专利名称：一种石斑鱼胰岛素样生长因子Ⅱ基因、含有该基因的载体、重组株及其应用的制作方法 胰岛素样生长因子II(Insulin-like growth factor-II)是一种由70个氨基酸组成的蛋白质，由于其结构与胰岛素原(proinsulin)相似，故和胰岛素(insulin，INS)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、松弛素(relaxin)一起被称为INS/IGF/relaxin家族蛋白。IGFs是单链蛋白，分子量约为7500D，结构与胰岛素原相似，其一级结构包括四个区域B-C-A-D，B、C、A三个区域分别与胰岛素原的B链、C肽(连接肽)和A链同源，与胰岛素原不同的是羧基末端多了一个D区域。许多动物的IGFs的一级结构已被阐明。哺乳动物的IGF-II(胰岛素样生长因子II)由67个氨基酸组成，鸡的IGF-II由65个氨基酸组成，而最近发现的鳟鱼IGF-II则由70个氨基酸组成，IGF-II也具有相当高的保守性。IGFs广泛存在于脊椎动物中，从低等的圆口类到高等的哺乳动物都已发现了IGFs，IGFs的生物学功能主要是有丝分裂刺激作用及诱导或促进分化的功能。一般认为，IGF-II主要参与调控胚胎发育。石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类，属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，有30多种。石斑鱼是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值。石斑鱼的苗种培育是养殖生产持续发展的关键，但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其苗种生长的饵料添加剂。
本发明的目的在于提供一种重组斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因；本发明的另一目的在于提供含有该基因的载体，特别是克隆载体和表达载体；本发明的另一目的在于提供上述载体转化的微生物菌株；本发明的另一目的在于提供了利用上述大肠杆菌重组株得到重组斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II的方法。本发明的另一目的在于提供上述基因在制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂中的应用。氨基酸序列分析表明斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II成熟肽是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II原的一个内片段，相当于斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II原第1位至70位氨基酸序列，即B-C-A-D区域，共70个氨基酸。胰岛素样生长因子II原在加工过程中经蛋白水解酶切除后产生这一区段，具有促进生长、繁殖和调节渗透压的生物活性，而完整的胰岛素样生长因子II原并不具有这一活性。本发明的斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II全长基因是以斜带石斑鱼肝脏总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR和RACE方法扩增而得到的，它来源于斜带石斑鱼肝脏cDNA上的胰岛素样生长因子II结构域所对应的基因全长片段。本发明用于表达斜带石斑鱼IGF-II重组蛋白的IGF-II成熟肽基因序列是以斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II全长基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，它来源于斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II全长基因的B-C-A-D区域所对应的基因片段。
按照上述的斜带石斑鱼IGF-II重组蛋白的IGF-II成熟肽基因序列，它正好是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II全长基因141bp至491bp(相当于1位至70位氨基酸)的片段，其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如序列表所示。
本发明还构建了含有上述斜带石斑鱼IGF-II重组蛋白的IGF-II成熟肽基因序列的载体；特别是含有该基因的大肠杆菌克隆载体以及表达载体。这些载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的相应载体的相应酶切位点(即Kpn I和Not I之间，即构建成所需的含有斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因的表达载体。
上述含斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因的大肠杆菌表达载体优选由本发明合成的斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因与大肠杆菌表达载体pTRX构建成的重组表达载体，命名为pTRX-IGF-II。
本发明还用上述含有斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因的相应表达载体分别构建了能高效表达斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因的大肠杆菌重组株。
本发明的上述能表达斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II大肠杆菌重组菌株优选由含有斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因的表达载体pTRX-IGF-II转化大肠杆菌BL21而得到的菌株，命名为pTRX-IGF-II-BL21。
本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组株生产斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II的方法。先将将菌种接种在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200转/分培养过夜，次日接种于相同培养基中，并经IPTG诱导，37℃，200转/分培养，10小时后收集菌体，经分离纯化得到重组斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II产品。
