谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法

周丙午, 周兴华, 范永军

2012年9月19日

2012年5月30日

2012年5月30日

广东乐尔康生物科技股份有限公司

C12N11/08GK102676598SQ20121017199

固相 谷氨酸钠 催化 合成 生物

1.ー种谷氨酸钠生物固相酶催化合成Y-氨基丁酸的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)生物合成将底物谷氨酸钠溶液与固相酶催化合成生成Y-氨基丁酸溶液，当谷氨酸钠生成Y-氨基丁酸的转化率>99%时，离心或过滤使反应液与固相酶分离，得Y-氨基丁酸水溶液； (2)分离纯化生成的Y-氨基丁酸溶液经过阳离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，最后稀氨水洗脱置换游离Y-氨基丁酸； (3)脱色浓缩氨基丁酸水溶液活性炭脱色后，赶氨，真空薄膜浓缩，浓缩至Y-氨基丁酸含量230 240g/100ml，得Y -氨基丁酸浓溶液； (4)结晶干燥Y-氨基丁酸浓溶液加入95%酒精，析出Y -氨基丁酸白色沉淀结晶，离心分离，真空干燥得Y-氨基丁酸白色粉末2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于在生物合成エ艺中，所述底物谷氨酸钠摩尔浓度为100 1000mmorl/L3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述底物谷氨酸钠与固相酶的配比为100 IOOOmmorl谷氨酸钠与I 10万生物效价的固相酶4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于在生物合成エ艺中，所述合成的底物溶液PH值为3. 5 7. 5 ;合成反应温度为25 55°C;反应液滤液与活性炭的重量配比为100 I 5;所述的Y-氨基丁酸浓溶液与95%酒精的体积比为I 5 10;结晶干燥的过程为在10万级洁净环境下进行5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于所述固相酶由如下エ艺制备 (A)谷氨酸脱羧酶的基因克隆及表达 根据短乳杆菌ATCC 367的谷氨酸脱羧酶(GAD)的基因序列设计以下引物引物一 AATGCATATGGCTATGTTATATGGTAAACACACGCAT 和引物ニ AATTGAAGCTTAGTGAGTGAATCCGTATTTTTTAGG,引物一和引物二分别含有内切酶位点Nde I和Hind III，利用引物一和引物ニ根据Bio-Rad公司的iPiOof DNA聚合酶的说明书扩增谷氨酸脱羧酶的基因片段，扩增片段经前述内切酶消化后，连接到前述内切酶预消化的载体pRSET-A (Invitrgen,美国)上成为质粒pRSET-A GAD，该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌种中表汰,将转化的菌落转移到50毫升LB培养液，37摄氏度振荡培养16小吋，离心收集细胞，大生产时，将发酵体积扩大至吨级规模，管式离心机连续离心收集菌体； (B)酶的纯化与固定化 GAD的纯化与固定化取菌体细胞以4倍体积的磷酸缓冲液(20mM，pH7. 4)悬浮，800bar高压破碎两次，加5M磷酸钾溶液(pH7. 0)至终浓度为I. 2M，缓慢搅拌下加1%聚丙烯酰胺及氯化钙溶液使结絮，板框过滤或高速离心去渣，清液为酶粗提物溶液，測定蛋白含量；以每IOmg蛋白/克载体的量向酶溶液加入环氧型固相酶载体，室温缓慢搅拌24小时，弃上清，所得固相酶分别以20mM醋酸盐缓冲液(pH5. 5)、含IM氯化钠的20mM醋酸盐缓冲液(pH5. 5)及20mM醋酸盐缓冲液(pH5. 5)洗涤，最后，測定固相酶的活性

本发明涉及一种由谷氨酸钠生物固相酶催化合成Y-氨基丁酸的方法，属于生物合成领域