专利名称：人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的方法角膜上皮干细胞(Limbal Stem Cells, LSCs),即角膜缘干细胞,位于角膜缘上皮基底层，是角膜上皮的唯一细胞来源。角膜上皮干细胞能够进行自我更新，以维持这些干细胞的高度增殖能力。角膜上皮干细胞可以生成短暂扩充细胞，后者向中央角膜移动，最终进入终末分化，形成角膜上皮细胞。角膜上皮干细胞不仅可以分化、增生为上皮细胞，更重要的是角膜上皮干细胞像一道屏障，可以阻止结膜上皮细胞移行至角膜表面，对维持角膜上皮的动态稳定和角膜透明性发挥着极其重要的作用。单眼角膜上皮干细胞缺乏患者，可以采用自体健眼角膜缘组织移植，以及健眼干细胞体外扩增后的移植。对于双眼角膜上皮干细胞缺乏患者，可以采用异体角膜缘移植，但由于异体移植易发生排斥反应，临床效果并不理想。近年来，有研究采用自体口腔粘膜上皮细胞体外扩增后移植，但研究发现，体外培养3-4周的口腔粘膜上皮细胞并不能分化为角膜上皮细胞表型，也不表达眼表面上皮细胞特异性的转录因子PAX6，粘蛋白表达与正常角膜上皮细胞也存在较大差异。移植于眼表面的口腔粘膜上皮细胞在体内也不能分化为角膜上皮细胞表型。术后短期内角膜虽然维持较好的透明度，长期随访发现角膜易产生新生血管。由此可见，角膜上皮重建的理想的细胞来源仍然是自体角膜上皮干细胞，对于双眼干细胞缺乏患者的治疗，仍有待于寻找一种能够分化为正常角膜上皮细胞的“种子细胞”，这也是目前角膜上皮组织工程研究的重点。除了成体干细胞，多能干细胞(pluripotent Stem Cells)包括胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)和诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent StemCells,iPSCs))也被用于在体外诱导产生角膜`上皮干细胞。Homma(人名)等人将鼠胚胎干细胞培养于IV型胶原上，成功诱导出上皮干细胞，并用于修复鼠角膜上皮损伤。Hiroki (人名)等将PAX6基因导入小鼠胚胎干细胞，成功诱导出具有角膜上皮细胞特征的上皮样细胞。最近有研究将人胚胎干细胞培养于IV型胶原上，并用人角膜缘成纤维细胞条件培养基共培养，成功诱导出上皮样细胞，但进一步分化产生的终末分化细胞不但具有角膜上皮表型，还具有皮肤表型。由于胚胎干细胞具有无限增殖潜能，使其成为治疗角膜上皮干细胞缺乏的一种很有潜力的种子细胞来源。但是，胚胎干细胞的分化调控，伦理问题，以及异体移植的排斥反应等问题成为人胚胎干细胞研究的障碍。因此，为角膜干细胞移植找到合适的种子细胞来源，是目前亟待解决的问题。
本发明提供一种快速、简便、高效，而且成本较低的人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的方法，以大量获取角膜上皮干细胞。为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案:—种人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的方法，其包括步骤:A、基于患者的眼表组织，分离人结膜基质成纤维细胞和人结膜上皮细胞；B、在所述成纤维细胞和人结膜上皮细胞导入基因0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4(基因名称)，诱导产生诱导性多能干细胞(iPSCs)；C、在所述 iPSCs 中加入 IV 型胶原、米用 KSFM(Keratinocyte Serum-FreeMedium,KSFM)细胞培养基和 SHEM (Supplement Hormonal EpithelialMedium, SHEM)细胞培养基轮流诱导的方法，对所述诱导性多能干细胞iPSCs向角膜上皮样细胞定向分化。 优选地，在所述步骤A中，采用眼表组织来源的人结膜基质成纤维细胞和人结膜上皮细胞进行诱导性多能干细胞系的建立；优选地，在所述步骤B中，采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、畸胎瘤实验验证分化潜能及基因芯片分析的方法进行细胞系鉴定。