专利名称：一种缩短烟叶发酵周期的微生物制剂及其应用的制作方法烟叶发酵是为卷烟生产提供优质原料的一项重要技术措施。烟叶发酵方法可分为自然发酵法和人工发酵法。自然发酵法是把调制(包括初、复烤)获得适当水分的烟叶经过包装后存放在仓库中，利用自然环境条件，在一定的温、湿度范围内，利用烟叶内酶的活动，缓慢地进行发酵，以达到改善烟叶品质的目的。该方法对烟叶品质提高较全面、彻底，是我国目前普遍采用的发酵方法。但这种方法所用时间长，通常需要1-2年，不仅占用大量仓库和资金，而且发酵 成本高。人工发酵是将烟叶放在能够控制温度和湿度的发酵室内，采用人为的适合烟叶内在品质变化的条件，促使烟叶化学成分和物理特性加快变化，从而达到使烟叶品质在短时间内得到改善得目的。这种方法可大大缩短发酵时间，可节约大量能源，减少资金和仓库占用，比较经济。由于微生物发酵的条件简单温和，易于控制，生产成本低，一些微生物具有酶的活性，有的微生物还能产生一些酶，并且产量很高，所以，生物技术尤其是微生物发酵技术在烟草中的应用研究逐渐成为烟草科技工作者关注的课题。1858年英国科学家Koller最早对烟草发酵机理进行研究，指出在某些方面雪茄烟的发酵与乙醇发酵相似，并试图用微生物来提高烟草发酵效果，20世纪50年代前苏联科学家也做了大量微生物烟草发酵试验，在烟叶发酵机理的探索研究和改善烟叶发酵品质等方面取得一定成效，但均未见有成功应用的报道。随后，前苏联科学家改变方法用提供酶作用的温湿度条件创造了人工发酵方法。我国烟草科技工作者如韩锦峰、邱立友等也尝试将分离到的优势菌混合制成微生物制剂，喷洒于烤烟烟叶表面，可加速考研发酵，提高烟叶发酵品质。研究表明，微生物制剂组成对改善烟叶整体品质的影响较大。而现有微生物制剂的作用效果大都较单一，在改善烟叶品质、缩短烟叶发酵周期方面有一定的突破，但较少见成功的工业应用报道。在烟叶的发酵过程中，如何有效地利用适宜的微生物和酶制剂来调控和加速烟叶的内在成分向有利于提高卷烟质量的方面转化，已成为烟草生物科技工作中的难点和热点。目前，国内仍很少采用这种方法，主要是因为缺乏适宜的人工发酵剂，发酵后烟叶品质改善效果和自然发酵有较大差距。与本发明较为接近的对比文件是申请号201010565687. 5的“一种烟叶烘烤用微生物制剂生产工艺”的专利申请，该申请的目的是提供一种烟叶烘烤用改善烟叶工业可用性品质的微生物制剂生产工艺；技术方案足使用“纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的方法”分离的高温菌菌种，通过一定条件培养获得发酵液即为提供烟叶烘烤用的微生物制剂。本发明的目的与技术方案与对比文件相比是有所不同的。
本发明的目的是提供一种能够用于改善烟叶品质和缩短烟叶发酵周期的微生物制剂，本发明的另一个目的是将该微生物制剂应用到烟草发酵过程中使发酵后烟叶品质与自然醇化烟叶品质无明显差异并缩短传统的烟叶发酵周期。本发明的目的是通过如下技术解决方案实现的一种缩短烟叶发酵周期的微生物制剂，主要由腊状芽孢杆菌Bacillus cereus与解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliqyefaciens构成；其活菌数比例为10 200 I 50 ;该微生物制剂所包含的微生物均分离自烟叶表面，经中国普通微生物保藏管理中心鉴定，分别属于蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，保藏号为CGMCC No. 3864和解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliqyefaciens,保藏号为 CGMCC No. 3866。所述腊状芽孢杆菌Bacillus cereus与解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliqyefaciens是通过如下方法制备将剪碎的烟叶表面加入已灭菌的LB培养液中，于37°C摇床培养24小时后，用无菌吸管吸取培养液，采用稀释涂布法在灭菌固体LB培养基上进行平板涂布，待菌长出后，用接种针在另一灭菌固体LB培养基上进行划线法分离，经纯化培养后得该单菌落纯培养菌。将上述单菌落纯培养菌经过试管培养基、扩大培养基、液体发酵培养基培养后，分别获得蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌液。将上述蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌菌液分别直接离心后得到菌泥，按照活菌数比例10 200 I 50进行混合，按重量百分比加入海藻糖I 2%、甘油I 2. 8%、谷氨酸钠O. 5 I. 5%作为该菌泥的复合冻干保护剂进行冷冻干燥得到粉末状微生物制剂。进一步地，将上述粉末状微生物制剂按照O. 5 5%的比例溶于无菌水中，制成微生物制剂水剂，将该水剂以3 10%的比例均匀喷施到烟叶上，将烟叶于25°C 50°C，65%RH 80%RH下人工发酵10 40天，可获得与自然醇化烟叶品质无明显差异的人工发酵后烟叶。更进一步地，将该微生物制剂用于烟叶发酵过程，具有改善烟叶品质、缩短烟叶发酵周期的作用。本发明微生物制剂具有以下性质该微生物制剂所含微生物为(1)蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，其保藏登记号为CGMCC No. 3864。细胞杆状，革兰氏阳性，形成芽孢，孢囊不膨大。在LB培养基上的菌落为圆形、边缘整齐、白色，有光泽。VP反应阳性，VP液pH〈6，营兼性厌氧生活。接触酶阳性。甲基红试验阳性。从葡萄糖产酸。在pH5. 7和7%NaCl中生长。分解酵素和淀粉。还原硝酸盐。(2)解淀粉芽孢杆菌Bacillus cereus，其保藏登记号为CGMCC No. 3866。细胞杆状，革兰氏阳性，形成芽孢，孢囊不膨大。在LB培养基上的菌落为圆形、边缘整齐、白色、半透明，光滑湿润，稍隆起。VP反应阳性，VP液pH〈6，营兼性厌氧生活。接触酶阳性。甲基红试验阴性。利用多种碳水化合物产酸。在pH5. 7和7%NaCl中生长。分解酵素和淀粉。还原硝酸盐。 试验表明，本发明微生物制剂用于烟草发酵过程中，能有效降解烟草中的纤维素、蛋白质和果胶等，其中果胶降解率可达40%左右，蛋白质降解率可达到23%左右，纤维素降解率可分别达到12%左右，并使烟叶刺激性降低、青杂气减少，吸味改善，发酵后烟叶品质与自然醇化烟叶品质无明显差异，可将烟叶发酵周期缩短至10 40天，具有突出的优点与显著的有益效果。職舶质(%)淀粉(%) (%，以‘酸计)幌㈤
一种缩短烟叶发酵周期的微生物制剂及其应用，涉及微生物与烟草加工技术领域。该微生物制剂包含分离自烟叶本身的蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌两株细菌，其活菌数比例为10～200:1～50。经过分离、培养、制备获得粉末状微生物制剂；将粉末状微生物制剂以0.5～5%的比例溶于无菌水中，将形成的水剂以3～10%的比例均匀喷施到烟叶上，置于25℃～50℃，65%RH～80%RH下人工发酵10～40天。试验表明，能有效降解烟草中的纤维素、蛋白质和果胶等，将烟叶发酵周期缩短至10～40天。获得与自然醇化烟叶品质无明显差异的人工发酵后烟叶，具有缩短烟叶发酵周期并可改善烟叶品质的作用。