专利名称：灭活的家禽疫苗的制作方法灭活的家禽疫苗本发明涉及用于保护家禽对抗新城疫的药物组合物，其包含免疫量的灭活新城疫病毒和佐剂，涉及免疫原性量的灭活新城疫病毒和佐剂的用途，用于制造用于鸡或火鸡的接种的强化疫苗，以及涉及包含下述容器的成套试剂盒包含用于鸡或火鸡的首次接种的灭活新城疫病毒和佐剂的容器，以及包含用于鸡或火鸡的强化接种的灭活新城疫病毒和佐剂的容器。商业的家禽养殖可以大略分为三个部分产蛋鸡、种鸡和肉仔鸡的生产。肉仔鸡、产蛋鸡和种鸡对于许多病毒、细菌和寄生虫感染都是脆弱的。作为预防措施，它们在生命的早期已经针对许多病毒疾病进行免疫接种。作为绝大多数鸡或火鸡饲养者的标准接种方案的一部分的病毒疫苗之一是新城疫病毒疫苗。新城疫是引起养禽业的很大经济损失、具有广泛地理分布的家禽病毒感染。新城疫病毒(NDV)是这种疾病的病原，是副粘病毒(Paramyxovirus)属的原型病毒。新城疫是复杂的，因为病毒的不同分离物和毒株在疾病的严重性上可能产生巨大的变异。一般地，鸡或火鸡越年轻，疾病越为急性和严重。感染可能通过吸入或者摄食发生，病毒的传染形式从一只禽鸟传播到另一只。如上文提及的，已经鉴定了 NDV的几种致病型，即，强毒型、中毒型和弱毒型。疾病的亲神经的强毒型是由NDV的高度病原性的毒株引起，特征在于严重的呼吸病征和随后的神经病学病征的突然发作。大多数情况下，感染的动物不能存活。亲内脏的强毒NDV毒株是高度病原性的，引起高死亡率和胃肠道中的严重病变。NDV的中毒型毒株通常导致完全敏感的禽鸟中的严重呼吸道疾病，中毒型和强毒型毒株都引起成年禽鸟中产蛋量的显著降低。ND病毒的弱毒型毒株一般引起轻微的疾病，其特征在于呼吸病征，特别是在幼小的完全敏感的禽鸟中。为了降低商业家禽业中由于ND的经济损失，鸡针对ND免疫接种。来自弱毒型和中毒型毒株的活疫苗已经常规地应用，中毒型疫苗仅适合于二次疫苗接种。然而，在弱毒型组中，毒力也有相当大的范围。用作活疫苗的NDV毒株包括V4、Hitchner BI、F、La Sota(弱毒型)和毒株H、Mukteswar、Komarov和Roakin (中毒型)。根据经验，肉仔鸡具有仅1-12周的寿命期。因而，它们主要用活的减毒NDV疫苗来接种。种鸡和肉仔鸡具有显著地更长的寿命期，重要的是在它们的整个寿命期内保护它们对抗传染性疾病。这意味着它们将更多受益于提供早期和持久保护的疫苗。在家禽疫苗接种的早期，活的减毒疫苗是不安全的或是不存在的。因而，在1950年和约1960年间，鸡不得不用灭活的病毒疫苗接种。然而，这样的疫苗在没有任何佐剂，或仅有在当时可用的佐剂的情况下施用，佐剂具有严重的、现今不可接受的副作用。那时没有真正可接受的佐剂。同样地，当前使用的水包油乳剂和油包水乳剂在那时是未知的。然而多年以来，开发了用于家禽保护的安全的活疫苗。活的ND疫苗的主要优点是可以通过便宜的大量施加技术,例如喷雾和饮用水施加来施用。活疫苗进一步具有优点是它们每一剂更便宜，并提供了相对即刻的保护。此外，它们紧密地模拟了自然感染。最后，活的减毒ND疫苗，当通过施加技术例如喷雾和饮用水施加来施用时，提供了除全身性保护之外的良好的局部保护。因而，在现代的家禽业中，活的减毒新城疫疫苗是用于鸡或火鸡的首次接种的疫苗。用活体接种疫苗首次免疫的缺点是，它们的保护不是真正持久的，因而在必要时必需给予活减毒疫苗的第二次、可能第三次接种。 然而，多年来还发现的是，灭活疫苗当在活减毒疫苗的首次接种后作为强化疫苗给予时，具有的优点是它们在用活减毒疫苗首次免疫的鸡或火鸡中提供了更久的持续免疫性。因而，现今第二次接种、所谓的强化接种优选地用灭活疫苗给予。许多年以前，组合活减毒疫苗和灭活疫苗的这种接种方案已经被证明是高效率的(Glisson，J. R.and Kleven, S. Η. 1993 Poultry vaccines. In: Peters, A. R. (Ed. ) , Vaccinesfor Veterinary Applications. Butterworth Heinemann, Oxford, UK, pp. 170-173(1993))。