优选地，在所述步骤C中，还进行角膜上皮样细胞表型鉴定。通过实施以上技术方案，具有以下技术效果:本发明提供的分化方法快速、简便、高效，而且成本较低，可大量获得角膜上皮干细胞。(I)、碱性磷酸酶染色鉴定iPS细胞的干细胞特性未分化的ES细胞高度表达碱性磷酸酶，因此一般用碱性磷酸酶染色对iPS细胞的干细胞特性进行初步检测。并可根据染色显示的克隆数计算iPS诱导效率。逆转录病毒侵染30天左右,无论是结膜基质成纤维细胞(HumanConjunctival Stromal Fibroblast,HCjSF)及人结膜上皮细胞(HumanConjunctival Epithelium, HCjE)均形成许多 iPSCs克隆，经碱性磷酸酶染色，这些克隆大部分呈阳性，表明这些iPS细胞具有良好的胚胎干细胞特性。计算克隆形成率后发现，基质成纤维细胞(HCjSF)的iPSCs诱导效率大约为0.1-0.5%，而结膜上皮细胞(HCjE)的iPSCs诱导效率则明显高于HCjSF，可达到1_2%。(2)、免疫荧光染色检测胚胎干细胞标志物的表达情况未分化的人胚胎干细胞表达某些特异的干细胞标志物，比如多能干细胞基因SSEA4、TRA-1-81、NAN0G、0CT4、LIN28(基因名称)等。通过免疫荧光染色，检测了所诱导的iPS细胞中这些干细胞标志物的表达情况。本实验所诱导的HCjSF-1PSCs和HCjE-1PSCs均表达SSEA4、TRA-1-81、NAN0G、0CT4、LIN28等人胚胎干细胞标志物，而不表达鼠类胚胎干细胞特异基因SSEA-1 (基因名称)，说明本实验所诱导的HCjSF-1PSCs和HCjE-1PSCs在胚胎干细胞标志物的表达方面与人胚胎干细胞相似，胚胎干细胞特性良好。(3)、胎瘤实验验证诱导性多能干细胞(iPSC)的多能性分化潜能将诱导性多能干细胞(iPSC)注射入免疫缺陷性小鼠体内可以形成畸胎瘤，含有3种胚层类型的组织细胞，说明本实验所诱导的HCjSF-1PSCs和HCjE-1PSCs在多能性与人胚胎干细胞相似，诱导性多能干细胞(iPSC)的胚胎干细胞特性良好。(4)、基因芯片分析HCjSF-1PSCs与ESCs在全基因表达谱上的相似程度 本实验选取HCjSF-1PSCs进行基因芯片分析。先分别提取HCjSF_iPSCs、HCjSF和ESCs的总RNA (核糖核酸)，进行基因芯片分析后，用软件对所得数据进行处理。基因芯片分析结果表明，本实验所诱导的HCjSF-1PSCs与ESCs在全基因表达谱上有高度的相似性，两者的同源率接近99%。作为对照，HCjSF-1PSCs与母细胞HCjSF在全基因表达谱上的相似程度明显不如HCjSF-1PSCs与ESC，两者的同源率仅为46%。在系统树图中，HCjSF-1PSCs与ESCs归属同一聚类，而iPSCs的母细胞HCjSF则归属另一聚类。这些结果表明本实验所诱导的HCjSF-1PSCs与ESCs在全基因表达谱上有较高的相似性，细胞重编程状况良好，胚胎干细胞特性明显。在所述步骤C中，HCjSF-1PSCs向角膜上皮干细胞的定向分化及细胞表型鉴定(I)、在IV型胶原上用SHEM条件培养基诱导HCjSF-1PSCs定向分化的情况角膜上皮干细胞直接位于基底膜上，IV型胶原是基底膜的重要成分，可能对维持角膜上皮干细胞特性起重要作用。SHEM培养基中所含的微量因子有利于维持上皮干细胞特性，普遍被应用于上皮干细胞的克隆化培养，也是目前眼科领域中广泛应用于角膜缘及人结膜上皮细胞克隆化培养的一种培养基。因此，将诱导所得的HCjSF-1PSCs接种于0.5mg/ml IV型胶原包被的培养板中，待细胞贴壁并长到一定大小后，用SHEM培养基诱导HCjSF-1PSCs分化I周，期间定期观察细胞形态变化。随着条件培养时间的延长，细胞逐渐变得扁平，原有的胚胎干细胞形态逐渐消失。I周后，对这些细胞进行免疫荧光染色，检测定向分化后的细胞表型，以及iPSCs进入终末分化的能力。分化细胞表达某些上皮干细胞标志物的蛋白P63、ABCG2和K19(基因名称)，但未见Κ12(基因名称)等终末分化的角膜上皮细胞特异性标志物的表达。提示该方法能够在一定程度上诱导HCjSF-1PSCs向上皮干细胞方向分化。(2)、在IV型胶原上用KSFM条件培养基诱导HCjSF-1PSCs定向分化的情况KSFM培养基是一种角质化无血清培养基，主要用于培养角质化细胞，小鼠角膜上皮干细胞系TKE2 (细胞系名称)可在KSFM培养基中维持干细胞特性，角膜上皮细胞和人结膜上皮细胞也可在KSFM培养基中增殖。因此，将诱导所得的HCjSF-1PSCs接种于
