，其中该组合物的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5，或约7.2-8.0的范围内。在某些实施方案中，该组合物的红细胞比容在约1-100%，也可以在约10-90%，也可以在约35-80%，或在约40-70%的范围内。在某些实施方案中，3-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯的浓度在约0.05mM-4mM，也可以在约0.05mM-2mM，也可以在约0.05mM-0.5mM,或在约0.1mM-0.3mM的范围内，并且谷胱甘肽的浓度在约5mM-40mM，也可以在约5mM-30mM，或在约10mM-30mM的范围内。
[0027]本发明在一个另外的方面中提供了一种组合物，其包含:红细胞；包含核酸结合配体和反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；和包含能够与亲电子基团反应的巯基的猝灭剂，其中猝灭剂的浓度大于2mM，并且该组合物的pH为约6.7或6.7以上。在某些实施方案中，该组合物具有的PH在约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5和约7.2-8.0的范围内。例如，在某些实施方案中，该组合物的PH在约7.0-8.5的范围内。在某些实施方案中，该组合物包含至少约4mM的猝灭剂或至少约IOmM的猝灭剂。例如，在某些实施方案中，猝灭剂的浓度在约4-40mM或约10-30mM的范围内。例如，在某些实施方案中，猝灭剂的浓度在约4mM-40mM的范围内，并且该组合物的pH在约6.8-8.5的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂的浓度为至少约4mM，并且该组合物的pH在约6.8-8.5的范围内。
[0028]本发明还提供了另外的方面。
[0029]附图简述
[0030]附图1表示在实施例121期反复输血过程中血清抗体滴度。为清楚起见，仅对KLH-吖啶免疫接种显示了误差棒。RBC输注组的误差棒约为±1。
[0031]附图2表示实施例122期的4A、4B和6组中原始S-220RBC的寿命。通过将早期时间点外推至在第O天时的100%确定寿命。I组动物接受生物素化对照RBC。为清楚起见，仅对4A、4B和6组显示了误差棒。
[0032]附图3表示实施例122期的2A、2B和5组中原始S-303 (PIC-1) RBC的寿命。通过将早期时间点外推至在第O天时的100%确定寿命。I组动物接受生物素化对照RBC。为清楚起见，仅对2B和5组显示了误差棒。
[0033]附图4表示实施例122期的4A、4B和6组中修饰的S-220RBC的寿命。通过将早期时间点外推至在第O天时的100%确定寿命。I组动物接受生物素化对照RBC。为清楚起见，仅对1、4B和6组显不了误差棒。
[0034]附图5表示实施例122期的2A、2B和5组中修饰的S-303RBC的寿命。通过将早期时间点外推至在第O天时的100%确定寿命。I组动物接受生物素化对照RBC。为清楚起见，仅对2B和5组显不了误差棒。
[0035]附图6表示S-303处理的RBC的FACScan分析结果。
[0036]发明详述
[0037] 例如，美国专利US6，709，810中提供了使红细胞组合物中反应性亲电子种类猝灭的现存方法。作为这些方法的非限制性实例，将谷胱甘肽与0-丙氨酸、化(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯组合使用(下文也可以称作"灭活病原体的化合物I"、" PIC-1 "或"S-303")。一般将谷胱甘肽以酸性形式分离(即质子化)，并且这种形式被用于这些已知的方法。因而，当提及已知的猝灭方法时，谷胱甘肽被称作酸性或质子化的谷胱甘肽。本文所用的用于灭活红细胞中的病原体的标准条件包括用2mM质子化的谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理红细胞组合物。可以增加质子化谷胱甘肽的浓度，在对不需要的副反应提供较好猝灭的尝试中，使猝灭剂与灭活病原体的化合物之比较高。然而，在质子化谷胱甘肽浓度增加时，红细胞组合物的总体PH因谷胱甘肽的酸性而下降。已经确定这种较低的pH导致不足以粹灭灭活病原体的化合物与红细胞,特别是红细胞表面的反应。还已确定所述的标准条件无法对红细胞表面的修饰提供足够的猝灭。因而，本发明提供了改进的猝灭方法，其中将包含灭活病原体的化合物和猝灭剂的红细胞组合物的PH调节至适当范围以便提供改善的猝灭，其中所用猝灭剂的浓度为大于2mM，诸如为约5-40mM，也可以为约10-30mM，或为约20mM。例如，提供了这样的方法，使得在将包含红细胞的组合物与灭活病原体的化合物和猝灭剂混合时，pH在适当的范围内，诸如pH在约6.8-8.5，也可以在约
7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5，或在约7.2-8.0的范围内，其中猝灭剂的浓度在约5_40mM的范围内。
[0038]在本文所述方法各自的某些实施方案中，减少灭活病原体的化合物与红细胞的不理想的(本文也称作"不需要的")副反应。在某些实施方案中，减少的不理想的副反应为灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。在某些实施方案中，将副反应的水平降低至少约5%，至少约10%，至少约25%，至少约50%，至少约75%或至少约90%。例如，可以通过下列步骤验证副反应的减少(与第二种方法相比):测定对灭活病原体的化合物具有特异性的抗体与处理的红细胞结合的量和/或测定处理的红细胞在体内的寿命，并且将这些测定值与通过第二种不同方法处理的红细胞进行比较。例如，在改进方法的某些实施方案中，与未改进的方法 相比，将抗-灭活病原体的化合物的抗体与处理的红细胞结合的水平降低至少约10%，至少约25%，至少约50%，至少约75%或至少约90%。
