专利名称：恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗的制备方法 我国恶性肿瘤在城市地区发病率居死因第一位，在农村居第二位，严重威胁人民健康和生命。采用肿瘤疫苗对肿瘤患者进行主动免疫治疗，激发和增强患者对肿瘤的免疫排斥反应，为肿瘤的治疗提供了一条新路。近年，世界各国都在积极开展肿瘤疫苗研制，有多种肿瘤疫苗已进入临床试验，但由于种种原因，如肿瘤疫苗中的核心部分-抗原不理想、肿瘤疫苗中的辅助部分的免疫佐剂不理想，和MHC限制性，以及长期以来，肿瘤疫苗制备工艺缺乏现代工程技术(例如纳米技术)的渗透和开拓，致使一些困难问题，例如，疫苗的靶向性问题，抗原的有效递呈问题，疫苗的缓释问题等尚未得到解决。
本发明的目的在于，应用基因工程技术，提供一种恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗的制备方法，该方法首先制备MAGE-1～Hsp70融合蛋白与SEA复合抗原物，以纳米技术构建肿瘤纳米疫苗，充分发挥机体免疫功能，有效杀伤肿瘤细胞，最终实现恶性肿瘤患者手术切除肿瘤后控制复发和转移，降低死亡率的目的。实现上述发明目的的技术解决方案是选用肿瘤特异性共有抗原基因黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)和生物免疫佐剂热休克蛋白70(Hsp70)基因连接，构成融合基因(MAGE-1～Hsp70)，通过大肠杆菌表达，分离与纯化，获得MAGE-1～Hsp70融合蛋白，经变性与复性，得到高活性的融合蛋白，将此融合蛋白与超抗原葡萄球菌肠毒素A组合，构成复合抗原物。制备纳米脂质体，包裹复合抗原物，通过N-羟基琥珀酰亚胺酯与Hsp70分子连接，形成N-Hsp70，将其插入纳米脂质体磷脂膜外层，构成恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗。采用本发明所制备的恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗具有以下优点1)采用皮下注射，使用简便、安全；2)抗瘤广谱；3)具有靶向性；4)杀瘤效果强。图1是本发明的恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗的模式图。

以下结合附图和发明人依上述技术方案所作出的实施例，对本发明作进一步的详细描述。
本发明的具体实施步骤1.肿瘤特异性共有抗原基因的克隆1.1.MAGE-1基因的克隆与测序1.1.1.人MAGE-1基因的序列(Homo sapiens)1 atgtctcttg agcagaggag tctgcactgc aagcctgagg aagcccttga ggcccaacaa61 gaggccctgg gcctggtgtg tgtgcaggct gccgcctcct cctcctctcc tctggtcctg121 ggcaccctgg aggaggtgcc cactgctggg tcaacagatc ctccccagag tcctcaggga181 gcctccgcct ttcccactac catcaacttc actcgacaga ggcaacccag tgagggttcc241 agcagccgtg aagaggaggg gccaagcacc tcttgtatcc tggagtcctt gttccgagca301 gtaatcacta agaaggtggc tgatttggtt ggttttctgc tcctcaaata tcgagccagg361 gagccagtca caaaggcaga aatgctggag agtgtcatca aaaattacaa gcactgtttt421 cctgagatct tcggcaaagc ctctgagtcc ttgcagctgg tctttggcat tgacgtgaag481 gaagcagacc ccaccggcca ctcctatgtc cttgtcacct gcctaggtct ctcctatgat
541 ggcctgctgg gtgataatca gatcatgccc aagacaggct tcctgataat tgtcctggtc601 atgattgcaa tggagggcgg ccatgctcct gaggaggaaa tctgggagga gctgagtgtg661 atggaggtgt atgatgggag ggagcacagt gcctatgggg agcccaggaa gctgctcacc721 caagatttgg tgcaggaaaa gtacctggag taccggcagg tgccggacag tgatcccgca781 cgctatgagt tcctgtgggg tccaagggcc cttgctgaaa ccagctatgt gaaagtcctt841 gagtatgtga tcaaggtcag tgcaagagtt cgctttttct tcccatccct gcgtgaagca901 gctttgagag aggaggaaga gggagtctga1.1.2.克隆MAGE-1基因的引物MAGE-1-P1CGGAATTCATGTCTCTTGAGCAGAGGAGTC (EcoR I)MAGE-1-P2CGAAGCTTTCAGACTCCCTCTTCCTCCTCT (Hind III)1.1.3.克隆MAGE-1基因的方法采用TRIZOL法提取肝细胞癌细胞系HepG2(人肝细胞癌细胞系，ATCCNumber HB-8065)的总RNA，采用RT-PCR技术使用MAGE-1-P1和MAGE-1-P2扩增MAGE-1全长序列，克隆到克隆载体pUC19(通用克隆载体，GenBank/EMBLNumber L09137)的EcoR I和Hind III之间，转化感受态大肠杆菌DH5α(通用质粒保存菌株，非本专利专用菌株)。筛选阳性克隆，提取质粒及酶切鉴定，并进行测序，测序由上海博亚公司完成。所得的MAGE-1基因与GenBank(gi29029615)公布的一致。