0.5mg/ml IV型胶原包被的培养板中，待细胞贴壁并长到一定大小后，用KSFM培养基诱导HCjSF-1PSCs分化I周，期间定期观察细胞形态变化。刚开始时HCjSF-1PSCs分化状况良好，克隆周边细胞分化较早，细胞形态与培养于KSFM培养基中的角膜上皮细胞极为相似。然而随着时间的延长，这些分化细胞逐渐死亡，未能延续分化状态并有效增殖。以上结果显示，iPSCs在KSFM培养集中增殖受到抑制。虽然如此，该结果还是能在一定程度上说明KSFM培养基有诱导HCjSF-1PSCs进入终末分化的潜力。下面提供上述方法的应用例，该应用例包括步骤:(I)、人结膜基质成纤维细胞(Human Conjunctival Stromal Fibroblast,HCjSF)及人结膜上皮细胞(Human Conjunctival Epithelium, HCjE)的培养。(2)从Stevens-Johnson综合征、眼化学伤及热烧伤等严重眼表面疾病导致的全角膜缘干细胞缺乏患者的眼表面活检，取得3 X 3_大小结膜组织，将整个组织块(上皮朝上)置于KSFM培养基中培养一周，待上皮细胞长出后挖去中央组织块，继续于KSFM培养基中培养上皮细胞一周。试剂配制:成纤维细胞培养基:DMEM培养基，10 % FBS, 100U/ml青链霉素，IOOU/ml两性霉素B。KSF M培养基(500ml):500ml KSFM培养基，0.9ml牛脑垂体提取物(bovinepituitary extract, ΒΡΕ)，7.5 μ g 表皮生长因子(EGF)，100U/ml PS, lOOU/ml 两性霉素 B。iPS细胞诱导流程包括:(I)按脂质体转染法包装诱导所需的4种逆转录病毒(0CT4、S0X2、c-MYC和KLF4)，同时包装pMX-GFP荧光病毒作为对照。(2)、侵染前一天将HCJSF和HCjE消化后计数，接种于12孔板，2 X 104/孔。(3)、侵染当天(Day 0，记为DO)，收集48h病毒上清后，每IOcm板病毒上清用
0.45 μ m滤膜过滤到15ml离心管中，每管再加入2.5_3ml新鲜培养基，加入终浓度6_8 μ g/ml polybrene,混匀。将HCjSF和HCjE培养基吸掉，加入病毒上清，S0X2，KLF4，0CT4, c-MYC四种病毒(KOSM)等体积，同时用pMX-GFP病毒侵染HCjSF和HCjE作为对照。(4)、第二天(Day 1，记为Dl)做病毒第二次侵染，步骤同病毒第一次侵染。D2，第二次侵染完，换为iPS-Ι培养基(无VPA)。通常，GFP侵染效率在D2会在70%以上，D5，复苏小鼠成纤维滋养层细胞(MEF)到IOcm板，1-1.25X106/板。D6，将MEF滋养层细胞培养基换为iPS-Ι培养基KOSM侵染的HCJSF或HCjE用0.05%胰酶消化后计数，接种1-10 X 104/10cm板到滋养层细胞上。D7，换为iPS-Ι培养基+Valproic acid (丙戊酸，VPA)(通常VPA连续处理7-10天)。D14-17，换为iPS_2培养基。D24-30，观察并拍照记录iPSCs克隆形成，之后可进行筛选与培养。试剂配制:iPS-Ι 培养基(500ml):385ml DMEM/F12, 50ml Defined FBS (Hyclone), 50ml KSR,5ml L-GlutaMax (100 X), 5ml NEAA IOmM(IOOX), lml2-Mecaptoenthanol 55mM(购买自GIBCO), 500 μ I bFGF 8 μ g/ml (1000 X)。