专利名称：从猫人参中提取具有抗癌作用的多糖复合物avds的方法及药物用途的制作方法 猫人参(别名猫气藤、沙梨藤、糯米饭藤)，Actinidia Vaivata Dunn根据中药大词典记载具有清热解毒作用，能治痈疖、白带、麻风病。亦有报道能治肺脓肿，近年也有治疗癌症的报道。有许多将此药配伍其它中药用于临床治疗肿瘤的报道。尽管如此，到目前为止，还未见到有关单味猫人参提取三萜类化合物、糖复合物(AVDS)亦称猫人参多糖复合物、猫人参糖肽制备成药物制剂的报道。癌细胞的恶性之所在主要是增殖与凋亡脱离了正常的控制，并可侵袭正常组织及发生远处转移，癌症之所以致命主要不在于癌细胞迅速不断地长大，而在于它的侵袭性与转移性。癌细胞转移的全过程实质上是癌细胞与癌细胞、癌细胞与宿主细胞(例如血管和淋巴内皮细胞、血小板和免疫细胞等)，以及癌细胞与细胞外基质分子(基底膜中的层粘连蛋白)相互作用的一系列复杂过程。细胞之间的相互作用是有选择性的，而不是随机的。细胞通过其识别能力来辨别发生作用和不发生作用的细胞。细胞的这种识别功能是由细胞表面糖蛋白介导的，并主要是由细胞表面的糖链来执行的。结构相似的游离寡糖或糖缀合物可以阻断细胞表面的糖蛋白或糖脂上的糖链所参与的生物学作用。因此开发多糖类药物，对杀伤肿瘤细胞及提高人体免疫调节功能具有重要的意义。
本发明的目的在于提供一种从猫人参中提取具有抗癌作用的多糖复合物AVDS的方法，并且提出其在治疗癌症中的新用途。根据提取的生物活性成分-三萜类化合物、糖复合物(AVDS)即多糖复合物，用于制备抗癌作用的制剂(包括口服制剂、注射剂、输液剂、透皮吸收、粘膜吸收等剂型)，在临床使用中可以缩小剂量，提高疗效，方便使用。其中所说的猫人参糖复合物，其组成分别是D-葡萄糖D-甘露糖D-木糖L-阿拉伯糖等杂多糖。本发明的目的是通过以下技术方法来实现的取猫人参药材饮片，粉碎成粗颗粒(过20目筛)，加8-10倍量70％乙醇，用乙醇热回流2次，3-4h/次，合并提取液；高速离心，5000-16000r/min，30分钟去杂，回收乙醇，浓缩提取液；浓缩液上大孔树脂，用蒸馏水、45％-55％乙醇依次洗脱，回收乙醇浓缩；浓缩液用50％-70％乙醇梯度洗脱，洗脱液回收乙醇，真空浓缩，干燥，得猫人参三萜类化合物。经乙醇回流提取后的猫人参残渣，用沸水煮提2次，每次3-4h，合并提取液，提取液加0.3-0.5％淀粉酶，0.01-0.02％蛋白酶，0.01-0.02％果胶酶，40℃保温4-5h，高速离心(5000-16000r/nim)30-45分钟，弃去不溶物；上清液过大孔树脂柱，流出液用聚砜膜进行超滤浓缩，浓缩后加95％乙醇使醇含量达40-50％，高速离心(5000-16000r/min)0.5-1h，取沉淀；沉淀物用水溶解，再用95％乙醇使醇含量达80％，高速离心(5000-16000r/min)0.5-1h；取沉淀，沉淀物分别用95％乙醇、无水乙醇、丙酮洗脱，回收溶剂，干燥，得猫人参糖复合物。再与猫人参三萜类化合物一同构成猫人参多糖复合物(AVDS)，也称猫人参糖肽。本发明所公开的从猫人参中提取有效成分的工艺不同于现有技术中所述的提取工艺。其优点表现在①采用大孔树脂法和膜(超滤)分离技术，减少了有机溶剂的使用量，减少能耗；不仅最大限度地保留了有效成分，使得率恒定、产品质量稳定，操作简便，有效成分结晶程度好，有效成分回收完全，而且可除去常规提取工艺难以分离的杂质、细菌和细菌内毒素(热原)；②采用了现代生物科技—酶工程技术，提高了分离效果；③采用高速离心技术，取代了传统的乙醇冷冻沉淀，使得工艺流程(时间)缩短，产品质量稳定；④降低了成本，提高了生产的安全性，为药品的安全生产提供了可靠的保证。采用本发明方法，从中药猫人参中提取的包括三萜类化合物、糖复合物的多糖复合物(以下简称，AVDS)，具有杀伤肿瘤细胞及免疫调节作用，可制备具有抗癌作用的制剂(包括口服制剂、注射剂、输液剂、透皮吸收、粘膜吸收等剂型)。其作用机理是①AVDS可以抑制癌细胞的糖基化，抑制其与转移相关的糖链的合成。损伤了细胞染色质，影响DNA基因的复制、转录，降低胞浆中RNA含量，使癌细胞活力降低，从而抑制了癌细胞增殖，最终导致癌细胞死亡。
②AVDS可以增强脾细胞T、B细胞促分裂素诱导的增殖，即对T、B细胞的免疫应答能力有促进作用。
③AVDS可以激活巨噬细胞的吞噬功能。
具体药效可参见说明书后附试验报告部分。


图1是本发明的工艺流程图实施例下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1 取猫人参药材饮片若干KG，粉碎成粗颗粒(过20目筛)，加8倍量70％乙醇，用乙醇热回流2次，3h/次，合并提取液；高速离心，16000r/min，30分钟去杂，回收乙醇，浓缩提取液；浓缩液上大孔树脂，用蒸馏水、45％、55％乙醇依次洗脱，回收乙醇浓缩；浓缩液用50％，70％乙醇梯度洗脱，洗脱液回收乙醇，真空浓缩，干燥，得猫人参三萜类化合物。
检测进行硅胶柱层析，以氯仿一甲醇梯度洗脱，然后用制备的薄层层析分离(CHCI3-MeOH＝9∶1)得二种白色化合物，经Liebermann-Burchard反应呈紫红色，示为三萜.
