专利名称：一种治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液的制备方法猪博卡病毒(Porcine Bocavirus,PBoV)是一种无包膜的单链DNA病毒,归属于细小病毒科博卡病毒属。2005年，Allander首次从患呼吸道感染的婴幼儿中分离得到人的博卡病毒。自此以后，世界各地纷纷在呼吸道，血液，粪便，尿液等处发现博卡病毒。有呼吸道病症的患者感染博卡病毒的几率明显比正常人高。 2009年，在瑞典猪群中偶然发现猪群中存在PBoV，2010年我国猪群中也检测到PBoV。在临床上博卡病毒主要导致人、牛、猪等动物的下呼吸道感染和腹湾。而猪Kobu病毒(Porcine Kokuvirus)为小RNA病毒科成员，不同种属动物体内检测的Kobu病毒存在着差异，这类病毒是胃肠炎疾病的主要病原之一，弓丨起幼龄动物(猪、牛、人少数)高发病率和高死亡率，成年动物死亡率较低，但感染率同样很高，主要症状和传胃流腹极为相似。自2010年4月至今，韩国、泰国；我国的广东、福建、广西、江西、湖北、河北和山东规模化猪场的仔猪陆续发生严重腹泻哺乳仔猪多在出生后2-3天发生呕吐，随后发生剧烈腹泻，死亡率较高，有的地区出现腹泻后死亡率达到100%。而母猪和育肥猪无明显症状。按照流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒感染时的处理措施，基本无显著效果。临床解剖主要症状为胃肠道的严重出血。对严重腹泻仔猪采集的样本分析发现，流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒检测阳性率较低，阳性率不足5%,而猪博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV)和Kobu病毒检测阳性率达到86. 6%。由此可见，PBoV和Kobu病毒是这次仔猪腹泻的罪魁祸首。但到目前为止，由于对该两种病毒的认识还不够深入，尚无有效的疫苗和防治措施，因此研制抗PBoV和Kobu病毒药物迫在眉睫。目前，卵黄抗体已经广泛运用于鸡、鸭、鹅、犊牛、仔猪和羔羊等动物疾病的紧急治疗和预防中，如鸡传染性法氏囊、鸡新城疫、鸡白痢、鸭病毒性肝炎、小鹅瘟、猪轮状病毒、犬瘟热、犬细小病毒病、羔羊轮状病毒腹泻、仔猪轮状病毒腹泻等。卵黄抗体是一种高产、优质的多克隆抗体，制备简单，容易提取，可以高效特异的对病毒性/细菌性疾病进行治疗；而且鸡大规模工业化饲养成本低，经济方便。同时使用卵黄抗体进行疾病治疗可以减少抗生素的使用，减少耐药株的出现，从而降低疫病控制成本。因此，卵黄抗体在生物制品的开发和疾病的防治方面具有广阔的前景。且迄今为止，运用卵黄抗体治疗猪呼吸道综合症的研究尚未有报到。
本发明的目的是提供一种治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液及其制备方法，用于防治仔猪腹泻，在降低防疫成本和耐药性菌株产生的前提下，有效的提高动物的生产性能和疫病防治效果，且不会对人产生食源性污染和药物残留。本发明的目的是通过以下技术方案来实现一种治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液，以实验分离当前流行的毒株为基础，将分离的猪博卡病毒和猪Kobu病毒灭活后制备成二联灭活疫苗免疫非免疫母鸡，免疫后收集免疫母鸡所产鸡蛋，从蛋黄中提取出卵黄抗体将其制备成安全、高效的卵黄抗体注射液。上述的治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液的制备方法，包括以下步骤I)分离当前流行的PBoV和Kobu病毒，分别用猪肾原代细胞分离培养PBoV，用Vero细胞培养Kobu病毒，测定病毒滴度后制备成二联灭活疫苗，制备的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID5tl不低于107/ml ；2)利用制备的二联灭活疫苗免疫非免产蛋母鸡，免疫程序如下与产蛋前30天首次免疫，免疫剂量为2ml/羽，首次免疫后2、4分别进行两次加强免疫,免疫剂量为3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫剂量为2ml/羽，以诱导母鸡持续性的产生抗PBoV和 Kobu病毒的抗体；3)第三次免疫后14天收集鸡蛋，运用75%乙醇消毒蛋壳，在无菌条件下收集卵黄，运用等量磷酸盐缓冲液(O. IM PBS, PH7. 2)后置组织匀浆器中，5000转/分匀浆I分钟，加入乳酸至PH为4. 