专利名称：血管内皮细胞生长因子变体及其应用的制作方法血管的两种主要细胞成分是内皮和平滑肌细胞。内皮细胞形成所有血管内表面的衬里并构成血液和组织之间的非血栓形成性界面。另外，内皮细胞是形成新的毛细血管和血管的重要成分。因此，内皮细胞在与肿瘤生长和转移以及各种非致瘤性疾病或紊乱相关的血管发生或新血管形成期间增生。已报道各种天然存在的多肽诱导内皮细胞的增生。这些多肽中有碱性和酸性成纤维细胞生长因子(FGF)，Burgess和Maciag，生物化学年鉴，58575(1989)，血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，Ishikawa等，自然，338557(1989)和血管内皮生长因子(VEGF)，Leung等，科学，2461306(1989)；Ferrara和Henzel，生物化学和生物物理研究通讯，161851(1989)；Tischer等，生物化学和生物物理研究通讯，1651198(1989)；Farrara等，PCT专利公开号WO90/13649(1990年11月15日公开)。VEGF首先在牛垂体滤泡或滤泡星形细胞的条件培养基中证实。生化分析表明牛VEGF是二聚体蛋白质，具有大约45,000道尔顿的表观分子量和具有对血管内皮细胞的表观促细胞分裂特异性。使用以该蛋白质氨基末端氨基酸序列为基础的寡核苷酸作杂交探针经过筛选从该细胞制备的cDNA文库分离了编码牛VEGF的DNA。使用牛VEGF cDNA作杂交探针经过首次筛选从人细胞制备的cDNA文库获得了人VEGF。由此鉴定的一个cDNA编码与牛VEGF具有超过95％同源性的165个氨基酸的蛋白质；该165个氨基酸的蛋白质一般称为人VEGF(hVEGF)或VEGF165。经过在哺乳动物宿主细胞中表达人VEGF cDNA证实了人VEGF的促细胞分裂活性。用人VEGF eDNA转染的细胞为条件的培养基可促进毛细血管内皮细胞的增生，而对照细胞不能。[见Leung等，科学，2461306(1989)]。尽管可从天然来源分离和纯化血管内皮细胞生长因子用于随后的治疗用途，但回收VEGF时在滤泡细胞中相对低的该蛋白质浓度和在劳力和花费方面的高成本证实在商业上不可行。因此，进行了进一步的努力以便经过重组DNA技术来克隆和表达VEGF。[参见，例如，实验室调查，72615(1995)，并在此引用该参考文献]。已报道VEGF用于治疗在不存在过度组织生长的情况下，对血管内皮细胞的选择性作用重要的病情，例如，糖尿病型溃疡和由诸如皮下伤口的创伤引起的血管损伤。VEGF，即血管(动脉和静脉)内皮细胞生长因子可恢复损伤的细胞(称为血管发生的过程)和可刺激新血管形成(称为血管形成的过程)。[参见，例如，Ferrara等，内分泌学回顾，184-25(1997)]。VEGF在各种组织中由于可选择的RNA剪接导致以多种同型二聚体形式表达(每个单体121，165，189和206个氨基酸)。VEGF121是一种不结合肝素的可溶性促细胞分裂剂；更长的VEGF形式以逐渐更高的亲和力结合肝素。VEGF的肝素结合形式可被纤溶酶在羧基末端裂解释放出VEGF的可扩散形式。纤溶酶裂解后鉴定的羧基末端肽的氨基酸测序为Arg110-Ala111。氨基末端“核心”蛋白，即作为同型二聚体分离的VEGF(1-110)与完整的VEGF165同型二聚体相比以相似的亲和力结合单克隆中和抗体(例如称为4.6.1和3.2E3.1.1的抗体)和FLT-1以及KDR受体的可溶性形式。VEGF含有分别负责结合KDR(激酶结构域区)和FLT-1(FMS样酪氨酸激酶)受体的两个位点。据信这些受体仅存在于内皮(血管)细胞上。在由，例如创伤等引起的缺氧的细胞中VEGF生产增加，从而允许VEGF与各自的受体结合以触发产生生物学反应的信号途径。例如，VEGF与该受体的结合可导致增加血管通透性，引起细胞分裂和扩展以形成新的血管通道，即血管发生和血管形成。[参见，例如，Malavaud等，心血管研究，36276-281(1997)]。据报道VEGF诱导的通过KDR 受体的信号负责VEGF的促细胞分裂效应且可能在很大程度上负责VEGF的血管形成活性。[Waltenberger等，生物学和化学杂志，26926988-26995(1994)]。然而，FLT-1的生物学作用尚未完全明白。
已鉴定了VEGF蛋白质与受体结合有关的位点或区域且发现位置接近。[参见，Weismann等，细胞，28695-704(1997)；Muller等，美国国家科学院院报，947192-7197(1997)；Muller等，结构，51325-1338(1997)；Fuh等，生物学化学杂志，27311197-11204(1998)]。已发现KDR受体主要通过位于含有VEGF上第82位的精氨酸(Arg或R)，第84位的赖氨酸(Lys或K)，和第86位的组氨酸(His或H)的环上的位点结合VEGF。已发现FLT-1受体主要通过位于含有第63位的天冬氨酸(Asp或D)，第64位的谷氨酸(Glu或E)，和第67位的谷氨酸(Glu或E)的环上的位点结合VEGF。[Keyt等，生物学化学杂志，2715638-5646(1996)]。根据VEGF的晶体结构和VEGF的KDR结合位点的功能定位，还发现了VEGF使用位于分子相反端的两个对称结合位点结合KDR受体。每个位点由两个用于结合的“热点”组成，该“热点”由VEGF同型二聚体的两个亚基上的残基组成。[Muller等，出处同上]。这些结合决定簇中的两个位于短的，3-链β-折叠上的决定簇热点内，该β-折叠在转化生长因子β2(TGF-β)和血小板衍生生长因子(PDGF)中是保守的。
已鉴定了相对于其它受体选择性地结合一种受体的某些VEGF相关分子。一种分子，即P1GF，与VEGF的PDGF样结构域具有53％的相同性。P1GF表现出以高亲和力结合F1t-1而不能与KDR反应。如文献所述，P1GF在对内皮细胞的促细胞分裂活性中表现出极大的可变性[Maglione等，美国国家科学院院报，889267-9271(1991)；Park等，生物学化学杂志，26925646-25654(1994)；Sawano等，细胞生长和分化，7213-221(1996)；Landgren等，癌基因，16359-367(1998)]。
最近，Ogawa等描述了一种编码与哺乳动物VEGF具有大约25％的氨基酸相同性的多肽(称为VEGF-E)的基因。VEGF-E在Orf病毒(NZ-7菌株)基因组中鉴定，该病毒是一种感染绵羊和山羊且偶尔也感染人类产生具有血管形成的病灶的副痘病毒。研究人员进行了细胞增生试验且报道了VEGF-E几乎以与人VEGF相同的程度刺激人脐静脉内皮细胞和大鼠肝窦状隙内皮细胞的生长。结合研究也有报道。经过将过度表达KDR受体或FLT-1受体的细胞与固定量的125I-标记的人VEGF或VEGF-E一起培养，然后加入增加量的未标记的人VEGF或VEGF-E进行了竞争实验。研究人员报道了与FLT-1相比VEGF-E选择性地结合KDR受体。[Ogawa等，生物学化学杂志，27331273-31281(1998)]。
Meyer等，EMBO J.，18363-374(1999)也鉴定了VEGF家族的一个成员，称为VEGF-E。Meyer等报道的VEGF-E分子在Orf病毒株D1701的基因组中鉴定。在体外，发现VEGF-E刺激组织因子的释放且刺激血管内皮细胞的增生。在兔体内模型中，VEGF-E刺激兔角膜中的血管形成。Meyer等报道了VEGF-E分子结合特性的分析，在一些测定中揭示了与FLT-1受体相比该分子选择性地结合KDR受体。也参见Wise等，美国国家科学院院报，963071-3076(1999)。
Olofsson等，美国国家科学院院报，9511709-11714(1998)报道了称为“VEGF-B”的蛋白质选择性地结合FLT-1。研究人员公开了VEGF-B中Asp63，Asp64和Glu67残基突变成丙氨酸残基的诱变实验。对VEGF-B的突变形式的结合特性分析揭示突变蛋白表现出对FLT-1的亲和力降低。
发明简述申请人鉴定了包括至少一个氨基酸突变(与天然VEGF的氨基酸序列相比)，特别是在氨基酸位置17至25和/或位置63至65处或之间至少一个氨基酸突变的VEGF变体。申请人还鉴定了在位置43，46，79或83处包括至少一个氨基酸突变(与天然VEGF的氨基酸序列相比)，特别是在位置43，46，79或83各处的氨基酸取代为丙氨酸的VEGF变体。申请人惊奇地发现各种VEGF变体对KDR和FLT-1受体表现出改变的结合亲和力(与天然VEGF相比)，而且对KDR受体或FLT-1受体表现出选择性结合亲和力。