[0039]在本文所述本发明各方面各自的某些实施方案中，适合于对灭活病原体的化合物与红细胞结合提供足够猝灭的PH范围为与用2mM质子化谷胱甘肽和0.2mM PIC-1对红细胞组合物进行的标准处理相比对灭活病原体的化合物与红细胞结合提供改善的粹灭的pH范围。在某些实施方案中，根据处理的红细胞与通过标准方法处理的那些红细胞相比的免疫原性降低验证猝灭的改善。在某些实施方案中，根据对灭活病原体的化合物具有特异性的抗体与与处理的红细胞在体外结合的量的减少和/或根据处理的红细胞在体内的寿命增加验证指定方法与标准方法相比提供的猝灭的改善。
[0040]本发明在一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括:a)提供:i)包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；ii)包含巯基的猝灭剂；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；和b)将灭活病原体的化合物和猝灭剂与包含红细胞的组合物混合，其中所得混合物在适合于使灭活病原体的化合物与红细胞结合充分猝灭的PH范围。在某些实施方案中，该方法进一步包括调节包含红细胞的组合物的PH的步骤。在某些实施方案中，在与灭活病原体的化合物和猝灭剂混合前调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，通过添加猝灭剂调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，在向红细胞组合物中添加猝灭剂前用至少约I当量的合适的碱中和猝灭剂。在某些实施方案中，在添加灭活病原体的化合物前将猝灭剂与包含红细胞的组合物混合。在所述方法的某些实施方案中，在室温下合适的pH范围为约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5，或约7.2-8.0。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约2mM_约40mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约4mM-约40mM，约10-约30mM的范围内。在所述方法的某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度为至少约4mM或至少约10mM。在某些实施方案中，用于所述方法的猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。例如，在某些实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽。在某些实施方案中，反应性亲电子基团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物为运-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些实施方案中，所述的处理导致红细胞组合物中至少Ilog的病原体污染物的灭活。
[0041]本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括:(a)提供:i)包含为或形成反应性亲电子基团的官能团的灭活病原体的化合物；ii)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与灭活病原体的化合物的反应性亲电子基团反应；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；和(b)将灭活病原体的化合物和猝灭剂与包含红细胞的组合物混合，其中猝灭剂在所得混合物中的浓度大于2mM，其中所得混合物在室温下的pH在约6.7或6.7以上的范围内。在某些实施方案中，所得混合物在室温下具有的pH为约7.0或7.0以上，或为7.2或7.2以上。在某些实施方案中，所得混合物的pH在约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5或约7.2-8.0的范围内。例如，在某些实施方案中，所得混合物在室温下的pH在约7.0-8.5的范围内。在某些实施方案中，该方法进一步包括下列步骤:(c)调节包含红细胞的组合物的pH，使得所得混合物在室温下的pH在指定的范围内(例如在约7.0-8.5的范围内)。在某些实施方案中，通过将至少约0.5当量，至少约I当量或至少约2当量的碱添加到红细胞组合物中调节包含红细胞的组合物的pH,其中当量意指与混合物 中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，在向红细胞组合物中添加猝灭剂前用至少约I当量的合适的碱中和猝灭剂并且通过添加中和的猝灭剂调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度为至少约4mM或至少约10mM。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度为约4_40mM或约10-30mM。例如，在某些实施方案中，猝灭剂的浓度为至少约4mM，其中所述混合物在室温下具有的PH在约6.8-8.5的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂的浓度在约4-40mM内并且在室温下的pH在约7.2-8.5的范围内。在某些实施方案中，在向红细胞组合物中添加猝灭剂前用至少约I当量的合适的碱中和猝灭剂。在某些实施方案中，在添加灭活病原体的化合物前将猝灭剂与包含红细胞的组合物混合。在某些实施方案中，猝灭剂化合物为酸性。在某些实施方案中，猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。例如，在某些实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽。在某些实施方案中，官能团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物为0-丙氨酸4-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些实施方案中，所述的处理导致红细胞组合物中至少Ilog的病原体污染物的灭活。在某些实施方案中，所述的处理导致红细胞组合物中至少llog，至少约21og或至少约31og的病原体污染物的灭活。