0，2 8°C搅拌过夜，置-80°C冷冻后解冻，并重复冷冻一次，然后8000转/分离心10分钟，收集上清，按照I : I的比例加入饱和硫酸铵，2 8°C搅拌2消失，后2 8°C静置过夜，8000转/分离心10分钟收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸铵；4)运用微量中和实验测定PBoV和Kobu病毒的中和抗体效价；5)将效价测定好的卵黄抗体进行无菌检验,合格后无菌分装,使PBoV和Kobu病毒抗体效价不低于I : 64。本发明的有益效果为本发明中制备的卵黄抗体注射液为免疫球蛋白制剂，能够特异性的中和PBoV和Kobu病毒，可用于治疗临床上由PBoV和Kobu病毒单独感染或混合感染导致的仔猪腹泻；使用本发明中制备的注射液不仅可以治愈易感染上述病原的猪，同时对同群未感染上述病原的猪使用可以使其获得被动免疫；临床实验表明，使用本发明制备的产品后可以显著提高猪群生产性能；本发明制备成本低，见效快，本制品无毒副作用，使用后无药物残留，生产使用过程中对人畜无危害，同时使用本发明中制备的产品不会导致耐药菌毒株的出现，对食品安全无潜在的危害，适宜大规模推广。乳化取油相I体积份放于乳化缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相I体积份，加完后再以10000r/min搅拌2 5分钟，在终止搅拌前加入I %硫柳汞水溶液，使其终浓度为O. 01%，得到制备卵黄抗体用灭活疫苗。3、疫苗免疫非免疫母鸡产蛋前30天首次免疫,免疫剂量为2ml/羽，首次免疫后2、4分别进行两次加强免疫，免疫剂量为3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫剂量为2ml/羽，以诱导母鸡持续性的产生抗PBoV和Kobu病毒的抗体。实施例3卵黄抗体的制备和效价测定I、卵黄抗体的制备第三次免疫后14天收集鸡蛋，运用75%乙醇消毒蛋壳，在无菌条件下收集卵黄，·运用等量磷酸盐缓冲液(O. IM PBS, PH7. 2)后置组织匀浆器中，5000转/分匀浆I分钟，力口入乳酸至PH为4.0，2 8°C搅拌过夜，置-80°C冷冻后解冻，并重复冷冻一次，然后8000转/分离心10分钟，收集上清，按照I : I的比例加入饱和硫酸铵,2 8°C搅拌2消失，后2 8°C静置过夜，8000转/分离心10分钟收集沉淀，加入O. IM PBS溶解后除去硫酸铵。2、PBoV和Kobu病毒抗体的效价测定I)细胞制备分别取猪原代肾细胞和Vero，运用胰酶消化调整细胞浓度为5 X IO5/ml,然后传代至96孔板中，每孔0. Iml,加入至96孔板后轻微前后左右摇晃,混匀细胞使其能够均匀贴壁。2)体外中和实验分别将PBoV病毒液和Kobu病毒进行稀释，稀释至2000TCID5(I/ml。取制备的卵黄抗体进行2倍倍比稀释，取21 21°等10个稀释度。每个稀释度取0. 4ml卵黄抗体稀释液分别加入等量的稀释病毒液，37°C水浴I小时使卵黄抗体与PBoV或Kobu病毒进行中和反应。3)细胞接种以及中和效价测定中和反应完毕后，将96孔板中细胞培养液去除，力口入中和反应后的混合液，其中PBoV中和后加入到猪原代肾细胞中，Kobu病毒中和后加入到Vero细胞中，每孔O. lml，37°C吸附I小时，然后去除吸附混合液，加入细胞维持液继续培养。培养4天后观察细胞病变孔数并记录,然后按照Reed-Muench氏法计算中和抗体效价。3、将效价测定好的卵黄抗体进行无菌检验,合格后无菌分装,使PBoV和Kobu病毒的抗体效价不低于I : 64。实施例42011年3月天津某猪场10日龄仔猪489头，出现腹泻症状，主要表现为食欲减退、并出现严重腹泻，个别猪出现呕吐等症状。发病率高达60 %，死亡病猪解剖主要症状为胃肠道严重出血。采集病猪肠道和排泄物进行PCR检测，检测结果为Kobu病毒阳性。随后对所有腹泻仔猪注射本发明制备的卵黄抗体进行治疗，每头猪注射3ml，每天I次连续3天，同时对未发病仔猪注射等剂量卵黄抗体进行预防。同时加强饲养管理，对严重腹泻猪进行补液，腹腔注射5%的葡萄糖氯化钠溶液，每头猪40ml，每天一次，另外与加强消毒等其它措施相结合。用卵黄抗体治疗后新发病例迅速减少，轻度腹泻猪只迅速好转，用药后3天无仔猪因腹泻死亡。
本发明涉及一种治疗仔猪腹泻的卵黄抗体注射液的制备方法，所述的卵黄抗体注射液以实验分离当前流行的毒株为基础，将分离的猪博卡病毒和猪Kobu病毒灭活后制备成二联灭活疫苗免疫非免疫母鸡，免疫后收集免疫母鸡所产鸡蛋，从蛋黄中提取出卵黄抗体将其制备成安全、高效的卵黄抗体注射液。本发明的有益效果为制备的卵黄抗体注射液能有针对性的对猪博卡病毒和猪Kobu病毒单独感染或混合感染病猪进行有效的治疗，同时可运用该注射液对同舍未感染仔猪注射进行预防；该注射液制备工艺简单可规模化生产并运用于临床。