本发明提供了包括至少一个氨基酸突变(与天然VEGF的氨基酸序列相比)且对KDR受体具有选择性结合亲和力的VEGF变体。可任选的是，至少一个氨基酸突变包括天然VEGF多肽中的一个氨基酸取代。
在一个实施方案中，本发明提供了在VEGF位置17至25处或之间包括至少一个氨基酸突变的VEGF变体。任选的是，所述VEGF变体在位置17至25处或之间包括一个氨基酸取代。具体的氨基酸取代包括F17I，M18E，Y21L，Y21F，Q22R，Q22K，Q22E，Y25S或Y25I。在一个优选的实施方案中，所述VEGF变体在VEGF的位置18和/或21处包括至少一个氨基酸取代，其中用谷氨酸取代18位的甲硫氨酸残基和/或用亮氨酸取代21位的酪氨酸残基。
在另一实施方案中，本发明提供了在VEGF的第63至66位或之间含有至少一个氨基酸突变的VEGF变体。任选的是，所述VEGF变体包括在位置63至66处或之间的一个氨基酸取代。具体的氨基酸取代包括D63S，G65M，G65A，L66R或L66T。优选的VEGF变体在VEGF位置63，65，和/或66处具有一个或多个氨基酸取代，其中用丝氨酸取代63位的天冬氨酸残基，用甲硫氨酸取代第65位的甘氨酸残基，和/或用精氨酸取代66位的亮氨酸残基。
另一优选的VEGF变体包括在VEGF的第63，65，和/或66位有多个(即，一个以上)氨基酸突变和/或在VEGF第17，18，21，22和/或25位的一处或多处有一个或多个氨基酸突变。更优选的是，VEGF变体包含在VEGF的位置18和/或21处有一个或多个氨基酸取代(其中第18位用谷氨酸取代和/或第21位用亮氨酸取代)且在VEGF的位置63，65，和/或66处有一个或多个氨基酸取代(其中第63位用丝氨酸取代，第65位用甲硫氨酸取代，和/或第66位用精氨酸取代)。更优选的是，VEGF变体可包括下列氨基酸取代组中之一M18E，Y21L，Q22R，Y25S；D63S，G65M，L66R；M18E，D63S，G65M，L66R；或Y21L，D63S，G65M，L66R。
在一个优选的实施方案中，VEGF变体是含有包括本申请所述的一个或多个氨基酸取代的VEGF165氨基酸序列的多肽。
在表2中描述了其它的优选VEGF变体，它们在VEGF序列的这些位置上含有多个氨基酸取代。
在另一实施方案中，本发明提供的VEGF变体对FLT-1受体具有选择结合亲和力，且优选所述VEGF变体在43，46，79或83位的一处或多处包括一个或多个氨基酸突变。优选的是，所述FLT-1选择性VEGF变体在VEGF的第43，46，79和/或83位包括多个(即，一个以上)氨基酸突变。更优选的是，所述FLT-1选择性VEGF变体在VEGF的第43，46，79和/或83位包括一个或多个氨基酸取代成丙氨酸。最优选的是，该FLT-1选择性VEGF变体包含一组氨基酸取代I43A，I46A，Q79A，和I83A。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述的VEGF变体的分离的核酸。还提供了能表达本发明的VEGF变体的表达载体，含有所述载体的宿主细胞，及通过在产生VEGF变体的条件下培养所述宿主细胞来生产VEGF变体的方法。
在另一实施方案中，本发明提供了含有VEGF变体和一种载体的组合物。任选的是，该载体可以是一种药用上可接受的载体。
本发明还提供了治疗需要血管发生或血管形成的病情的方法，例如，血管网络的创伤，如手术切口，伤口，撕裂伤，穿刺血管和表面溃疡。在这些方法中，可给具有所述病情的哺乳动物施用有效量的VEGF变体。
本发明还提供了使用该VEGF变体的体外诊断方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用VEGF变体分析细胞或组织以检测是否存在KDR和/或FLT-1受体。
最后，本发明提供了含有本文所公开的VEGF变体的试剂盒和产品。
附图简述

图1A和1B显示了165个氨基酸的天然(“野生型”)VEGF的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。
图2显示了天然VEGF(8-109)的ELISA测定的滴定曲线。
图3显示了天然VEGF(8-109)的KIRA测定的滴定曲线。
图4显示了天然VEGF(8-109)的HUVEC增生试验测定的滴定曲线。
图5显示了通过使用各种浓度的天然VEGF(“WT VEGF)，LK-VRB-2s*(KDR选择性变体)和Flt-1-sel(Flt-1选择性变体)从表达KDR的NIH3T3细胞竞争性取代125I-VEGF(1-165)所测量的配体对KDR的结合亲和力。该测定法在实施例7中详细描述。各点代表两次测定的平均值，据估计误差小于该值的15％。
图6显示了通过使用各种浓度的天然VEGF(“WT VEGF)，LK-VRB-2s*(KDR选择性变体)和Flt-1-sel(Flt-1选择性变体)从表达FLT-1的NIH3T3细胞竞争性取代125I-VEGF(1-165)所测量的配体对Flt-1的结合亲和力。该测定法在实施例7中详细描述。各点代表两次测定的平均值，估计误差小于该值的15％。
图7显示了鉴定各种VEGF丙氨酸取代变体在结合中的倍数下降表。如实施例8所述，用各种丙氨酸变体进行蛋白质ELISA。对各残基列出了变体的IC50与天然VEGF(1-109)的IC50的比率，代表与天然VEGF相比变体结合的倍数下降。天然VEGF(1-109)的IC50在括号中表示。以黑体字表示的残基用于产生Flt-1选择性变体。为了产生KDR选择性变体，将突变区分成所示的5组，使用前4组构建文库用于随后的噬菌体展示选择。对星号(*)标记的残基软随机化(soft randomized)为针对野生型的50％偏差(bias)，对两个星号标记的残基进行硬性随机化(hard randomized)。
图8A显示了放射免疫受体结合试验(RIA)的结果，其中显示了Flt-1选择性变体(“Flt-1-sel”)的KDR结合亲和力下降了至少470倍。还显示了天然VEGF(“WT VEGF)的结合亲和力。各点代表两次测定的平均值，估计误差小于该值的15％。
图8B显示了放射免疫受体结合试验(RIA)的结果，其中显示了Flt-1选择性变体(“Flt-1-sel”)对FLT-1的结合亲和力与天然VEGF(“WTVEGF)表现出的结合亲和力相似。各点代表两次测定的平均值，估计误差小于该值的15％。
图9显示了测量天然VEGF(“WT VEGF”)和Flt-1选择性变体(“Flt-1-sel”)诱导KDR磷酸化的能力的KIRA分析结果。
图10显示了测量天然VEGF(“WT VEGF”)和Flt-1选择性变体(“Flt-1-sel”)诱导HUVEC细胞增生的能力的HUVEC增生试验结果。各数据点是三次实验的平均值，估计的误差为10-20％。
图11显示了测定天然VEGF，LK-VRB-2s*(KDR选择性变体)，Flt-sel(Flt-1选择性变体)，和P1GF刺激人ASMC细胞的MMP-9分泌的能力的明胶酶谱分析结果。所示的酶谱是两个独立实验之一。倍数改变代表相对带密度。
图12A和12B显示了为测定天然VEGF(“WT VEGF”)，Flt-sel(Flt-1选择性变体)，和KDR选择性变体(“KDR-sel”)对MAP激酶的激活所进行的Westem印迹分析。该测定在实施例10中详细描述。
图13A和13B显示了为测定天然VEGF(“wt”或“VEGF”)，KDR选择性变体(“KDR-sel”)，和Flt-1选择性变体(“Flt-sel”)和KDR在PLC-γ和PI3’-激酶磷酸化中的作用所进行的Westerm印迹分析。该测定在实施例11中详细描述。
图14A和14B所示的柱状图显示了在改良的Boyden室中进行的HUVEC迁移试验的结果。图14A显示了以所示浓度的天然VEGF(“wt”)，Flt-选择性变体(“Flt-sel”)，和KDR选择性变体(“KDR-sel”)获得的HUVEC迁移。图14B显示了在应答天然VEGF(“VEGF”)时加入PI3’-激酶抑制剂(“LY”)对HUVEC迁移的不利影响的实验结果。实验进行一式三份，且误差线段代表标准误差。