[0042]本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括将下列成分与红细胞组合物混合:(a)灭活病原体的化合物，其中灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或形成能够与核酸反应的亲电子基团的官能团；(b)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与亲电子基团反应；和(C)与不含碱的混合物(即除未加入(C)的碱外包含与第一种混合物相同成分的第二种混合物)相比，降低包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物、猝灭剂和碱的混合物中灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的副反应水平的足量合适的碱。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应为灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物合并之前，同时或之后不超过约I小时，约30分钟，约20分钟，约10分钟，约5分钟，约2分钟或约I分钟将碱和猝灭剂与红细胞组合物合并。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物混合前将碱和猝灭剂与红细胞组合物混合。在某些实施方案中，在将碱或猝灭剂与红细胞组合物混合前将碱和猝灭剂彼此混合。在某些实施方案中，包含猝灭剂的碱式盐不但提供猝灭剂而且提供碱。在某些实施方案中，碱为NaOH。在某些实施方案中，碱为碱性缓冲剂。在某些实施方案中，加入至少约0.5当量，至少约1.0或至少约2当量的碱，其中当量意指与混合物中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，碱包含至少约I当量的碱。在所述方法的某些实施方案中，在室温下合适的PH范围为约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5或约7.2-8.0。在某些实施方案中，所得混合物在室温下具有的pH为约7.0-8.5。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度为大于2mM，大于约4mM或大于约10mM。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约2mM-约40mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约4mM-约40mM，约10-约30mM的范围内。例如，在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约10mM-30mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂为酸性的。在某些实施方案中，猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，诸如谷胱甘肽。在某些实施方案中，官能团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。例如，在某些实施方案中，权利要求14所述的方法中灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些实施方案中，所述的处理导致红细胞组合物中至少Ilog的病原体污染物的灭活。 [0043]本发明在另一个实施方案中提供了处理红细胞组合物的方法，包括将下列成分与红细胞组合物混合:(a)灭活病原体的化合物，其中灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或形成能够与核酸反应的亲电子基团的官能团；(b)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与亲电子基团反应；和(C)与不含碱的混合物(即除未向混合物中加入(C)的碱外包含与第一种混合物相同成分的第二种混合物)相比，增加包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物、猝灭剂和碱的混合物的PH的足量合适的碱。在某些实施方案(例如在某些实施方案中，其中猝灭剂为酸性化合物)中，加入足量的合适的碱以便将混合物的pH增加到至少约为不含碱或猝灭剂的混合物的pH。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物合并之前，同时或之后不超过约I小时，约30分钟，约20分钟，约10分钟，约5分钟，约2分钟或约I分钟将碱和猝灭剂与红细胞组合物合并。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物混合前将碱和猝灭剂与红细胞组合物混合。在某些实施方案中，在将碱或猝灭剂与红细胞组合物混合前将碱和猝灭剂彼此混合。在某些实施方案中，包含猝灭剂的碱式盐不但提供猝灭剂而且提供碱。在某些实施方案中，碱为NaOH。在某些实施方案中，碱为碱性缓冲剂。在某些实施方案中，加入至少约0.5当量，至少约1.0或至少约2当量的碱，其中当量意指与混合物中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，碱包含至少约I当量的碱。在所述方法的某些实施方案中，在室温下合适的PH范围为约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5或约7.2-8.0。在某些实施方案中，所得混合物在室温下具有的pH为约7.0-8.5。