2.生物免疫佐剂Hsp70基因的克隆、原核表达2.1.Hsp70基因序列(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)1 atggctcgtg cggtcgggat cgacctcggg accaccaact ccgtcgtctc ggttctggaa61 ggtggcgacc cggtcgtcgt cgccaactcc gagggctcca ggaccacccc gtcaattgtc121 gcgttcgccc gcaacggtga ggtgctggtc ggccagcccg ccaagaacca ggcagtgacc181 aacgtcgatc gcaccgtgcg ctcggtcaag cgacacatgg gcagcgactg gtccatagag241 attgacggca agaaatacac cgcgccggag atcagcgccc gcattctgat gaagctgaag301 cgcgacgccg aggcctacct cggtgaggac attaccgacg cggttatcac gacgcccgcc361 tacttcaatg acgcccagcg tcaggccacc aaggacgccg gccagatcgc cggcctcaac421 gtgctgcgga tcgtcaacga gccgaccgcg gccgcgctgg cctacggcct cgacaagggc481 gagaaggagc agcgaatcct ggtcttcgac ttgggtggtg gcactttcga cgtttccctg541 ctggagatcg gcgagggtgt ggttgaggtc cgtgccactt cgggtgacaa ccacctcggc601 ggcgacgact gggaccagcg ggtcgtcgat tggctggtgg acaagttcaa gggcaccagc661 ggcatcgatc tgaccaagga caagatggcg atgcagcggc tgcgggaagc cgccgagaag
721 gcaaagatcg agctgagttc gagtcagtcc acctcgatca acctgcccta catcaccgtc781 gacgccgaca agaacccgtt gttcttagac gagcagctga cccgcgcgga gttccaacgg841 atcactcagg acctgctgga ccgcactcgc aagccgttcc agtcggtgat cgctgacacc901 ggcatttcgg tgtcggagat cgatcacgtt gtgctcgtgg gtggttcgac ccggatgccc961 gcggtgaccg atctggtcaa ggaactcacc ggcggcaagg aacccaacaa gggcgtcaac1021 cccgatgagg ttgtcgcggt gggagccgct ctgcaggccg gcgtcctcaa gggcgaggtg1081 aaagacgttc tgctgcttga tgttaccccg ctgagcctgg gtatcgagac caagggcggg1141 gtgatgacca ggctcatcga gcgcaacacc acgatcccca ccaagcggtc ggagactttc1201 accaccgccg acgacaacca accgtcggtg cagatccagg tctatcaggg ggagcgtgag1261 atcgccgcgc acaacaagtt gctcgggtcc ttcgagctga ccggcatccc gccggcgccg1321 cgggggattc cgcagatcga ggtcactttc gacatcgacg ccaacggcat tgtgcacgtc1381 accgccaagg acaagggcac cggcaaggag aacacgatcc gaatccagga aggctcgggc1441 ctgtccaagg aagacattga ccgcatgatc aaggacgccg aagcgcacgc cgaggaggat1501 cgcaagcgtc gcgaggaggc cgatgttcgt aatcaagccg agacattggt ctaccagacg1561 gagaagttcg tcaaagaaca gcgtgaggcc gagggtggtt cgaaggtacc tgaagacacg1621 ctgaacaagg ttgatgccgc ggtggcggaa gcgaaggcgg cacttggcgg atcggatatt1681 tcggccatca agtcggcgat ggagaagctg ggccaggagt cgcaggctct ggggcaagcg1741 atctacgaag cagctcaggc tgcgtcacag gccactggcg ctgcccaccc cggcggcgag1801 ccgggcggtg cccaccccgg ctcggctgat gacgttgtgg acgcggaggt ggtcgacgac1861 ggccgggagg ccaagtga2.2.