专利名称：一种组织工程角膜的制备方法眼球的解剖特点决定了眼球位置暴露，组织结构脆弱，很小的外力或异物均可造 成严重的损害，此外，其他一些角膜病包括感染性角膜病、角膜变性、营养不良和免疫性角 膜病等，均可导致角膜损伤。而一旦损伤，将严重影响视觉、或导致失明。角膜移植术是治 疗角膜病损的最有效手段，传统角膜移植的供体主要来自于尸体和捐献。目前，我国大约有 400万角膜盲患者，许多是通过角膜移植可以治疗复明，但由于供体的角膜来源非常有限， 严重限制了角膜修复手术的开展。组织工程技术的兴起为治疗各种可导致失明的角膜疾 病带来了希望。但是在角膜修复中起关键作用的种子细胞来源的问题目前尚未解决，而获 取自体角膜细胞将不可避免地破坏健康眼，寻找其他来源的种子细胞就成为解决问题的关 键。 研究表明，成体干细胞存在于许多成体组织器官中，是一种未充分分化、尚不成熟 的细胞，具有再生各种人体组织器官的潜在功能，称之为"万用细胞"。其用途非常广泛，涉 及到医学的多个领域。皮肤真皮层和口腔粘膜固有层起源于中胚层，解剖结构近似，都存在 有多能干细胞，从真皮或粘膜层部位分离、获取的多能基质干细胞和表皮干细胞可被诱导 分化为多种组织细胞，参与机体缺损的修复。因此这两种细胞有望成为再生医学领域的可 靠细胞来源。 组织工程角膜构建的关键还要有理想的支架来种植细胞，并作为载体进行移植。 这种载体应支持细胞生长增殖、促进细胞融合，形成近似体内的正常结构，同时要求具有良 好的组织相容性及角膜特有的透明、屈光等特征。目前尚无理想的支架材料用于修复角膜。 目前的组织工程角膜的研究主要集中在使用去除细胞成分的羊膜作为载体，在其表面接种 角膜缘干细胞来构建，其缺点主要是角膜缘干细胞来源受限；同时羊膜结构非常薄，没有强 度，不能修复角膜缺损，使其临床应用效果不佳。
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种组织工程角膜的制备方法，采用 来自皮肤或粘膜中的多能基质干细胞和表皮干细胞，分别接种于脱细胞天然角膜基质上， 所制备的组织工程角膜具有天然角膜的结构和成分，免疫排斥反应低，可用于修复角膜缺 损，加速角膜透明。 本发明组织工程角膜的制备方法的特征在于是采用多能基质干细胞和表皮干细 胞作为种子细胞，经体外扩增培养后将其种植在脱细胞天然角膜基质的两面，再经体外诱 导培养形成组织工程角膜；所述的多能基质干细胞和表皮干细胞来自皮肤或粘膜，经分离、 扩增和体外诱导分化，使多能基质干细胞转化为角膜基质细胞，表皮干细胞转化为角膜上皮细胞；所述的脱细胞天然角膜基质来自动物角膜，经削切、脱细胞、脱水处理后所形成的 板层角膜支架；所述的体外诱导培养是采用诱导培养液诱导种子细胞分化培养的过程。 本发明所制备的组织工程角膜采用皮肤或粘膜中的细胞作为种子细胞，具有来源 广泛、增殖和分化能力强的优点；作为支架的脱细胞天然角膜基质去除抗原成分后，显著降 低了免疫排斥反应，又具有天然角膜的结构和成分，能促进种子细胞的生长、增殖和分化， 用于充填角膜缺损，能够迅速与机体整合实现透明；最终所形成的组织工程角膜能够修复 角膜缺损。 本发明组织工程角膜的制备方法，具体步骤包括 步骤一、制备角膜支架取动物角膜剥离去掉角膜周围组织，磷酸盐缓冲液(PBS 溶液)清洗后置于-80°C中冷冻至少30分钟，于室温下解冻，如此反复冻融2 5次，使细 胞完全破裂崩解；在4t:纯水中浸泡1 2天，其溶胀后削切至所需厚度；再将其置于蛋白 酶溶液中消化，用纯水漂洗干净；置入0. 