经乙醇回流提取后的猫人参残渣，用沸水煮提2次，每次3h，合并提取液，提取液加0.5％淀粉酶，0.01％蛋白酶，0.01％果胶酶，40℃保温4h，高速离心(16000r/nim)30分钟，弃去不溶物；上清液过大孔树脂柱，流出液用聚砜膜进行超滤浓缩，浓缩后加95％乙醇使醇含量达50％，高速离心(16000r/min)0.75h，取洗淀；沉淀物用水溶解，再用95％乙醇使醇含量达80％，高速离心(16000r/min)0.75h；取沉淀，沉淀物分别用95％乙醇、无水乙醇、丙酮洗脱，干燥，得猫人参复合多糖(AVDS)。
检测蒽酮一硫酸法。收集单一糖峰，将样品与标准单糖的色谱峰保留值进行对照以确定样品中单糖的种类。采用色谱峰面积归一法测定样品单糖的相对百分含量。
本发明所述猫人参提取的有效成分，三萜类化合物、糖复合物可以单独制剂，也可以将猫人参提取的有效成分，三萜类化合物、糖复合物与其他的中药提取的活性成分配伍制成复方制剂。如，猫人参多糖复合物与中药水蛭提取的生物活性多肽—水蛭素，透明质酸酶相配伍制备的具有抗癌作用的复方制剂(包括口服制剂、注射剂、输液剂、透皮吸收、粘膜吸收等剂型)。其中所说的水蛭是生物活性多肽—水蛭素，分子量约为7000，透明质酸酶分子量约为28500。
实施例2 取猫人参药材饮片若干KG，粉碎成粗颗粒(过20目筛)，加9倍量70％乙醇，用乙醇热回流2次，4h/次，合并提取液；高速离心，8000r/min，40分钟去杂，回收乙醇，浓缩提取液；浓缩液上大孔树脂，用蒸馏水、45％，55％乙醇依次洗脱，回收乙醇浓缩；浓缩液用50％，70％乙醇梯度洗脱，洗脱液回收乙醇，真空浓缩，干燥，得猫人参三萜类化合物。
检测进行硅胶柱层析，以氯仿一甲醇梯度洗脱，然后用制备的薄层层析分离(CHCI3-MeOH＝9∶1)得二种白色化合物，经Liebermann-Burchard反应呈紫红色，示为三萜.