结果，家禽接种中当前的实践是如下的对于新城疫，以及实际上对于许多其他病毒性家禽疾病例如传染性支气管炎，活的减毒病毒疫苗被用作首次接种，而灭活疫苗的强化被用于诱导在用活减毒病毒疫苗首次免疫的禽鸟中的延长的抗体反应。参见，例如，“Vaccination Strategies，，，Glisson, J. R. , in Poultry Digest 第 12-16 页，1999 年12月/2000年I月。Hilgers, L. A. Th.,等人再次强调了当前的标准接种疗法的重要性对于鸡中的例如新城疫和传染性支气管炎，用活疫苗首次接种以及用灭活疫苗强化。在这篇论文中，它们检查了与灭活的强化疫苗一起给予的各种佐剂的效果(Vet. Immunol, andImmunopath. 66:159-171 (1998)。使用活的减毒疫苗的少数缺点之一是，虽然诱导了局部免疫，它们可能引起显著的接种反应，特别是在喷雾接种之后在呼吸道中。这种不可避免的缺点到目前为止一定程度上通过使用非常轻微的/减毒的病毒用于接种，特别是用于在年幼动物中的首次接种来处理。本发明的目的是提供一些方法以可选择的途径解决这个问题。现在令人惊讶地发现的是，通过用灭活疫苗的首次免疫和强化的有效接种是可行的，条件是首次免疫和强化疫苗包含合适的佐剂。再更令人惊讶地发现的是，灭活的NDV疫苗首次免疫/强化方式不仅提供了极好的全身性保护，还提供了气管的保护。这是高度出乎意料，因为灭活疫苗必需通过胃肠外的途径施用，因而完全无法预期气管中局部免疫的诱导。这种令人惊讶的作用的明确优点是，根据这种方式接种的动物几乎不受田间感染，如果有的话，的影响。这对于动物和农户都是有益的。当然最重要的优点是可以完全避免在非常年幼的动物中使用活的减毒病毒涉及的风险。灭活的NDV首次免疫/强化接种方式可以用于肉仔鸡、种鸡和产蛋鸡。对于肉仔鸡，首次免疫接种优选地尽可能早地进行。优选地，首次免疫在I到7天龄之间进行。强化接种在首次免疫之后2到12周之间给予。在高NDV感染压力的地区，第二次接种可以在首次免疫之后2周进行。更标准的接种方案将是在首次免疫和强化之间有4-10周。如上所述，取决于不同国家中使用的生产方法，在许多情况下，肉仔鸡达不到10周龄。因而，优选的接种方式将是以下的强化将在首次免疫之后约4-8周给予，在肉仔鸡在5-6周之后宰杀的情况下，强化将在约4周时给予。在这种情况下首次免疫接种因而将在1-14天之间给予。对于种鸡和蛋鸡，首次免疫接种优选地也在I到7日龄之间给予，强化接种可以在首次免疫之后2到12周给予。在这种情况下，尽管取决于感染压力，强化接种可以推迟直到12周，以将免疫性的持续时间延长数周。然而一般而言，首次免疫和强化之间优选的时间间隔也是4到8周之间。本发明的第一个实施方式因而涉及免疫原性量的灭活新城疫病毒和佐剂用于制 造强化疫苗的用途，所述强化疫苗用于在用所述强化疫苗接种之前2到12周之间已经用首次免疫疫苗接种的鸡或火鸡的接种，所述首次免疫疫苗包含免疫原性量的灭活新城疫病毒和佐剂。新城疫病毒的灭活方法是本领域公知的。例如，用公知的灭活化合物，例如甲醛、β-丙内酯和双乙烯亚胺，可以进行化学灭活。例如，通过加热灭活或通过用X-或Y-辐射、或用UV-光来照射，可以进行物理灭活。疫苗中灭活的NDV抗原的量原则上可以是IO2到IOiq当量的蛋传染剂量(EID50)之间。(当量，由于在疫苗中病毒将被灭活，因而不是蛋传染性的)。然而实际上，IO2 EID50被认为是低剂量，其仅在存在非常强的佐剂的情况下是有效的。IO4到IO8之间的量是优选的剂量。虽然是适合的，IOki EID5tl的剂量从经济角度是不吸引人的。存在着本领域已知的许多佐剂适合于与灭活的NDV组合，例如，氢氧化铝、磷酸铝、皂角苷、植物油例如生育酚和矿物油。非常高效的佐剂是水包油乳剂，特别是油包水乳齐U，进一步也称为水包油佐剂和油包水佐剂。这样的乳剂是本领域公知的。因而，优选地，根据本发明使用的强化疫苗或药物化合物包含油包水佐剂。灭活疫苗的施用途径原则上是胃肠外的途径。施用可以例如肌肉内或皮下进行。这些施用途径以及它们的细节是家禽接种领域公知的。灭活的NDV首免-强化接种方式同样适合于雏鸡和火鸡。