克隆Hsp70的引物TBhsp70-1GGCGGATCCATGGCTCGTGCGGTCGGGATC (BamH I)TBhsp70-2GCGGAATTCTCACTTGGCCTCCCGGCCGTC (EcoR I)2.3.克隆Hsp70基因的方法取结核杆菌H37Rv(ATCC Number 25618，非本专利专用菌株)，加入裂解液，煮沸5min，进行PCR。循环条件94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共循环30次。取15μL进行琼脂糖凝胶电泳后，回收，以BamHI和EcoR I双酶切，克隆到pGEX-4T-1载体(Amersham产品，7-5130-01)中，构建重组质粒pGEX-Hsp70，转化感受态大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆，提取质粒及酶切鉴定，并进行测序，测序由上海博亚公司完成。所获得的基因序列与GenBank(GI15607142)公布的一致。
2.4.Hsp70原核表达载体的构建采用BamH I和Xho I双酶切质粒pGEX-Hsp70，琼脂糖电泳，回收1878bp片段，插入pET28a(+)(Novegen产品，69864-3)的相应位置，构建pET28-Hsp70原核表达质粒，转化感受态大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆，提取质粒及酶切鉴定。
3.Hsp70蛋白的分离纯化将pET28-Hsp70质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)(含噬菌体T7启动子原核表达质粒的表达菌株，非本专利专用菌株)，取单克隆，IPTG诱导表达。采用Ni2+-NTA Agarose(Invitrogen产品，R901-15)提取诱导表达产物，再通过ATP-Sephrose 4B(Fluka产品，WA13234)对Hsp70蛋白进行纯化，得到有活性的Hsp70蛋白。
4.融合基因的构建、原核表达4.1.引物设计MAGE-1-P3GCGCATATGTTCCTGATAATTGTCCTGGTC(Nhe I)MAGE-1-P4GCAGGATCCGACTCCCTCTTCCTCCTC(BamH I)4.2.融合基因原核表达质粒的构建采用MAGE-1-P3和MAGE-1-P4引物以pUC19-MAGE-1质粒为模板扩增MAGE-1基因，克隆到pET28-Hsp70的Nhe I和BamH I之间，构建MAGE-1～Hsp70的融合基因原核表达质粒pET28-M1-Hsp70，常规转化感受态大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆，提取质粒及酶切鉴定。
5.融合蛋白的原核表达、变性复性与分离纯化将质粒pET28-M1-Hsp70转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆，采用1mM IPTG诱导表达，SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达。常规提取包涵体，采用6M尿素变性蛋白，采用Sephadex G-25(Amersham产品，17-0033-01)色谱复性，采用Ni2+-NTA Agarose进行初步分离，采用ATP-Sepherose 4B进行分离纯化。
6.Hsp70与融合蛋白的蛋白水平检测6.1.Hsp70与融合蛋白的鉴定分别采用Hsp70抗体，MAGE-1和MAGE-3的抗血清进行Western blot，对Hsp70与融合蛋白进行免疫学鉴定。
6.2.Hsp70与融合蛋白的纯度分析采用SDS-PAGE与凝胶薄层扫描鉴定Hsp70与融合蛋白的纯度。
7.融合蛋白功能分析采用负载融合蛋白的肿瘤患者的树突状细胞(DC)，在体外刺激其外周血单个核细胞(PBMC)，产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，分别通过流式细胞仪检测CTL的表面标志物(CD3/CD4/CD8)，通过细胞杀伤实验检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。
本发明中，经负载融合蛋白的DC刺激产生的CTL，其CD3+T细胞的比例为82％，其中CD8+T细胞的数量为72％，CD4+T细胞的数量为14％。51Cr杀伤实验显示负载融合抗原的DC诱导产生的CTL对肝细胞癌HHCC的杀伤作用为62±23％，明显高于阴性对照组(18±11％)。