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度为大于2mM，大于约4mM或大于约10mM。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约2mM-约40mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约4mM_约40mM,约10-约30mM的范围内。例如，在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约10mM-30mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂为酸性的。在某些实施方案中，猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，诸如谷胱甘肽。在某些实施方案中，官能团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。例如，在某些实施方案中，权利要求14所述的方法中灭活病原体的化合物为@-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些实施方案中，所述的处理导致红细胞组合物中至少Ilog的病原体污染物的灭活。
[0044]本发明在一个另外的方面中提供了在有猝灭剂存在下在用灭活病原体的化合物处理包含红细胞的组合物过程中改善灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的副反应的猝灭的方法，其中猝灭剂包含巯基，并且其中灭活病原体的化合物包含为或形成与猝灭剂的巯基反应的亲电子试剂的官能团，其中该方法包括增加包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物和猝灭剂的反应混合物的pH。在某些实施方案中，该方法进一步包括增加猝灭剂在反应混合物中的浓度的步骤。在某些实施方案中，猝灭剂为酸性的。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应为灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。
[0045]本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括按照下列次序的步骤:a)提供:i) β -丙氨酸、Ν_(卩丫卩定-9-基)、2_[双(2-氯乙基)氨基]乙酯；ii)中和的谷胱甘肽；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；
b)将中和的谷胱甘肽与包含红细胞的组合物混合；c)将该混合物孵育适当的时间间隔；和d)将@-丙氨酸、^(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯与中和的谷胱甘肽和包含红细胞的组合物的混合物混合，其中病原体如果存在于包含红细胞的组合物中，那么被灭活至少llog。在某些实施方案中，中和的谷胱甘肽包含加入了至少约I当量的碱的谷胱甘肽，其中当量意指与猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，中和的谷胱甘肽包含加入了约2当量的碱的谷胱甘肽(例如谷胱甘肽的游离酸)。
[0046]还提供了通过本文所述方法各自生产的红细胞组合物。在某些实施方案中，与通过包括用灭活病原体的化合物处理的其它方法生产的红细胞相比，红细胞组合物包含灭活病原体的化合物对红细胞表面的降低水平的修饰。在某些实施方案中，通过所述方法的处理生产的红细胞组合物包含灭活病原体的化合物的降解产物(例如猝灭剂与灭活病原体的化合物的反应产物)。在某些实施方案中，与通过包括用灭活病原体的化合物处理的另一种方法生产的红细胞组合物 相比,通过本文所述方法的处理生产的红细胞组合物包含处理完成后减少量的包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物。在某些实施方案中，包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物在组合物中的量与通过包括灭活病原体的化合物的另一种方法(例如不向反应混合物中加入猝灭剂和/或碱的方法或在较低pH下处理)处理的组合物相比已经减少了约10 %，约25 %，约50 %，约75 %，约90 %，约95 %或约99%。
[0047]本发明在一个另外的方面中提供了包含红细胞的组合物、包含核酸结合配体和反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物和包含能够与亲电子基团反应的巯基的猝灭剂，其中猝灭剂的浓度为大于2mM，并且组合物的pH在约6.7或6.7以上。在某些实施方案中，组合物具有的PH范围在约6.8-8.5，约7.0-8.5和约7.2-8.0的范围内。在某些实施方案中，组合物包含至少约4mM的猝灭剂或至少约IOmM的猝灭剂。在某些实施方案中，猝灭剂的浓度在约4-40mM或约10-30mM的范围内。例如，在某些实施方案中，猝灭剂的浓度在约4mM-40mM的范围内，并且组合物的pH在约6.8-8.5的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂的浓度为至少约4mM，并且组合物的pH在约6.8-8.5的范围内。
[0048]就包含氨基酸取代基的本文的序列而言，正如本领域技术人员显而易见的，每个氨基酸取代基都可以独立地选择。本发明还提供了包含氨基酸取代基的序列，其中一个或多个氨基酸取代基被消除。
[0049]本发明方法中待灭活的病原体污染物包括能够使人、其它哺乳动物或脊椎动物产生疾病的任何含核酸的病原体。病原体可以为单细胞的或多细胞的。病原体的实例为使人、其它哺乳动物或脊椎动物产生疾病的细菌、病毒、原生动物、真菌、酵母、霉菌和支原体。病原体的遗传物质可以为DNA或RNA并且该遗传物质可以为单链或双链核酸形式。表1中列举了病毒的实例，但它们并不以任何方式来限定本发明。
[0050]表1.病毒的非限制性实例
[0051]