1 1M的NaOH溶液中浸泡8分钟以上，以达到溶 解细胞、灭活病毒的目的，用PBS溶液漂洗至pH中性；再将其置入含有DNA酶和a -半乳糖 苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上，去除残留的DNA和a -半乳糖基抗原成分，降低免疫 原性，用PBS溶液漂洗；为使细胞容易贴附，经脱水干燥后再使用含牛血清、或胶原蛋白、或 多聚赖氨酸、或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD多肽)的任一种溶液浸泡20分钟以上，再 经脱水干燥后消毒，得到角膜支架； 步骤二、种子细胞的培养取新鲜皮肤或粘膜，分离培养多能基质干细胞和表皮干 细胞，其分离和培养方法可采用已有技术实现，如(董蕊等，兔口腔黏膜固有层多能干细胞 的分离培养，临床口腔医学杂志2006 22(1) :47 50.)、和(马英智等.人表皮干细胞的 分离、纯化培养及鉴定，中国实验诊断学2009 13(2) :143 145.)。 步骤三、配制诱导培养液，其组成是在商用EpiLife培养液中添加有，碱性成纤维 细胞生长因子2 20ng/ml、表皮细胞生长因子2 20ng/ml、转化生长因子-1 2 30ng/ ml、胰岛素2 40ng/ml、氢化可的松50 400ng/ml、腺嘌呤20 40 y g/ml、转铁蛋白1 10 y g/ml、前列腺素-E2 0. 5 8ng/ml、胰岛素样生长因子-1 2 10ng/ml ; 步骤四、制备组织工程角膜在4t:条件下，按质量比将胶原7 io份透明质酸2 3份硫酸软骨素0. 5 1份混合，用0. 1 0. 5M的醋酸溶液将其配制成浓度为 2 10mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射后，按其体积加入10%的胎牛血清，再加入终浓度为 10mg/ml的DMEM培养基，调pH至7. 2 7. 4，制成凝胶溶液；再将所制备角膜支架的基质面 (削切面)浸透凝胶溶液，置于37t:环境下预固化；将体外培养的多能基质干细胞混合于凝 胶溶液中，按105 1(f个/cm2的细胞密度滴加到预固化角膜支架上，静置固化后翻转角膜 支架，将体外培养的表皮干细胞按104 105个/cm2的细胞密度滴加到角膜支架另一面，静 置2 3小时后，置于培养器皿内的培养支架上，采用诱导培养液连续培养6 10天，培养 期间每天换液，组织工程角膜培养完成；上述的培养条件均为37°C，5% 0)2环境。 本发明所制备的组织工程角膜，采用脱细胞天然角膜为支架，利用表皮干细胞和 多能基质干细胞为种子细胞，既克服了异种角膜基质免疫排斥大的难题，又保留了其天然 角膜的结构(能够恢复角膜的透明度)和主要成分(包括能促进角膜细胞生长、增殖和分 化的生长因子)；采用这种较为理想的支架，复合具有多向分化能力的表皮干细胞和多能 基质干细胞，在体外进行诱导、培养，得到与天然角膜相似的含有活细胞的组织工程角膜，其免疫原性极低。与现有技术产品相比，本发明的制备方法具有成本低、操作简便、来源广 泛和易于贮存的优点；所制备的组织工程角膜具有一定的弹性和韧性，形状大小和厚度易 于改变；具有与正常角膜相似的生理特性，避免了非角膜材料植入后的并发症，植入体内可 逐渐被受体细胞所改建，最终完全透明，可用于修复各种原因导致的角膜损伤。以下结合具体实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。 步骤一、制备角膜支架获取牛的角膜组织，剥离去掉角膜周围组织，PBS溶液清 洗后置于-80°C中冷冻1小时，取出后置于室温下解冻，如此反复冻融4次，使细胞完全破裂 崩解；4t:纯水中浸泡l天，使其溶胀后削切1/2厚度；再将其置于O. 2%蛋白酶溶液中消化 3小时，纯水漂洗3 5次；将其置入0. 