图15A和15B显示了体内角膜囊血管形成试验的结果。图15A中的玻片显示了应答对照处理，天然VEGF(“VEGF”)，KDR-选择性变体和Flt-选择性变体时角膜血管形成程度的代表性例子。图15B显示了由对照处理，天然VEGF(“VEGF”)，KDR-选择性变体(“KDR-sel”)，Flt-1选择性变体(“Flt-sel”)，和P1GF引起的角膜血管形成的表面积定量分析。
本发明的详细描述A.定义本文使用的术语“VEGF”和“天然VEGF”是指Leung等，科学，2461306(1989)和Houck等，分子内分泌学，51806(1991)所述，(且已在图1A和1B中提供)的165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子和相关的121-，189-和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，及其天然存在的等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”和“天然VEGF”也用于指含有165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子的氨基酸8至109或1至109的截短形式。VEGF的任意这类形式在本申请中可用例如，“VEGF(8-109)”，“VEGF(1-109)”或“VEGF165或VEGF(1-165)”来表示。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置按天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中氨基酸位置17(甲硫氨酸)在天然VEGF中也是位置17(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF优选具有相当于天然VEGF的对KDR和FLT-1受体的结合亲和力。
本文使用的术语“VEGF变体”是指在天然VEGF序列中包括一个或多个氨基酸突变且对KDR受体或FLT-1受体具有选择性结合亲和力的VEGF多肽。在一个实施方案中，对KDR受体具有选择性结合亲和力的VEGF变体在天然VEGF序列的第17至25和/或63至66位中任一处有一个或多个氨基酸突变。任选的是，一个或多个氨基酸突变包括氨基酸取代。优选的KDR选择性VEGF变体包括一个或多个氨基酸突变并且对KDR受体表现出的结合亲和力等于或大于(≥)天然VEGF对KDR受体的结合亲和力，且更优选的是，VEGF变体表现出对FLT-1受体的结合亲和力小于(＜)天然VEGF对FLT-1表现出的结合亲和力。当该VEGF变体对KDR受体的结合亲和力与天然VEGF相比大约相等(不变)或更大(增加)，且该VEGF变体对FLT-1受体的结合亲和力与天然VEGF相比更小或几乎消失时，本文中认为该VEGF变体对KDR受体的结合亲和力是“选择性”的。本发明优选的KDR选择性VEGF变体对FLT-1受体的结合亲和力至少低10倍(与天然VEGF相比)，更优选的是，对FLT-1受体的结合亲和力至少低100倍(与天然VEGF相比)。用本领域已知的且在下面实施例中将进一步描述的ELISA，RIA，和/或BIAcore测定法可测定VEGF变体各自的结合亲和力。本发明优选的KDR选择性VEGF变体在反映诱导KDR受体磷酸化的能力的KIRA测定法(如实施例中所述)中也表现出活性。本发明优选的KDR选择性VEGF变体另外或任选可诱导内皮细胞增生(可用本领域已知方法，如实施例中的HUVEC增生测定法测定)。目前相信内皮细胞增生的诱导是经过KDR受体进行信号传递的结果。
在一个实施方案中，对FLT-1受体具有选择性结合亲和力的VEGF变体包括在天然VEGF序列的第43，46，79或83位中任一处有一个或多个氨基酸突变。任选的是，一个或多个氨基酸突变包括氨基酸取代，且优选的是，氨基酸取代成丙氨酸。优选的FLT-1选择性VEGF变体包括一个或多个氨基酸突变并对FLT-1受体表现出的结合亲和力等于或大于(≥)天然VEGF对FLT-1受体的结合亲和力，且更优选的是，该VEGF变体表现出对KDR受体的结合亲和力小于(＜)天然VEGF对KDR表现出的结合亲和力。当该VEGF变体对FLT-1受体的结合亲和力与天然VEGF相比大约相等(不变)或更大(增加)，且该VEGF变体对KDR受体的结合亲和力与天然VEGF相比更小或几乎消失时，本文中认为该VEGF变体对FLT-1受体的结合亲和力是“选择性”的。本发明优选的FLT-1选择性VEGF变体对KDR受体的结合亲和力至少低10倍(与天然VEGF相比)，更优选的是，对KDR受体的结合亲和力至少低100倍(与天然VEGF相比)。用本领域已知的且在下面实施例中将进一步描述的ELISA，RIA，和/或BIAcore测定法可测定该VEGF变体各自的结合亲和力。
为了速记本文所述的VEGF变体的名称，应注意数字是指沿推断的天然VEGF氨基酸序列的氨基酸残基的位置(参见Leung等，出处同上和Houck等，出处同上)。氨基酸标识符使用氨基酸的单字母代码，即Asp D 天冬氨酸Ile I异亮氨酸Thr T 苏氨酸 Leu L亮氨酸Ser S 丝氨酸 Tyr Y酪氨酸Glu E 谷氨酸 Phe F苯丙氨酸Pro P 脯氨酸 His H组氨酸Gly G 甘氨酸 His K赖氨酸Ala A 丙氨酸 Arg R精氨酸Cys C 半胱氨酸Trp W色氨酸Val V 缬氨酸 Gln Q谷氨酰胺Met M 甲硫氨酸Asn N天冬酰胺“可操作连接”指并列后能执行成份的正常功能。因此，编码序列“可操作连接”到调控序列上是指这样一种构象，即其中在这些序列的调控下可表达该编码序列且其中被连接的DNA序列是连续的，且对于分泌型先导序列，是连续的并在阅读相中。例如，如果DNA以参与多肽分泌的前蛋白的形式进行表达，那么前序列或分泌型先导序列的DNA与多肽的DNA可操作连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则它们是与编码序列可操作连接的；或如果核糖体结合位点的位置有助于翻译，则它与编码序列可操作连接。连接可在常规限制性位点进行。如果不存在该位点，可按常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头。
“调控序列”是指为了在具体宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必须的DNA序列。适用于原核生物的调控序列包括，例如，启动子，任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核生物利用启动子，多聚腺苷化信号，和增强子。
“表达系统”指含有可操作连接的目的编码序列和对照序列的DNA序列，使得用这些序列转化的宿主能产生所编码的蛋白质。为了实现转化，表达系统可包含在一个载体中；然而，也可将有关DNA整合进宿主染色体中。
本文所用的“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养物”可互换所用且所有这些定义包括后代。因此，“转化子”或“转化细胞”包括原代试验细胞和由其产生的培养物而不考虑转移的次数。还应明白所有后代在DNA成份上可以并不精确相同，因为可能出现故意的或无心的突变。应包括在原始转化细胞中筛选的具有相同功能的突变后代。如果意指不同的定义，从内容上将是清楚的。
“质粒”以前面的小写字母“p”和/或随后的大写字母和/或数字表示。本文的起始质粒是可买到的，在不受限制的基础上可公开获得的，或可用公开的方法从这类可获得的质粒构建的。另外，其它的等价质粒在本领域中是已知的且对普通技术人员而言是显而易见的。
本文所用的术语“VEGF受体”是指VEGF的细胞受体，一般是在血管内皮细胞上发现的细胞表面受体，及其保留结合VEGF之能力的片断和变体(例如，受体细胞外结构域的片断或截短形式)。VEGF受体的一个例子是fmz样酪氨酸激酶(FLT或FLT-1)，酪氨酸激酶家族的跨膜受体。本申请中所用的术语“FLT-1受体”指诸如DeVries等，科学，255989(1992)；和Shibuya等，癌基因，5519(1990)所述的VEGF受体。全长FLT-1受体包含胞外结构域，跨膜区，和具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞外结构域涉及VEGF的结合，而胞内结构域涉及信号转导。VEGF受体的另一例子是KDR受体(也称为FLK-1)。本申请所用的术语“KDR受体”指诸如Matthews等，美国国家科学院院报，889026(1991)；和Terman等，癌基因，61677(1991)；Terman等，生物化学和生物物理学研究通讯，1871579(1992)所述的VEGF受体。
