专利名称：一种组织工程人角膜上皮的重建方法人角膜上皮层由多层上皮细胞组成，是角膜的第一道屏障，可以防止角膜水分的散失和外界病原体的入侵，并阻止泪液中液体和电解质进入基质层，使角膜处于透明状态; 此外，角膜上皮细胞表面的微绒毛和泪膜相互作用，为透明角膜的前屈光面提供光学界面 (谢立信，2000)。由于角膜上皮层直接与外界接触，故易受到损伤和感染而引起角膜上皮损伤或病变，导致视力下降，严重者会引起角膜上皮盲(樊廷俊等，2010)。角膜病是仅次于白内障的第二大致盲眼病，其中多数是由于角膜上皮结构和功能异常所引起的(Whitcher 等，2001)。角膜上皮移植是目前角膜上皮病盲治愈的唯一途径，但由于捐献的供体角膜数量严重不足，致使绝大多数角膜上皮盲病患者无法通过角膜上皮移植而重见光明。近年来， 角膜组织工程的兴起使体外重建出形态结构正常的组织工程角膜上皮成为可能，是目前解决供体角膜材料不足的一种新的可行途径，为角膜上皮病盲患者的临床治疗带来了新的希望，但如何利用角膜上皮细胞和适宜的载体支架在体外重建出组织工程人角膜上皮已经成为研究热点。利用组织工程技术对人角膜上皮的体外重建研究开始于1993年，许多学者先后利用诱导分化的角膜缘干细胞、表皮干细胞、骨髓间充质干细胞、口腔黏膜上皮细胞和羊膜上皮细胞等作为种子细胞，以复合胶原、羊膜、脱细胞角膜基质、壳聚糖、纤维蛋白和聚异丙基丙烯酰胺凝胶等为载体支架开展了组织工程人角膜上皮的体外重建研究(Minami等， 1993 ；Koizumi 等，2001 ；Nakamura 等，2003 Jin 等，2004 ；Ma 等，2006 ；樊廷俊等，2010)，且移植后可使角膜创伤兔或角膜损伤患者恢复一定的视力。这些研究结果为组织工程人角膜上皮的体外重建开辟了道路，但由于所用种子细胞均为诱导分化的细胞，因种子细胞来源有限，或因仍具有原有种类细胞的特点，故无法开展组织工程人角膜上皮的规模化体外重建，或体外重建的组织工程人角膜上皮因结构功能不稳定而无法临床应用，目前仍只限于实验研究。2009年，樊廷俊等成功建立了非转染、无致瘤性的人角膜上皮细胞系，并从中筛选出核型正常且结构功能正常的角膜上皮细胞株，成功解决了人组织工程角膜上皮规模化重建所需大量种子细胞的来源问题。因此，尽早建立一种利用人角膜上皮细胞单克隆细胞株和去上皮层消化羊膜在体外重建组织工程人角膜上皮的方法，已成为各国学者的主攻目标，也是组织工程角膜上皮规模化生产及临床应用造福全世界角膜上皮病盲患者的关键。
本发明的目的是提供一种组织工程人角膜上皮的重建方法，利用人角膜上皮细胞单克隆细胞株和去上皮层消化羊膜载体支架来体外重建人角膜上皮，从而满足患者对角膜上皮的移植需求，以弥补现有技术的不足。本发明的重建方法包括如下步骤1)人角膜上皮种子细胞悬液的制备取人角膜上皮细胞系的细胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12培养液在37°C扩增培养至对数生长期，经0. 25%胰蛋白酶溶液消化和1000 1500转/分钟离心10 15分钟获得人角膜上皮细胞沉淀，再用含有10%小牛血清和0. 005% 0. 01% IV型胶原蛋白的DMEM/F12培养液将该细胞沉淀悬浮成人角膜上皮细胞悬液，经细胞计数后，调整细胞浓度至8X IO6 3X IO7个细胞/毫升；其中人角膜上皮细胞系的构建方法是将角膜取出后用含抗生素的消毒液消毒， 再将角膜进行消化处理后，取下带有前弹力层的角膜上皮，剪成小的角膜上皮组织块后，将角膜上皮组织块向下贴于培养孔的底部，使前弹力层向上；然后加入培养液在二氧化碳培养箱中、37°C下进行贴板培养，培养期间换培养液，细胞长成单层后用胰酶消化法进行继代培养，传代至60代以上完成了人角膜上皮细胞系的构建；其中，培养液为含有20%胎牛血清、0. 02%。 0. 04%。的人表皮细胞生长因子、0. 01%。 0. 02%。的人碱性成纤维细胞生长因子、0. 4%。 1. 0%。羧甲基壳寡糖和0. 25%。 1%。硫酸软骨素的DMEM/F12培养液。上述的含抗生素的消毒液为用0. 9%生理盐水配制的质量比浓度为20% 70% 的庆大霉素溶液。上述的角膜进行消化处理是用浓度为0. 2 0. 5%的胰蛋白酶溶液消化，消化时间为1 2min。2)载体支架的制备利用0. 25%胰蛋白酶-0. 1% EDTA溶液对冻干羊膜的上皮面进行倒置消化，以得到完全去除上皮层的羊膜，用D-hanks溶液漂洗2次后，用打孔器将去上皮层消化羊膜打成与6孔培养板插入式培养皿孔径相同的去上皮层消化羊膜圆片，使其上皮面朝上平铺于插入式培养皿的底部，放置于5% CO2培养箱中在37°C条件下牢固干贴后制成载体支架备用；3)组织工程人角膜上皮的构建最后，在贴有去上皮层消化羊膜载体支架的插入式培养皿中，轻轻加入上述准备好的人角膜上皮细胞悬液0. 1 0.2毫升，使细胞悬液均勻分散于插入式培养皿中，6孔培养板孔中不加培养液，置5% CO2培养箱中37°C培养20 M小时待细胞完全贴附到载体支架上后，吸去插入式培养皿内的旧培养液，将插入式培养皿轻轻放入已加入0. 8毫升含 10%小牛血清的DMEM培养液的6孔培养板中，建立气-液界面培养环境，在5% CO2培养箱中37°C培养启动组织工程人角膜上皮的体外重建，每隔12小时轻轻摇动6孔培养板，每隔 24 36小时换液一次，待人角膜上皮细胞在载体支架上长成6 8层后即为重建的组织工程人角膜上皮。本发明利用无致瘤性、非转染的人角膜上皮细胞，能通过连续传代为组织工程人角膜上皮的规模化体外重建提供出足量的种子细胞；利用商品化冻干羊膜所制备的去上皮层消化羊膜，可满足组织工程人角膜上皮批量重建所需要的大量载体支架材料；而且可直接应用于批量生产和临床角膜移植；且其生产和临床治疗的成本低。本发明涉及一种组织工程人角膜上皮的重建方法，是利用含20％小牛血清的DMEM/F12培养液将人角膜上皮细胞体外培养至对数生长期，采用胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA消化法获得完全去除上皮层的消化羊膜载体支架，平铺在插入式培养皿中牢固干贴后，将悬浮于含有IV型胶原蛋白和10％小牛血清的DMEM/F12培养液的对数生长期人角膜上皮细胞，接种至平铺有去上皮层消化羊膜载体支架的插入式培养皿中采用气-液界面培养法进行组织工程人角膜上皮的体外重建。本发明工艺科学合理，所重建的组织工程人角膜上皮可用于批量生产，满足广大角膜上皮病盲患者临床角膜移植治疗对组织工程人角膜上皮的大量需求，且组织工程人角膜上皮体外重建和临床治疗的成本低。
一种组织工程人角膜上皮的重建方法
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