8M的NaOH溶液中浸泡20分钟，以达到溶解细胞、 灭活病毒的目的，用PBS溶液漂洗至pH中性；置入含有50U/ml DNA酶和50U/ml a -半乳 糖苷酶的混合溶液中浸泡30分钟，去除残留的DNA和a-半乳糖基(a-gal)抗原成分，降 低免疫原性，用PBS溶液漂洗；经脱水干燥后使用8% (V/V)RGD多肽溶液浸泡30分钟，再 经脱水干燥后采用6°Co辐射消毒，得到角膜支架； 步骤二、种子细胞的培养可采用已有技术实现，也可按以下方法实现；无菌条件 下，将获取的粘膜组织消毒后，分切成2 5mm3组织块，PBS溶液清洗3次；加入0. 01 % (M/ V)中性蛋白酶溶液消化1小时，取出后分离表皮和真皮；收集真皮皮片置入0.03% (M/V) 胶原酶消化液中消化2h，将消化液用200目筛网过滤，过滤液用1000r/min离心10分钟， 用DMEM/F12商用培养液(含10%体积的胎牛血清)重悬沉淀细胞，把细胞以2X 105个/ ml的密度接种于培养瓶中，置37t:孵育箱培养6小时，弃去悬浮细胞，所得贴壁细胞即为多 能基质干细胞；另将分离后的表皮剪碎，加入0. 25% (M/V)胰蛋白酶溶液消化10分钟，轻 轻吹打分散细胞后用200目筛网过滤，过滤液用1000r/min离心IO分钟后弃上清，沉淀用 PBS缓冲液洗2次，再用商用表皮培养液重悬细胞，将细胞以2 X 105个/ml的密度接种于培 养皿中(培养皿表面覆有IV型胶原膜)，置于37t:孵育箱中半小时后，弃去未贴壁细胞，得 到表皮干细胞，添加表皮培养液，置于371:、5% (A培养箱中扩增培养，每3天更换培养基； 当细胞汇合度达80 90%后，用0. 25%的胰蛋白酶溶液消化、传代。 步骤三、诱导培养液的配制，在商用EpiLife培养液(美国invitrigen公司生产) 中添加碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml、表皮细胞生长因子10ng/ml、转化生长因子-l 15ng/ml、胰岛素10ng/ml、氢化可的松100ng/ml、腺嘌呤30 y g/ml、转铁蛋白6 y g/ml、前列 腺素-E2 2ng/ml、胰岛素样生长因子-l 4ng/ml。 步骤四、制备组织工程角膜先在4t:条件下，按质量比将胶原9份、透明质酸3 份、硫酸软骨素1份混合，用0. 4M的醋酸溶液将其配制成浓度为6mg/ml溶液，冰浴下紫外 线照射后，按其体积加入10 %的胎牛血清，再加入DMEM培养基使其终浓度达到10mg/ml ，调 pH至7. 3，制成凝胶溶液；再将制备的角膜支架的基质面(角膜的削切面)浸透凝胶溶液， 于37t:环境下预固化；将体外培养的多能基质干细胞混合于凝胶溶液中，再按5X 105个/ 112的细胞密度滴加到预固化的角膜支架上，静置固化后翻转角膜支架，将体外培养的表皮 干细胞按105个/cm2的密度滴加到角膜支架的另一面，静置3小时后，置入培养器皿内的培 养支架上，采用诱导培养液连续培养IO天，培养期间每天换液，组织工程角膜培养完成；上述的培养条件均为37°C、5% C02环境。 将所制备的组织工程角膜用于人体移植手术，其方法和术后护理与常规板层角膜 的移植手术相同；结果显示，术后3个月，大体观察角膜清晰度良好，组织学结构基本恢复 正常，与正常角膜基本一致。


一种组织工程角膜的制备方法，本发明采用表皮干细胞和多能基质干细胞为种子细胞，经体外扩增培养后种植在脱细胞天然角膜基质的两面，再经体外诱导培养形成组织工程角膜；本发明所用支架既克服了异种角膜基质免疫排斥大的难题，又保留了天然角膜的结构(能够恢复角膜的透明度)和主要成分(包括能促进角膜细胞生长、增殖和分化的生长因子)；与现有技术产品相比，本发明具有成本低、操作简便、来源广泛和易于贮存的优点；其含有活细胞的组织工程角膜有一定的弹性和韧性，形状大小和厚度易于改变，免疫原性极低；能避免非角膜材料引起的并发症，植入体内可被受体细胞所改建，能迅速与机体整合实现透明，适用于修复各种原因导致的角膜损伤。