(抗生素可选加，按标准量的一半加，培养基2-3周内使用)iPS-2 培养基(500ml):385ml DMEM/F12,100ml KSR, 5ml L-GlutaMax (100 X)，5mlNEAA IOmM(IOOX),Iml 2-Mecaptoenthanol 55mM(GIBCO),500ulbFGF 8 μ g/ml(1000X)。(抗生素可选加，按标准量的一半加，培养基2-3周内使用)。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)溶液(8μ g/ml):10 μ g bFGF, 1.25ml 0.1 % BSAin PBS。(0.22 μ M 过滤，_20°C保存)。Valproic acid (丙戊酸，VPA溶液200 X):将VPA加入DMEM/F12培养基中，配成200mM 溶液。(0.22μπι 过滤，-20°C°C保存)。iPS细胞的培养与传代，包括:(I)、待iPSCs克隆长到一定大小时即需进行传代。传代前一天4°C溶解Geltrex。根据实验用量，每Iml Geltrex(购买自GIBC0)加入29ml 4°C保存的DMEM/F12培养基(培养基名称，购买自GIBC0)，配成Geltrex溶液，混匀。根据平板大小，加入适量的Geltrex溶液(比如lml/35mm孔)；将装有Geltrex溶液的培养板置于37°C放置I小时，等待Geltrex溶液形成Geltrex胶。然后将培养板取出置于超净台中I小时，即可用于iPS细胞传代。细胞间照紫外30分钟，在酒精灯上将玻璃细端拉细，弄弯制作圆头吸管。镜下用圆头吸管将选好的iPSCs克隆与MEF滋养层分离并切割为数小块，吸出放入装有Geltrex涂层细胞的板中。一般iPS细胞需要每天更换新鲜培养基，以保证细胞状态良好，保持高度去分化状态。针对出现少量分化，尽早刮去分化细胞，如果分化严重并持续出现，放弃。只留形态稳定类似ES细胞的克隆。诱导iPS细胞向角膜上皮干细胞定向分化，包括:(I)用IV型胶原包被培养板:1、配制0.5m g/ml IV型胶原溶液。2、根据培养板面积加入适量IV型胶原溶液包被培养板。(如2cm2孔加入200 μ IIV型胶原溶液)，4°C孵育过夜。3、第二天接种细胞前，吸掉多余的IV型胶原溶液，用I XPBS洗I遍，即可用于细胞接种。试剂配制:IV型胶原溶液:将IV型胶原溶解于0.25%醋酸中，配成0.5mg/ml IV型胶原溶液。4°C溶解3小时，间歇性振荡。(2)条件培养基对iPS细胞定向分化的诱导:将iPS细胞接种于IV型胶原包被的培养板中。待克隆长到一定大小后，分别用SHEM培养基、KSFM培养基以及这两种培养基轮流诱导(先用KSFM培养基诱导2天，再换成SHEM培养基诱导2天，接着又换成KSFM培养基诱导2天，如此反复)的方法诱导iPS细胞进行定向分化。iPS细胞定向分化后的细胞表型鉴定:诱导过程中对细胞形态进行连续拍照观察，以记录细胞形态变化过程。条件培养基诱导I周后，对细胞进行固定，进行免疫荧光染色，从蛋白质水平检测分化效果。以上对本发明实施例所提供的一种人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化方法进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在
及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。


本发明提供一种人诱导性多能干细胞向角膜上皮样细胞定向分化的方法，其包括步骤A、基于患者的眼表组织，分离人结膜基质成纤维细胞和人结膜上皮细胞；B、在所述成纤维细胞和人结膜上皮细胞导入基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4，诱导产生iPSCs；C、在所述iPSCs中加入IV型胶原、采用KSFM细胞培养基和SHEM细胞培养基轮流诱导的方法，对所述iPSCs向角膜上皮样细胞定向分化。本发明提供的分化方法快速、简便、高效，可大量获得角膜上皮干细胞。