“治疗”是指治疗性处理和预防性或防止性措施，其中目的是防止或延缓(缓解)靶向的病理学情况或疾病。需要治疗的个体包括已具有该疾病的个体以及倾向于具有该疾病的个体或需要防止该疾病的个体。
“慢性”用药指相对于急性方式以连续的方式施用药剂，以便在更长的时间段内维持起始治疗效果(活性)。间歇性用药是指不中断的不连续进行且具有周期性特点的治疗。
作为治疗目标的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类，家养和农场动物，和动物园，运动场或宠物动物，例如狗，猫，奶牛，马，绵羊或猪。优选的是，哺乳动物是人类。
与一种或多种其它治疗剂“组合”用药包括同时(并存)和以任意顺序连续用药。
B.方法和组合物1.VEGF变体的制备经过在VEGF DNA中进行突变可制备VEGF的氨基酸序列变体。例如，所述变体包括在Leung等，出处同上和Houck等，出处同上所示的氨基酸序列内的残基缺失，插入或取代。可对缺失，插入和取代作出任意组合以获得具有所需活性的最终构建体。显然，在编码变体的DNA中进行的突变不必将该序列放在阅读框外且优选不构建能产生二级mRNA结构的互补区域[见EP75444A]。
任选的是，经过在编码天然VEGF的DNA中进行核苷酸定点诱变或噬菌体展示技术，从而产生编码变体的DNA并随后在重组细胞培养物中表达该DNA可制备VEGF变体。
尽管导入氨基酸序列变异的位点是预定的，但突变本身不必预定。例如，为了最优化给定位点的诱变效果，可在靶密码子或靶区域进行随机诱变并对表达的VEGF变体筛选所需活性的最佳组合。在具有已知序列的DNA的预定位点作出取代突变的技术是熟知的，例如，定点诱变。
优选经过诸如实施例1所述的噬菌体展示技术实现本文所述的VEGF变体的制备。
选出所述克隆后，可取出突变的蛋白质区域并放入用于蛋白质生产的合适载体中，一般是可用于转化合适宿主的表达载体类型。
氨基酸序列缺失的范围一般从1至30个残基，更优选的是1至10个残基，且一般是连续的。
氨基酸序列插入包括一个残基到基本上不限长度的多肽融合到氨基和/或羧基末端以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。序列内插入(即，天然VEGF序列内插入)的范围一般是从1到10个残基，优选1到5个残基。末端插入的例子包括对宿主细胞而言为异源性的或者同源性的信号序列融合到N-末端以利于从重组宿主中分泌。
其它的VEGF变体是天然VEGF中至少一个氨基酸残基被去掉且在其位置插入一个不同的残基的变体。该取代可按照表1所示制备。
表 1原残基 取代举例Ala(A) gly；serArg(R) lysAsn(N) gln；hisAsp(D) gluCys(C) serGln(Q) asnGlu(E) aspGly(G) ala；proHis(H) asn；glnIle(I) leu；valLeu(L) ile；valLys(K) arg；gln；gluMet(M) leu；tyr；ilePhe(F) met；leu；tyrSer(S) thrThr(T) serTrp(W) tyrTyr(Y) trp；pheVal(V) ile；leu经过选择比表1中所示更不保守的取代可产生功能或免疫学同一性的改变，即，选择在其对维持(a)取代区域多肽骨架的结构，例如，折叠或螺旋构象，(b)靶位点的分子电荷或疏水性，或(c)侧链的大小的影响上区别更明显的残基。一般预期在VEGF变体特性中产生最大改变的取代是(a)甘氨酸和/或脯氨酸(P)被另一氨基酸取代或被缺失或插入；(b)亲水残基，例如，丝氨酰基或苏氨酰基取代疏水残基，例如，亮氨酰基，异亮氨酰基，苯丙氨酰基，缬氨酰基或丙氨酰基或被其取代；(c)半胱氨酸残基取代任意其它残基或被其取代；(d)带正电荷侧链的残基，例如，赖氨酰基，精氨酰基或组氨酰基取代带负电荷的残基，例如，谷氨酰基或天冬氨酰基或者被其取代；(e)带负电荷侧链的残基取代带正电荷的残基或者被其取代；或(f)具有大型侧链的残基，例如，苯丙氨酸被不具有这类侧链的残基，例如，甘氨酸取代或者被其取代。
本领域的技术人员使用常规筛选试验可容易地评估取代，缺失或插入的效果。例如，可在重组细胞培养物中表达，且任选从细胞培养物中纯化噬菌体展示选择的VEGF变体。然后可评估VEGF变体的KDR或FLT-1受体结合亲和力和其它生物学活性，例如本申请中所公开的那些生物学活性。可在用于所需特征的合适筛选试验中筛选细胞裂解产物或纯化的VEGF变体的结合特性或活性。例如，与天然VEGF相比，VEGF变体的免疫学特征，例如，对给定抗体的亲和力的改变可能是所需要的。可用按照本领域的已知技术进行的竞争性免疫测定来测量该改变。可用本领域已知的且在下面实施例中进一步描述的ELISA，RIA和/或BIAcore试验来测定VEGF变体各自的受体结合亲和力。本发明优选的VEGF变体在反映诱导KDR受体磷酸化能力的KIRA测定(例如实施例中所述)中也显示出活性。本发明优选的VEGF变体另外或者任选诱导内皮细胞增生(可用本领域已知方法，例如实施例中的HUVEC增生试验测定)。
用本领域已知的技术，例如重组方法可制备VEGF变体。这些方法中使用的分离的DNA在本文中理解为具有或不含3’和/或5’-侧翼区的化学合成的DNA，cDNA，染色体或者染色体外DNA。优选的是，经过在重组细胞培养物中合成可制备本文的VEGF变体。
对于这类合成，首先必须获得编码VEGF或者VEGF变体的核酸。编码VEGF分子的DNA可从牛垂体滤泡细胞获得，方法是(a)从这些细胞制备cDNA文库，(b)用编码VEGF或其片断的标记DNA(长度达到或者超过100个碱基对)进行杂交分析以检测文库中含有同源序列的克隆，和(c)以限制性酶分析和核酸测序来分析克隆以鉴定全长克隆。如果在cDNA文库中不存在全长克隆，那么可使用本文首次公开的核酸序列信息从各种克隆回收合适的片断并在这些克隆共有的限制性位点连接以装配编码VEGF的全长克隆。另外，基因组文库可提供所需的DNA。
一旦从文库中鉴定并分离出该DNA，将它连接进可复制载体中用于进一步克隆或者用于表达。
在一个重组表达系统的例子中，在经过用含有编码VEGF的DNA的表达载体转化的细胞系统中表达编码VEGF的基因。优选转化能实现该方法的宿主细胞以便在培养基或宿主细胞周质中获得该VEGF，即获得分泌分子。
“转染”是指表达载体被宿主细胞吸收，而不论事实上是否表达任何编码序列。许多转染方法对于普通技术人员而言是已知的。例如，CaPO4和电穿孔。当在宿主细胞内出现该载体的任何作用迹象时一般认为转染成功。
“转化”是指作为染色体外成份或者经过染色体整合将DNA导入生物以便该DNA能够复制。根据所用的宿主细胞，使用适合于该细胞的标准技术进行转化。Cohen，美国国家科学院院报，692110(1972)和Mandel等，分子生物学杂志，53154(1970)所述的采用氯化钙的钙处理一般用于原核或其它含有大量细胞壁障碍的细胞。对于没有该细胞壁的哺乳动物细胞，优选Graham和van der Eb，病毒学，52456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。Axel在1983年8月16日出版的美国专利号4399216中已经描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的一般情况。转化进酵母一般按照Van Solingen等，细菌杂志，130946(1977)和Hsiao等，美国国家科学院院报，763829(1979)的方法进行。然而，也可使用诸如经过核注射或经过原生质融合将DNA导入细胞的其它方法。
本文公开的载体和方法适合于在原核和真核生物大范围内的宿主细胞中使用。
当然，一般来说，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)是特别有用的。可使用的其它微生物菌株包括大肠杆菌菌株，例如大肠杆菌B和大肠杆菌X1776(ATCC31537)。当然，这些例子是用于说明而不是限制。