8.葡萄球菌肠毒素A(SEA)的制备8.1.SEA基因序列1 atgaaaaaaa cagcatttac attactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca61 cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct121 gaattgcagg gaacagcttt aggcaatctt aaacaaatct attattacaa tgaaaaagct181 aaaactgaaa ataaagagag tcacgatcaa tttttacagc atactatatt gtttaaaggc241 ttttttacag atcattcgtg gtataacgat ttattagtag attttgattc aaaggatatt301 gttgataaat ataaagggaa aaaagtagac ttgtatggtg cttattatgg ttatcaatgt361 gcgggtggta caccaaacaa aacagcttgt atgtatggtg gtgtaacgtt acatgataat421 aatcgattga ccgaagagaa aaaagtgccg atcaatttat ggctagacgg taaacaaaat481 acagtacctt tggaaacggt taaaacgaat aagaaaaatg taactgttca ggagttggat
541 cttcaagcaa gacgttattt acaggaaaaa tataatttat ataactctga tgtttttgat601 gggaaggttc agaggggatt aatcgtgttt catacttcta cagaaccttc ggttaattac661 gatttatttg gtgctcaagg acagtattca aatacactat taagaatata tagagataat721 aaaacgatta actctgaaaa catgcatatt gatatatatt tatatacaag ttaa8.2.构建SEA原核表达质粒的引物S1GCGGGATCCAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATG(BamH I)S2CGGAATTCTTAACTTGTATATAAATATATATATCAATATG(EcoR I)8.3.SEA表达质粒的构建、原核表达与分离纯化从产SEA的标准菌株FRI 100(产SEA的葡萄球菌，Tomas DJ，et al.J.Food Sci.52793-794，1987)中，提取基因组DNA，采用引物S1和S2，通过PCR扩增SEA的基因，采用BamH I和EcoR I双酶切目的片段，插入pGEX-4T-1(GST融合表达质粒，Amersham产品，27-4581-01)的相应位置，构建SEA的原核表达质粒pGEX-SEA，转化感受态大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆，提取质粒及酶切鉴定。测序由上海博亚公司完成。所获得的基因序列与GenBank(gi21204850)公布的一致。
采用IPTG诱导含pGEX-SEA的大肠杆菌DH5α，表达产物采用GSTrap FF柱(Amersham产品，17-5130-01)进行纯化，纯化产物通过凝血酶(Amersham产品，27-0846-01)切除GST部分，获得SEA。
9.复合抗原物的制备将融合蛋白与SEA以摩尔数1000∶1的比例，在4℃条件下，缓慢进行混合，即构成复合抗原物。
10.纳米脂质体对复合抗原物的包裹及检测10.1.纳米脂质体对复合抗原物的包裹取卵磷脂与胆固醇(Sigma产品)共计1.6g(摩尔比为5∶1)，溶于20mL氯仿-甲醇(1∶1)中，将复合抗原物溶液加入上述混合液，使复合抗原物的终浓度为1mg/mL，25℃恒温水浴减压旋转蒸发去除有机溶剂，使磷脂等材料呈均匀类脂薄膜。加入10ml 0.9％NaCl水合介质，旋转洗膜2h，得到脂质体混悬液。冰水浴条件下，采用探针式超声2min，得纳米脂质体胶体溶液。室温条件，0.15μm微孔滤膜过滤，4℃保存备用。
10.2.纳米脂质体大小的检测脂质体滴到敷有Formav膜的400目铜网上，滴加2％磷钨酸复染色，空气中干燥后，透射电子显微镜观察纳米脂质体的大小。
纳米脂质体的大小为35nm±5nm。
10.3.纳米脂质体包封率的检测凝胶柱Sephedex G-75(Amersham产品)分离纳米脂质体，洗脱液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，分离游离的复合抗原物，通过HPLC(KLB)测定总复合抗原量和游离的复合抗原量，计算游离药物量。
包封率＝(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100％。其中，Wtotal为脂质体悬液中复合抗原的总量，Wfree为游离复合抗原量。
纳米脂质体的包封率≥80％。
10.4.纳米脂质体载药量的测定测单位体积脂质体悬液内包裹抗原的含量，按如下公式计算载药量载药量＝(Wtotal-Wfree)mg/体积ml纳米脂质体的载药量为1mg/ml～1.2mg/ml。
11.肿瘤纳米疫苗的表面修饰将N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma产品)与Hsp70蛋白在水溶液混合24h，进行交联，常规PBS透析24h，制备脂肪链修饰的Hsp70，即N-Hsp70，将其加入纳米脂质体，制备肿瘤纳米疫苗。