经乙醇回流提取后的猫人参残渣，用沸水煮提2次，每次3h，合并提取液，提取液加0.5％淀粉酶，0.01％蛋白酶，0.01％果胶酶40℃保温5h，高速离心(8000r/nim)30分钟，弃去不溶物；上清液过大孔树脂柱，流出液用聚砜膜进行超滤浓缩，浓缩后加95％乙醇使醇含量达50％，高速离心(8000r/min)0.5h，取洗淀；沉淀物用水溶解，再用95％乙醇使醇含量达80％，高速离心(8000r/min)0.5h；取沉淀，沉淀物分别用95％乙醇、无水乙醇、丙酮洗脱，干燥，得猫人参复合多糖(AVDS)。
检测蒽酮一硫酸法。收集单一糖峰，将样品与标准单糖的色谱峰保留值进行对照以确定样品中单糖的种类。采用色谱峰面积归一法测定样品单糖的相对百分含量。
试验报告本发明提取的AVDS对小鼠肝癌和S180实体瘤的抑瘤作用1.小鼠肝癌、S180瘤细胞混悬液制备选取已接种肝癌后8～10天、肿瘤生长良好的荷瘤小鼠，在超净工作台上操作，颈椎脱臼处死，腹部皮肤消毒后，抽取腹腔积液(乳白色浓稠液)置入已消毒的烧杯内，用生理盐水按1∶1进行稀释制成肝癌腹腔积液混悬液和S180腹腔积液混悬液。
2.抑瘤试验2.1 AVDS对小鼠肝癌的抑瘤试验取昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重(20±2)g，用已制备的肝癌腹腔积液混悬液，每只小鼠腋窝皮下接种0.2ml，接种后随机分成5个组AVDS100mg/(kg·d)，50mg/(kg.d)，25mg/(kg·d)组，即高、中、低3个剂量组，另设环磷酰胺阳性对照组50mg/(kg.d)，和肝癌模型对照组，每组12只，接种24h后，肌肉注射给药，每天1次，连续给药10天，肝癌对照组给于等容量的生理盐水，在末次给药24h后将小鼠称重，处死动物，称瘤，计算各组的抑瘤率。抑瘤率＝(对照组平均瘤重—试验组平均瘤率)/对照组平均瘤重×100％，用t检验作统计学处理。
2.2 AVDS对小鼠S180的抑瘤试验取昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重(20±2)g，用已制备的S180腹腔积液悬液，每只小鼠腋窝皮下接种0.2ml，接种后随机分成5个组AVDS剂量为100mg/(kg·d)，50mg/(kg·d)，25mg/(kg·d)，即高、中、低3个剂量组，环磷酰胺阳性对照组50mg/(kg·d)及S180模型对照组。其余操作方法同小鼠肝癌的抑瘤试验。
2.3 取2.2试验下各组小鼠，剖取胸腺、脾脏，计算胸腺指数和脾指数。胸腺(脾)指数＝胸腺(脾)重(mg)/体重(g)。
3.结果3.1 AVDS对小鼠肝癌的抑瘤试验结果见表1，AVDS高、中、低三个剂量组对小鼠肝癌的抑瘤率分别为55.49％，53.54％和40.17％，环磷酰胺组抑瘤率为65.30％。AVDS高、中剂量组及环磷酰胺组与模型对照组(生理盐水)比较，有显著性差异(P＜0.01＝；AVDS小剂量组与模型对照组(生理盐水)比较，有明显差异(P＜0.05＝。结果表明，AVDS对小鼠肝癌有抑瘤作用。
表1 AVDS对小鼠肝癌的抑瘤作用实验分组剂量 小鼠数平均瘤重抑瘤率(mg/kg·d) (只) (χ±S，g) (％)模型对照组 122.049±0.612环磷酰胺组 50 120.711±0.158****65.30AVDS大剂量组100 120.912±0.365****55.49AVDS中剂量组50 120.952±0.354****53.54AVDS小剂量组25 121.226±0.189**40.17注与模型对照组比较，**为P＜0.05，****为P＜0.013.2 AVDS对小鼠S180的抑瘤试验结果见表2，AVDS高、中、低三个剂量组对小鼠S180的抑瘤率分别为51.13％，50.74％和41.61％，环磷酰胺组抑瘤率为60.44％。AVDS高、中剂量组及环磷酰胺组与模型对照组(生理盐水)比较，有显著性差异(P＜0.01＝；AVDS小剂量组与模型对照组(生理盐水)比较，有明显差异(P＜0.05＝。结果表明，AVDS对小鼠S180有抑瘤作用。
表2 AVDS对小鼠S180的抑瘤作用实验分组剂量 小鼠数平均瘤重 抑瘤率(mg/kg·d) (只) (χ±S，g) (％)模型对照组 121.764±0.412环磷酰胺组 50 120.698±0.147***60.44AVDS大剂量组100 120.862±0.268****51.13AVDS中剂量组50 120.869±0.255****50.74AVDS小剂量组25 121.030±0.189**41.61注与模型对照组比较，**为P＜0.05，****为P＜0.013.3 AVDS对S180荷瘤小鼠免疫器官重量的影响结果显示，环磷酰胺致使荷瘤小鼠胸腺，脾脏明显萎缩，与模型对照组比较有明显差异(P＜0.05)；AVDS能增加荷瘤小鼠胸腺，脾脏的重量，与模型对照组比较有明显差异(P＜0.05)，见表3。
表3AVDS对S180荷瘤小鼠免疫器官重量的影响剂量 胸腺指数(mg·g-1) 脾指数(mg·g-1)组别(mg·kg-1)模型对照组 - 1.34±0.36 4.28±0.35AVDS大剂量组 100 1.77±0.25*5.64±0.34**AVDS中剂量组 501.68±0.27*5.26±0.41**环磷酰胺组 500.92±0.23Δ3.20±0.28Δ注AVDS与模型对照组比较**P＜0.05；环磷酰胺组与模型对照组比较ΔP＜0.05。


本发明是一种从中药猫人参中提取三萜化合物、多糖复合物(AVDS)在制备具有抗癌作用的药物中的应用。本发明涉及的多糖复合物，具有杀伤肿瘤细胞及免疫调节作用，可制备具有抗癌作用的制剂(包括口服制剂、注射剂、输液剂、透皮吸收、粘膜吸收等剂型)。本发明最大限度地保留了猫人参的有效成分，得率恒定、产品质量稳定，操作简便。