原核生物也可用于表达。可使用上述菌株，以及大肠杆菌菌株W3110(F-，λ-，原养型，ATCC 27,325)，K5772(ATCC 53635)，和SR101，诸如枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌和诸如鼠伤寒沙门氏菌或粘质沙雷氏菌等肠杆菌科其它细菌，和各种假单胞菌属的种。
一般来说，含有来自与宿主细胞相适合的种类的复制子和调控序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体一般携带复制位点以及可在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌一般使用pBR322，一种来自大肠杆菌种类的质粒进行转化[参见，例如，Bolivar等，基因，295(1977)]。pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性基因且因此提供了鉴定转化细胞的简便方法。pBR322质粒，或其它微生物质粒或噬菌体也必须含有，或被修饰成含有微生物用于其自身蛋白质表达的启动子。
最常用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统[Chang等，自然，375615(1978)；Itakura等，科学，1981056(1977)；Goeddel等，自然，281544(1979)]及色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel等，核酸研究，84057(1980)；EPO申请公开号0036776]。尽管这些是最常用的，已发现并使用了其它的微生物启动子，并且已公开了其核苷酸序列的详情，技术人员能够将它们与质粒载体可操作连接[参见，例如，Siebenlist等，细胞，20269(1980)]。
除了原核生物外，也可使用真核微生物，例如酵母培养物。尽管许多其它菌株通常是可得到的，但酿酒酵母，或常见的面包酵母在真核微生物中是最常用的。为了在糖酵母属中表达，常用质粒YRp7[Stinchcomb等，自然，28239(1979)；Kingsman等，基因，7141(1979)；tschemper等，基因，10157(1980)]。该质粒已含有trp1基因，该基因可以为在色氨酸中缺乏生长能力的酵母突变菌株，例如，ATCC 44076或PEP4-1[Jones，遗传学，8512(1977)]提供选择标记。trp1损伤的出现作为酵母宿主细胞基因组的一个特征提供了经过在不含色氨酸下生长来检测转化的有效环境。
酵母载体中合适的启动序列包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等，生物学化学杂志，2552073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，酶研究进展杂志，7149(1968)；Holland等，生物化学，174900(1978)]，例如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子。在构建合适的表达质粒时，与这些基因相关的终止序列也连接进表达载体中需要表达的序列的3’端以提供mRNA的多聚腺苷化和终止。具有受生长条件控制的附加转录优势的其它启动子是乙醇脱氢酶2，同种细胞色素(isocytochrome)C，酸性磷酸酶，与氮代谢相关的降解酶和前述甘油醛-3-磷酸脱氢酶，及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。含有酵母适用性启动子，复制原点和终止序列的任意质粒载体都是合适的。
除了微生物外，来自多细胞生物的细胞培养物也可用作宿主。原则上，任何这类细胞培养物都是可行的，无论来自脊椎动物或是无脊椎动物的培养物。然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞且最近几年在培养物(组织培养物)中脊椎动物细胞的繁殖已成了常规方法[组织培养，学术出版社，Kruse和Patterson，编辑(1973)]。这类有用的宿主细胞系的例子是VERO和Hela细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，和W138，BHK，COS-7，293，和MDCK细胞系。这类细胞的表达载体通常包括(如果需要)复制原点，位于待表达的基因之前的启动子，以及任意必须的核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷化位点和转录终止子序列。
为用于哺乳动物细胞，通常由病毒材料提供对表达载体的调控功能。例如，常用的启动子来自多瘤病毒，腺病毒2，最常见的来自猴病毒40(SV40)。特别有用的是SV40病毒的早期和晚期启动子，因为两者都容易从病毒中作为也含有SV40病毒复制原点的片断获得[Fiers等，自然，273113(1978)]。也可使用更小或更大的SV40片断，只要它包括从位于病毒复制原点上的HindIII位点到BglI位点的大约250-bp的序列。而且，还可以且通常需要使用正常情况下与目的基因序列相关的启动子或调控序列，前提是该调控序列与宿主细胞系统相容。
经过构建包括异源性原点，例如可来自SV40或其它病毒(例如，多瘤病毒，腺病毒，VSV，BPV)来源的原点的载体可提供复制原点，或者由宿主细胞染色体复制机制提供复制原点。如果载体整合进宿主细胞染色体，后者通常就足够。
细胞培养物可产生满意量的蛋白质，然而，使用第二编码序列的设计可用于进一步增强生产水平。第二编码序列包括二氢叶酸还原酶(DHFR)，它受诸如氨甲蝶呤(MTX)的外部控制参数的影响，因此允许经过控制氨甲蝶呤的浓度来控制表达。
为了用本发明的含有编码VEGF和DHFR蛋白质两者的DNA序列的载体进行转染，在选择优选的宿主细胞时，合适的情况是根据所用的DHFR蛋白质的类型来选择宿主。如果使用野生型DHFR蛋白质，优选选择DHFR缺陷型宿主细胞，从而允许使用DHFR编码序列作为在缺乏次黄嘌呤，甘氨酸和胸苷的选择培养基中成功转染的标记。在这种情况中合适的宿主细胞是按Urlaub和Chasin，美国国家科学院院报，774216(1980)所述制备和繁殖的DHFR活性缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
另一方面，如果对MTX具有低结合亲和力的DHFR蛋白质用作调控序列，则不必使用DHFR缺陷型细胞。由于突变型DHFR对氨甲蝶呤有抗性，可使用含有MTX的培养基作为选择工具，前提是宿主细胞本身是氨甲蝶呤敏感性。能吸收MTX的大多数真核细胞表现出氨甲蝶呤敏感性。一个这类有用的细胞系是一种CHO细胞系，CHO-K1(ATCC CCL61)。
采用标准连接技术构建含有所需编码序列和调控序列的合适载体。裂解分离的质粒或DNA片断，剪切并以所需形式再连接以制备所需的质粒。
如果需要平端，用10单位的聚合酶I(Klenow)在15℃下处理制剂15分钟，酚-氯仿提取，并乙醇沉淀。
裂解片断的大小分离可使用，例如，Goeddel等，核酸研究，84057(1980)所述的6％聚丙烯酰胺凝胶进行。
为了证实在质粒中构建了正确的序列，一般使用连接混合物转化大肠杆菌K12菌株294(ATCC 31446)或其它合适的大肠杆菌菌株，且如果合适，以氨苄青霉素或四环素抗性选择成功的转化子。按Messing等，核酸研究，9309(1981)的方法或Maxam等，酶学方法，65499(1980)的方法从转化子制备质粒并经过限制性酶切图谱和/或DNA测序进行分析。
DNA导入哺乳动物细胞宿主并在培养基中选择稳定转染子后，经过在大约20000-500000nM浓度的氨甲蝶呤(MTX，DHFR活性的竞争性抑制剂)存在下培养宿主细胞培养物来实现DHFR-蛋白质-编码序列的扩增。当然，浓度的有效范围高度依赖于DHFR基因的性质和宿主的特征。显而易见，不能确定一般定义的上限和下限。也可使用抑制DHFR的其它叶酸类似物或其它化合物的合适浓度。然而，MTX本身是方便，容易获得和有效的。