12.肿瘤纳米疫苗的体外免疫学特性分析参见图1的恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗的模式图。
12.1.靶向性检测通过速度沉降法分离制备出外周血单个核细胞，接着用标记羊抗鼠IgG的免疫磁珠分选CD14+树突状细胞(DC)前体细胞，然后用细胞因子GM-CSF(1000U/ml)、rhIL-4(5μg/ml)协同培养5～7d，经流式细胞仪检测树突状细胞表面标志分子HLA-DR为92.5％；CD14为27％；CD80为78％；CD40为72％；CD83为82％。
分别将表面修饰的纳米疫苗和未修饰的纳米疫苗采用荧光素FITC进行标记，将二者与DC混合培养30min，通过流式细胞仪检测DC的荧光强度。结果为采用Hsp70进行表面修饰的纳米疫苗组的阳性荧光比例为60％～80％，高于未修饰的纳米疫苗组的荧光强度(28％)。
12.2.杀伤性检测将DC细胞与纳米疫苗混合，培养4h，采用该DC刺激外周血单个核细胞(PBMC)7d，获得CTL，通过流式细胞检测CTL的表面标志物(CD3/CD4/CD8)。采用CTL对肿瘤细胞(如肝细胞癌SMMC-7721等)进行杀伤，应用51Cr释放实验，观察杀伤状况。
在本发明中，与纳米疫苗混合培养的的DC，诱导PBMC，经体外培养7d后，流式细胞仪检测诱导产生的CTL表型，CD3+T细胞的比例为79％，其中CD8+T细胞的数量为69％，CD4+T细胞的数量为12％。51Cr杀伤实验显示诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肝细胞癌SMMC-7721的杀伤作用为55±23％，明显高于阴性对照组(12±11％)。
13.肿瘤纳米疫苗的体内免疫学特性分析
13.1.人源化SCID鼠的建立选取非“渗漏”SCID鼠(由第四军医大学实验动物中心提供，雌性，体重18±2克)，分离HLA-A2+PBMC，以5×107/只，转输SCID鼠，建立SCID鼠人源化模型(SCID-hu)，采用流式细胞仪检测其PBMC的表型(人CD3/CD4/CD8)。(注我国HLA-A2阳性人群的比例为50％以上)13.2.治疗性实验取SCID-hu鼠，分别于其一侧皮下移植肝癌细胞系SMMC-7721(人肝细胞癌细胞系，董春荣等，第二军医大学学报15，1980)、胃癌细胞系SGC-7901(人胃癌细胞系，林超鸿等，上海肿瘤杂志1(1)1-3，1981)和乳腺癌细胞系MCF(人乳腺癌细胞系，ATCC Number HTB-22)，各1×107/只，接种后每周，观察肿瘤大小并记录。在肿瘤生长至直径约5mm(约3周)，分别采用多点皮下注射纳米疫苗50μl/只/次(含有复合抗原物约50μg)，10天后强化免疫1次，多点皮下注射纳米疫苗50μl/只/次，治疗后4周后观察肿瘤的生长情况，根据以下公式计算肿瘤抑制率。
分离PBMC，采用51Cr释放实验检测其对肿瘤细胞的杀伤率；通过IFN-γELISPOT检测PBMC中针对MAGE-1的CTL数量。
本发明的纳米疫苗对肝细胞癌SMMC-7721、胃癌细胞系SGC-7901、乳腺癌细胞系MCF-7的肿瘤抑制率分别为43％、69％和62％。51Cr释放实验分别检测各组PBMC对相应肿瘤的杀伤率，结果为51±13％、72±18％和66±25％，明显高于对照组的杀伤率(14±11％、21±14％和22±19％)。IFN-γELISPOT检测PBMC中针对MAGE-1的CTL数量分别为230±56/106个细胞、360±89/106个细胞、338±129/106个细胞。
13.3.预防性实验分别对SCID-hu鼠的皮下多点注射纳米疫苗50μl/只/次(含有复合抗原物约50μg)，10天后强化免疫1次，皮下多点注射纳米疫苗50μl/只/次，免疫两周后在同一区域及对侧皮下分别移植肝癌细胞SMMC-7721，胃癌细胞SGC-7901和乳腺癌细胞MCF-7，各1×107/只，3周后观察肿瘤形成率。观察SCID-hu鼠生存时间，根据以下公式计算生命延长率。
肝细胞癌SMMC-7721、胃癌细胞系SGC-7901、乳腺癌细胞系MCF-7在纳米疫苗免疫的SCID-hu鼠上的成瘤率分别为5/10、3/10和4/10，而对照组的成瘤率分别为10/10、9/10和10/10。纳米疫苗免疫的SCID-hu鼠的生存时间为81±29d、104±42d和88±27d，明显高于相应对照组的生存时间(55±13d、58±21d和52±25d)，生命延长率为47％、79％和69％。


本发明公开了一种恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗的制备方法，采用肿瘤特异性共有抗原基因黑色素瘤抗原－1(MAGE－1)和生物免疫佐剂热休克蛋白70(Hsp70)基因连接，构成融合基因(MAGE－1～Hsp70)，通过大肠杆菌表达，分离与纯化，获得MAGE－1～Hsp70融合蛋白，经变性与复性，得到高活性的融合蛋白，将此融合蛋白与超抗原葡萄球菌肠毒素A组合，构成复合抗原物。制备纳米脂质体，包裹复合抗原物，通过N－羟基琥珀酰亚胺酯与Hsp70分子连接，形成N－Hsp70，将其插入纳米脂质体磷脂膜外层，构成恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗。采用本发明制备的恶性肿瘤广谱基因工程纳米疫苗具有以下优点1)采用皮下注射，使用简便、安全；2)抗瘤广谱；3)具有靶向性；4)杀瘤效果强。