本发明的另一个实施方式涉及包含免疫原性量的灭活新城疫病毒和佐剂的药物组合物，用于鸡或火鸡中新城疫的治疗，其中所述治疗包括用包含免疫原性量的灭活新城疫病毒和佐剂的疫苗向所述鸡或火鸡进行首次免疫接种，以及在所述首次免疫接种的2-12周内用包含免疫原性量的灭活新城疫病毒和佐剂的疫苗向所述鸡或火鸡进行强化接种的步骤。优选地，所述首次免疫和/或强化疫苗或药物组合物除了上文定义的NDV成分之外包含来自对家禽为病原性的病毒或微生物的一种或更多种其他抗原，或编码所述抗原的遗传信息。更优选的，所述病毒或微生物选自由传染性支气管炎病毒、传染性囊病(Gumboro)、鸡贫血症病原体、禽类呼肠孤病毒、鸡败血支原W OiycopIasmagalli sep ti cum ) > 火鸡鼻气管炎病毒、副鸡嗜血杆菌(Maemophi Ius paragal I inarum )(Coryza)、鸡痘病毒、禽脑髓炎病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性喉气管炎病毒、火鸡的疱疫病毒、艾美虫属物种、鼻腔鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、多杀巴斯德菌(.Pasteurella mu 11 o c i da)、失节澈支眉、体■ {Myc op I asma)、沙门氏菌属物种和大肠杆菌构成的组。可以制备首次免疫和强化疫苗以及药物组合物，并以悬浮液的形式或以冻干形式来市场化。它们将另外含有通常用于这种活性成分的药学上可接受的载体。载体可以是，或可以包括稳定剂、稀释剂、防腐剂和缓冲剂。适合的稳定剂例如SPGA、碳水化物(例如，奶粉、血清白蛋白或酪蛋白)或其降解产物。适合的缓冲剂例如碱金属磷酸盐。适合的防腐剂为硫柳萊(thimerosal)、乙萊硫代水杨酸钠(merthiolate)和庆大霉素。稀释剂包括水、水性缓冲液((例如缓冲盐水)、醇和多元醇(例如甘油)。优选地，疫苗和药物组合物被冻干，以使得它们更少依赖于冷藏。免疫原性量的NDV是在鸡或火鸡中诱导免疫反应的NDV的量，当与在未免疫禽鸟中用野生型NDV感染之后的病理作用相比时，所述免疫反应降低疾病的病理作用。适合于制备灭活NDV疫苗，更具体地，油-乳剂疫苗的ND病毒毒株包括这样的毒株，如 Clone 30、Ulster 2C、Hitchner BI、La Sota、Roakin 和各种强毒病毒(D. J.Alexander, In Diseases of Poultry, 9th edition 1991，eds. Calnek et al.，IowaState University Press, Ames, Iowa, 496-519)。本发明的另一个实施方式涉及包含下述容器的成套试剂盒包含用于鸡或火鸡的首次免疫接种的灭活新城疫病毒和佐剂的容器，以及包含用于鸡或火鸡的强化接种的灭活新城疫病毒和佐剂的容器。在这点上容器可以是，例如，任何材料的标准的疫苗烧瓶或试管或任何其他物体，在其中可以保存疫苗。实施例实施例I : 这个实验的目的是评估使用在GNE中配制的灭活弱毒型NDV毒株的首次免疫-强化接种策略是否诱导对抗局部给予的活的中毒型NDV毒株Beaudette攻击的局部保护。(GNE是在矿物油基础上的标准油包水乳剂)。I材料和方法 1.1实验的建立 一组3-4周龄SPF白色来亨鸡(组I)置入隔离器中，如表I标明的，用每剂含有大约10~7.7 EID50甲醛灭活的弱毒型NDV毒株的油包水乳剂疫苗在胸部肌肉中两次肌内注射(i.m.)来接种。组2不接种。在实验开始时，首次接种后6周和8周从两个组的所有动物采集血液。首次接种后八周，两个组的鸡用NDV Beaudette通过眼途径攻击。攻击后3、4和7天从口咽和泄殖腔采集两个棉拭，用于病毒重新分 离。攻击后十五天，从两个组的所有动物采集血液。表I :分组和给药本发明涉及包含免疫量的灭活新城疫病毒和佐剂的药物组合物，用于家禽针对新城疫的保护，涉及免疫原性量的灭活新城疫病毒和佐剂用于制造鸡或火鸡接种的强化疫苗的用途，以及涉及包含下述容器的成套试剂盒，包含用于鸡或火鸡的首次免疫接种的灭活新城疫病毒和佐剂的容器，以及包含用于鸡或火鸡的强化接种的灭活新城疫病毒和佐剂的容器。