2.VEGF变体的共价修饰本发明的VEGF也可包含进一步的修饰。例子包括对一个或多个氨基酸残基的共价修饰。例如，半胱氨酰残基可与卤代乙酸(和相应的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反应以产生羧甲基或羧基酰胺甲基衍生物。半胱氨酰残基经过与溴三氟丙酮；β-溴-(5-imidozoyl)丙酸；氯乙酰磷酸；N-烷基马来酰亚胺；3-硝基-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基二硫化物；对氯汞苯甲酸；2-氯汞-4-硝基苯酚；或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑反应也可衍化。
另一例子包括使组氨酰残基与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反应而衍生化。对-溴苯甲酰甲基溴化物，一种优选在0.1M二甲胂酸钠pH6.0下进行的反应也是有用的。
赖氨酰残基和氨基末端残基可与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。用这些试剂衍化具有逆转赖氨酰残基的电荷的效果。适于衍化含β-氨基的残基的其它试剂包括诸如甲基吡啶甲酰亚氨酸酯(picolinimidate)等亚氨酸酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯氢硼化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和与乙醛酸的由转氨酶催化的反应。
精氨酰残基经过与选自苯甲酰甲醛，2，3-丁二酮，1，2-环己二酮，和茚三酮的一种或几种常规试剂反应可修饰。这些试剂也可用于修饰赖氨酸的ε-氨基。精氨酸残基的衍生化应在碱性条件下进行，因为胍官能团具有高pka。
酪氨酰残基本身的特异性修饰已被广泛研究，尤其对于经过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰残基特别感兴趣。最常见的是，使用N-acetylimidizol和四硝基甲烷分别形成O-乙酰酪氨酰类和3-硝基衍生物。经过，例如，使用下文所述的氯胺T方法，使用125I或131I可对酪氨酰残基进行碘标记，从而制备标记的蛋白质用于放射免疫测定。
经过与诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基))碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺等碳二亚胺(R’-N-C-N-R’)反应可选择性地修饰羧基侧基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)。而且，经过与铵离子反应可将天冬氨酰基和谷氨酰残基转变成天冬酰胺酰基和谷酰胺酰残基。
用双功能试剂进行的衍生化可将VEGF变体有效交联到不溶于水的支持基质或表面上。常用的交联剂包括，例如，1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮水杨酸形成的酯，同型双功能亚氨酸酯，包括双琥珀酰亚胺基酯如3，3’-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸)，和双功能马来酰亚胺如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷。诸如甲基-3-[(p-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺等衍生化试剂产生可光活化的中间体，其在有光的条件下能形成交联。另外，诸如溴化氰激活型碳水化合物等反应性不溶于水的基质和在美国专利号3969287；3691016；4195128；4247642；4229537和4330440中所述的反应性底物可用于蛋白质固定化。
谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基通常被去酰胺化以形成相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。另外，这些残基可在中度酸性条件下去酰胺化。这些残基的任一形式都落在本发明的范围内。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸，精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化[Creighton，蛋白质结构和分子特征，79-86(WH.Freeman&Co.，San Francisco(1983))]，N-末端胺的乙酰化，和有时C-末端羧基的酰胺化。
其它修饰包括将VEGF或VEGF变体(或VEGF拮抗剂)连接或融合到诸如聚乙二醇等非蛋白类聚合物上。这种使PEG连接蛋白质的方法在本领域是已知的。
VEGF变体氨基酸序列可含有至少一个具有通过N-连接被糖基化的潜力且在天然VEGF中通常不被糖基化的氨基酸序列。
在变体中导入N-连接的糖基化位点需要具有通式天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸的三肽序列，其中天冬酰胺是受体且X是除了可阻止糖基化的脯氨酸外的20个遗传编码的氨基酸中的任何一个。[参见Struck和Lennarz，糖蛋白和蛋白聚糖的生物化学35(Lennarz编辑，Plenum出版社(1980))，Marshall，生物化学协会专题论文集，4017(1974)；和Winzler，激素蛋白和肽，1-15(Li编辑，纽约学术出版社(1973))]。本文的氨基酸序列变体可经过用合适的氨基酸取代合适位点的氨基酸进行修饰以实现糖基化。
如果采用O-连接的糖基化，O-糖苷键在动物细胞中出现在N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，或木糖与数种羟基氨基酸之一，最常见丝氨酸或苏氨酸，但有时是位于该分子中合适区域的5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸残基之间。
哺乳动物产生的蛋白质的糖基化形式在《血浆蛋白质结构，功能和遗传控制》271-315(Putnam编辑，第二版，纽约学术出版社(1984))中详细描述。在该章中，讨论了天冬酰胺连接的寡糖，包括将它们再分成至少三组复合物高甘露糖，杂合结构，以及O-糖苷连接的寡糖。
使用例如，Aplin和Wriston在CRC Crit.Rev.Biochem.259-306(1981)中所述的各种活化基团可实现将糖苷经化学和/或酶促偶联到蛋白质上。化学偶联技术的优势在于它们相对简单且不需天然O-和N-连接的糖基化所需的复杂的酶促机制。根据所用的偶联方式，可将糖附着到(a)精氨酸或组氨酸，(b)游离羧基，例如谷氨酸或天冬氨酸的游离羧基，(c)游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基，例如丝氨酸，苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基，(e)芳香残基，例如苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸的芳香残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基上。这些方法在1987年9月11日公开的PCTWO87/05330中有更充分的描述。
酵母产生的蛋白质的糖基化形式在Tanner和Lehle，生物化学和生物物理学学报，906(1)81-99(1987)和Kukuruzinska等，生物化学年鉴，56915-944(1987)中详细描述。
尽管天然VEGF的糖基化对生物活性不是必须的[Walter等，实验室考察，74546(1996)]，但如果需要，可使用上述方法改变VEGF变体的糖基化。
3.治疗和诊断方法本发明还提供了使用所公开的VEGF变体的方法。所述方法包括治疗方法，例如诱导血管形成或血管发生的方法。所述方法还涉及对血管网的创伤的治疗，因为围绕伤口的血管内皮细胞会增生。可这样治疗的这类创伤的例子包括，但不限于，手术切口，特别是涉及心脏的手术切口，伤口，包括撕裂伤，切口，和血管穿刺，涉及血管内皮的表面溃疡，例如糖尿病性，血友病性和肿胀性溃疡。预期可采用对KDR受体具有选择性结合亲和力的优选VEGF变体，其中需要实现KDR受体激活但避免伴随FLT-1受体激活的潜在副作用。同样，可采用对FLT-1受体具有选择性结合亲和力的优选VEGF变体，其中需要实现FLT-1受体激活但避免伴随KDR受体激活的潜在副作用。
可配制VEGF变体并按照良好的医学实践方式考虑所要治疗的具体病症，个体病人的状况，VEGF变体的传递位点，用药方法和开业医生已知的其它因素后进行用药。“有效量”的VEGF变体包括防止，减小其恶化，缓解或治愈所要治疗的病症或其症状的量。
经过将具有所需纯度的VEGF变体与生理学上可接受的载体，赋形剂或稳定剂混合可配制VEGF变体用于贮存或用药。例如，在Remington’s制药科学，第16版，1980，Mack出版公司，Oslo等编辑，中描述了合适的载体及其包含其它人类蛋白质，例如人血清白蛋白的配制品。一般来说，在配制品中使用适量的制药上可接受的盐使配制品等渗。载体的例子包括诸如盐水，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液等缓冲液。溶液的pH优选从大约5.0到大约8.0。例如，如果VEGF变体是水溶性的，可在诸如磷酸盐或其它有机酸盐等缓冲液中在大约7.0至8.0的pH下配制。如果VEGF变体仅部分可溶于水，经过将它与诸如吐温，Pluronics，或PEG等非离子表面活性剂，例如吐温80以0.04-0.05％(w/v)的量进行配制以增加其可溶性可将其制备成微乳状液。
其它载体包括控释制剂，它包括形成微囊颗粒和可植入物。控释制剂的例子包括，例如，固体疏水性聚合物的半渗透性基质，该基质以成形物的形式存在，例如，膜，脂质体或微粒。为了制备控释VEGF变体组合物，优选将VEGF变体掺入生物可降解的基质或微囊中。用于该目的的合适材料是聚交酯，尽管也可使用聚-(β-羟基羧酸)，例如聚-D-(-)-3-羟基丁酸[EP133988A]的聚合物。其它的生物可降解的聚合物，例如，聚内酯，聚缩醛，聚原酸酯，或聚原碳酸酯也是适用的。
对于控释组合物的例子，可参见美国专利号3773919，EP58481A，美国专利号3887699，EP158277A，加拿大专利号1176565，Sidman等，生物多聚体，22547(1983)，和Langer等，化学技术，1298(1982)。
对于本领域的技术人员而言显而易见的是，根据例如，用药途径和所施用的VEGF变体的浓度，某些载体可能是更优选的。
可任选加入其它成份，例如抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(不超过10个残基)多肽，如聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；和糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇。赋形剂，载体，稳定剂或其它添加剂的使用可导致形成VEGF变体的盐。
当选择载体，赋形剂，稳定剂或其它添加剂时，选择的化合物和相应的降解产物应是无毒的且避免加重所治疗的病症和/或且症状。经过在靶疾病的动物模型中，或者如果不能得到该模型，可在正常动物中进行常规筛选可确定这点。
用于治疗性用药的VEGF变体应是无菌的。通过除菌滤膜(例如，0.2微米膜)进行过滤可实现无菌。VEGF变体一般以冻干形式或作为水溶液存贮。VEGF变体组合物的pH一般是大约5.0至8.0，尽管更高或更低的pH值在某些情况下也是合适的。
对哺乳动物的用药可经过注射(例如，静脉内，腹膜内，皮下，肌肉内)或经过诸如确保以有效形式传递进血流的吸入或输注等其它方法完成。如果VEGF变体经肠胃外途径使用，含VEGF变体的治疗性组合物一般放入具有无菌输入口的容器中，例如，静脉溶液袋或者具有可被皮下注射针头穿刺的瓶塞的小瓶。
一般来说，如果条件许可，可配制并施用定点传递的VEGF变体。这在有伤口和溃疡的情况下较方便。
当进行局部用药时，VEGF变体适合于与诸如载体，佐剂，稳定剂或赋形剂的添加剂组合。如上所述，当选择添加剂用于与VEGF变体混合时，添加剂应是药用上可接受的且对于其目的用药是有效的。而且，添加剂不应影响VEGF变体的活性。合适的局部配制品的例子包括软膏，乳剂，凝胶，或悬液，含有或不含纯化的胶原蛋白。组合物也可浸渗进皮肤膏药，橡皮膏和绷带中，优选以液体或半液体的形式浸渗。
经过将VEGF变体与诸如纤维素衍生物等水溶性多糖或诸如聚乙二醇等合成聚合物混合可制备具有所需粘度的凝胶配制品。用于多糖和聚乙二醇的术语“水溶性”是指包括胶体溶液和分散液。例如，一般来说，纤维素衍生物的可溶性可用醚基团的取代程度来测定，本文有用的稳定衍生物应在纤维素链的每个脱水葡萄糖单位具有足够量的该醚基团以使得该衍生物具有水溶性。一般每个脱水葡萄糖单位上至少0.35个醚基团的醚取代程度就足够。另外，纤维素衍生物可以是碱金属盐的形式，例如，Li，Na，K，或Cs盐。
合适的多糖的例子包括，例如，纤维素衍生物，如醚化的纤维素衍生物，包括烷基纤维素，羟基烷基纤维素，和烷基羟基烷基纤维素，例如，甲基纤维素，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素；淀粉和分级淀粉；琼脂；藻酸和藻酸盐；阿拉伯胶；支链淀粉；琼脂糖；角叉藻聚糖；葡聚糖；糊精；果聚糖；菊粉；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖；脱乙酰壳多糖；糖原；萄聚糖；和合成性生物多聚体；以及胶，例如黄原胶；瓜尔豆胶；槐豆荚胶；阿拉伯胶；西黄蓍胶；和刺梧桐树胶；及其衍生物和混合物。本文优选的胶化剂是对生物学系统为惰性的，无毒的，制备简单的，且不太流动或粘滞的胶化剂，且不会使其中的VEGF变体去稳定。
优选的多糖是醚化的纤维素衍生物，更优选的是充分鉴定，纯化并在USP中列出的多糖，例如，甲基纤维素和羟烷基纤维素衍生物如羟丙基纤维素，羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。本文最优选的是甲基纤维素。例如，含有甲基纤维素的凝胶配制品优选包括大约2-5％的甲基纤维素和每毫升凝胶300-1000mg的VEGF变体。更优选的是，凝胶配制品含有大约3％的甲基纤维素。
用于凝胶配制的聚乙二醇一般是低和高分子量聚乙二醇的混合物以获得适当的粘度。例如，分子量400-600与分子量1500的聚乙二醇混合物当以合适的比率混合而获得药膏时对该目的是有效的。
所用的剂量依赖于上述因素。作为一般建议，可配制VEGF变体并以能在组织中建立超过大约0.1ng/cc到有效但不过分有毒的最大量的VEGF变体水平的剂量传递给靶位点或组织。如果可能，应经过连续输注，持续释放，局部施用或以按经验确定的频率进行注射来维持组织内浓度。
组合VEGF变体疗法与其它新的或常规疗法(例如，本领域已知的生长因子，如aFGF，bFGF，HGF，PDGF，IGF，NGF，合成类固醇，EGF或TGF-β)以增强包括天然VEGF在内的任意生长因子在促进细胞增生和修复中的活性均在其范围内。这种共同治疗的药品本身不必包含在本发明的组合物中，尽管如果该药品是蛋白类时这样会很方便。该混合物与单独使用的VEGF变体以相同的方式且用于例如，相同的目的进行适当的用药。
有效剂量和用药程序可凭经验确定，且作出该决定在本领域的技术人员能力范围内。
本发明的VEGF变体在诊断方法和检测中也具有实用性。例如，VEGF变体可用于诊断试验以检测细胞和组织中KRD受体的表达或存在。可使用本领域已知的各种诊断试验技术，例如体内成像试验，体外竞争性结合试验，直接或间接夹心试验和在多相或均相中进行的免疫沉淀试验。用于所述试验的VEGF变体可用可检测组分进行标记。可检测组分应能够产生可直接或间接检测的信号。例如，可检测组分可以是放射性同位素，如，3H，14C，32P，35S或125I，荧光或化学发光的化合物，如异硫氰酸荧光素，罗丹明或萤光素，或酶，如碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或辣根过氧化物酶。可采用本领域已知的任何方法将VEGF变体与可检测组分偶联。
VEGF变体也可用于从重组细胞培养物或天然来源亲和纯化KDR受体或Flt-1受体。使用本领域已知的方法可将VEGF变体固定在合适的支持物，如树脂或滤纸上。然后可将固定的VEGF变体与含KDR受体或Flt-1受体的样品接触，随后用合适的溶剂洗涤支持物，除了与VEGF变体结合的KDR受体或Flt-1受体外，该溶剂基本上去掉样品中所有的物质。如果需要，可用另一合适的溶剂洗涤支持物，这种溶剂可从VEGF变体上释放出KDR受体或Flt-1受体。
4.制造的商品本申请还提供了制造的商品和试剂盒。制造的商品，例如用于诊断试验或本文所述病症治疗的含有VEGF变体的试剂盒包括至少一个容器和一个标记。合适的容器包括，例如，瓶子，小瓶，注射器和试管。容器可用诸如玻璃或塑料等各种材料制成。该容器容纳用于诊断或治疗病症的组合物且具有无菌输出口(例如，容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的瓶塞的小瓶)。组合物中的活性试剂是VEGF变体。容器上的或与之相联的标记表明该组合物用于诊断目的或治疗选定的病症。制造的商品还可包括容纳了药用上可接受的缓冲液，例如，磷酸盐缓冲液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液的第二容器。它还可包括从商业和用户的角度所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，滤纸，针头，注射器和带有使用说明的包装插页。制造的商品也可包括含有上述另一活性试剂的第二或第三容器。
提供下面的实施例仅用作说明性的目的而不打算以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引证的所有专利和参考文献以其全文引入本文以供参考。
实施例实施例中涉及的商业上可获得的试剂按照厂商的说明书使用，除非另有说明。下面实施例，和整个说明书中以ATCC保藏号限定的细胞的来源是美国典型培养物保藏中心，Manassas，Virginia。
实施例 1KDR-特异性VEGF变体的筛选为了产生KDR-特异性变体，构建了两个噬菌体文库，其中随机突变了对Flt-1结合很重要但对KDR结合不重要的VEGF(1-109)残基。
噬菌粒的构建为了构建噬菌体文库，首先产生具有编码VEGF残基1-109的cDNA的噬菌粒载体。使用允许随后将Nsi/Xba I限制性片断连接进噬菌粒载体phGHam-g3(Genentech，Inc.)的引物，经过对编码VEGF残基1-109的cDNA进行PCR扩增产生噬菌粒载体pB2105(Genentech，Inc.)。这使得在紧靠残基109之后导入一个琥珀密码子并将VEGF1-109cDNA融合到含有残基249到406的gIII位点的C末端一半上。
在一个文库中，VEGF1-109的位置18，21，22和25允许所有可能的残基组合(其需借助将靶密码子改变成NNS序列的寡核苷酸，其中N＝G，A，T，或C，S＝C或G)，位置17允许有40％的概率发生改变(对靶密码子中每个碱基而言有70％的概率为野生型，其它三个碱基类型各10％的概率)。
使用下面的寡核苷酸将靶密码子改变成NNS序列L-528CAC GAA GTG GTG AAG TTC NNS GAT GTC NNS NNSCGC AGC NNS TGC CAT CCA ATC GAG(SEQ ID NO1)L-530GGG GGC TGC TGC AAT NNS GAG NNS NNS GAG TGT GTGCCC ACT(SEQ ID NO2)在第二个文库中，VEGF 1-109在位置63，65和66允许所有可能的残基组合，在位置64允许有40％的概率发生改变。
在第三个文库中，VEGF(1-109)在位置47和48允许所有可能的残基组合，在位置43和46允许有50％的概率发生改变。在第四个文库中，VEGF(1-109)在位置63，65和66允许所有可能的残基组合，在位置64允许有50％的概率发生改变。
为了产生KDR-选择性变体，可将突变区分成所示的5组，使用前四组构建文库，该文库用于随后的噬菌体展示筛选。用星号(*)标记的残基经“软随机化”为50％偏向野生型，用两个星号标记的残基经“硬随机化”(见下文图7)。
异源双链DNA的合成根据从Kunkel等，酶学方法，204125-139(1991)修改的方法合成异源双链DNA。通过该方法，将诱变的寡核苷酸插入具有生物学活性的共价闭环DNA(CCC-DNA)分子中。按下述步骤实现该方法。
首先，将上述寡核苷酸5’磷酸化。这可通过在eppendof管中将2μg寡核苷酸，2μl10xTM缓冲液(500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH7.5)，2μl10mM ATP和1μl100mM DTT混合，然后加水至20μl的总体积而实现。向该混合物中加入20单位的T4多核苷酸激酶(Weiss单位)并在37℃下温育1小时。
接着，使每种5’磷酸化的寡核苷酸与噬菌粒模板(从dut/ung-大肠杆菌菌株CJ-236纯化的单链DNA)退火。这可通过首先混合1μg单链DNA模板，0.12μg磷酸化的寡核苷酸和2.5μl10xTM缓冲液(500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH7.5)，然后加水至总体积25μl而实现。DNA的量使得寡核苷酸与模板的摩尔比率为3∶1，其中假定寡核苷酸与模板长度的比率是1∶100。混合物在90℃温育2分钟，然后在50℃温育3分钟，然后在20℃温育5分钟。
然后向已退火的混合物中加入下列试剂1μl10mMATP，1μl25mMdNTPs，1.5μl100 mMDTT，3单位的T4 DNA连接酶，和3单位的T7DNA聚合酶，使每种5’磷酸化的寡核苷酸酶促延伸并连接以形成CCC-DNA分子。然后将混合物在20℃下温育至少3小时。
经过乙醇沉淀纯化DNA并重悬于15μl水中。
大肠杆菌电穿孔在称为大肠杆菌XL1-blue(Stratagene，LaJolla，CA)的大肠杆菌抑制型菌株中经过大肠杆菌电穿孔产生文库噬菌体。为进行电穿孔，首先将纯化的异源双链DNA在0.2-cm缺口的电穿孔杯中在冰上冷冻，将100μl等分试样的电感受态大肠杆菌XL1-blue在冰上解冻。将大肠杆菌细胞加入所述DNA中并吸取几次以混合。
将混合物转移到杯中并使用基因脉冲仪(Bio-rad，Hercules，CA)在如下条件2.5kv电场强度，200欧姆电阻和25mF电容下进行电穿孔。随后立即加入1mlSOC培养基(5g细菌用酵母提取物，20g细菌用胰蛋白胨，0.5gNaCl，0.2g KCI；加水至1升并用NaOH调至pH7.0；高压灭菌；然后加入5mL已高压灭菌的2M MgCl2和20mL滤膜除菌的1M葡萄糖)并将混合物转移到无菌培养管中37℃下振荡培养30分钟。
为了测定文库的多样性，将系列稀释液涂布在2YT(10g细菌用酵母抽提物，16g细菌用胰蛋白胨，5gNaCl；加水至1升并用NaOH调pH至7.0；高压灭菌)平板上(补充了50μg/ml氨苄青霉素)。另外，将培养物转移到含有25ml 2YT，25mg/ml氨苄青霉素，M13-VCS(1010pfu/mL)(Stratagene，LaJolla，CA)的250ml带档板的摇瓶中并在37℃下振荡培养过夜。
然后将培养物在Sorvall GSA离心机(16000g)中以10krpm，2℃离心10分钟。将上清转移到新试管中并加入1/5体积的PEG-NaCl溶液(200g/lPEG-8000，146g/lNaCl；高压灭菌)以沉淀噬菌体。上清/PEG-NaCl溶液在室温下培养5分钟并再次离心以获得噬菌体沉淀。
倾析并弃去上清。再次简短离心噬菌体沉淀并去掉残留的上清。噬菌体沉淀重悬于1/20体积的PBT缓冲液(PBS，0.2％BSA，0.1％吐温20)中，经过在SS-34离心机中以15krpm(27000g)，2℃离心重悬的沉淀5分钟弃去不溶物。所得的上清含有噬菌体。
保存上清用于以其结合亲和力分选VEGF变体。经过在大肠杆菌抑制型菌株中产生噬菌体，可表达VEGF(1-109)变体-gIII融合蛋白并在噬菌体表面展示，使得噬菌体与KDR和/或Flt-1受体结合。
文库的亲和力分选使用相似于H.Jin，临床研究杂志，98969(1996)所述方法的竞争性结合技术分选各文库对KDR(1-3)单体的结合，显示所述文库对于产生受体选择性变体有用。
为了进行竞争性结合技术，在溶液中存在高浓度(100nM)的竞争性Flt-1(1-3)单体(Genentech，Inc.)的条件下分选各文库对固相KDR(1-3)单体(Genentech，South San Francisco，Califomia)的结合。即，首先用包被缓冲