斜带石斑鱼具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的石斑鱼胰岛素样生长因子II基因和重组株pTRX-IGF-II-BL21，生产重组斜带石斑鱼IGF-II蛋白，并可进一步用作制备鱼苗苗种促生长剂或添加剂。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。


图1-1是以斜带石斑鱼肝脏总RNA反转录得到的cDNA为模板的胰岛素样生长因子II基因中间片段PCR扩增产物的凝胶电泳分析图，其中M.分子量标准；1.PCR扩增产物。
图1-2是重组质粒PCR和酶切鉴定凝胶电泳分析图，其中M.分子量标准；1.EcoRI酶切鉴定；2.PCR鉴定。
图2是用GeneRacer Kit 5’Primer和3’Primer扩增得到的斜带石斑鱼胰岛素样cDNA文库的PCR凝胶电泳分析图。其中M.分子量标准；1.PCR扩增产物。
图3-1是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因5’端片段合成的第一次PCR凝胶电泳分析图。其中M.分子量标准；1.PCR扩增产物。
图3-2是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因5’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图。其中M.分子量标准；1.PCR扩增产物。
图4-1是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因3’端片段合成的第一次PCR凝胶电泳分析图。其中M.分子量标准；1.PCR扩增产物。
图4-2是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因3’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图。其中M.分子量标准；1.PCR扩增产物。
图5是以斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II中间片段重组质粒DNA为模板的PCR扩增产物(重组斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因)的凝胶电泳分析图。其中M.分子量标准；1.PCR扩增产物。
图6-1是重组表达载体pTRX-IGF-II的构建过程示意图。
图6-2是质粒pTRX-IGF-II的酶切分析，其中M.分子量标准；1.pTRX/Kpn I+Not I酶切鉴定。
图7是重组斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot鉴定图谱。其中，M蛋白分子量；1、2SDS-PAGE；3、4Western blot；2、3未诱导的gIGF-II-E-pTRX-ml；1、4IPTG诱导的pTRX-gIGF-II-E-ml。

实施例1斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因中间片段的合成根据已发表的人和各种动物的胰岛素样生长因子II的cDNA序列的同源性比较结果，以与斜带石斑鱼亲缘性最近的鲈鱼的cDNA全序列为引物设计模板，设计合成一套简并引物，共有一条上游引物和一条下游引物。上游引物(Sense)是从第262位碱基起20个碱基5’-CCCTGACGCTCTACGT(A/T)GTG，下游引物(Anti-sense)是从第564位碱基起21个碱基5’-GCTTCCTTGGGACTTCCTGTT。Touch-down PCR以斜带石斑鱼肝脏总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增原第262位至564位的核苷酸序列，反应条件为95℃预变性5分钟；下边为38个循环，分为两个阶段(1)95℃变性30秒，从50℃向37℃每两个循环降1℃，退火30秒，共28循环，72℃延伸1分钟；(2)95℃变性30秒，37℃退火30秒，共8循环，72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。
PCR扩增产物的电泳鉴定图见图1-1。从图1-1可见第一次PCR扩增了一段长约303bp的序列。
将303bp的扩增产物连接到pGEM-T-easy载体上得到重组质粒pGEMT-IGF-II。将重组质粒pGEMT-IGF-II用pGEM-T-easy的一对通用引物进行序列测定，测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆的PCR产物是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因的中间片段。
实施例2PCR扩增斜带石斑鱼cDNA文库以GeneRacer Kit反转录得到的斜带石斑鱼上丘脑cDNA为模板，引物分别为GeneRacer Kit5’Primer和GeneRacer Kit 3’Primer，经降落PCR方法扩增以建立斜带石斑鱼cDNA文库，反应条件为94℃预变性5分钟；下边为40个循环，分为两个阶段(1)94℃变性30秒，从68℃向54℃每个循环降0.5℃，退火30秒，共32循环，72℃延伸2分钟；(2)94℃变性30秒，50℃退火30秒，共8循环，72℃延伸2分钟；最后72℃延伸7分钟。
PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2。
实施例3斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因5’端片段的合成操作按GeneRacer Kit Protocol来进行。根据试剂盒的要求，依据已测序的IGF-II中间片段的序列设计了两条下游引物GSP2和GSP3以进行嵌套PCR。第一条下游引物(GSP2)是从已测序的IGF-II中间片段的序列第493位碱基起21个碱基5’-CTTTCGGACTTGGCGGGTTTG，第二条下游引物(GSP3)是从第437位碱基起22个碱基5’-ACGGAAACAACACTCCTCTACG。
第一次PCR以上述例3得到的PCR产物稀释产物(1∶100)为模板，经降落PCR方法扩增原第493位至5’端的核苷酸序列，反应条件为95℃预变性5分钟；下边为40个循环，分为两个阶段(1)95℃变性30秒，从62℃向47℃每个循环降0.5℃，退火30秒，共32循环，72℃延伸1分钟；(2)95℃变性30秒，46℃退火30秒，共8循环，72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。第二次PCR以第一次PCR产物为模板，经PCR方法扩增原第437位至5’端的核苷酸序列，反应条件为95℃预变性5分钟；下边为35个循环95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒；最后72℃延伸7分钟。
二次PCR扩增产物的电泳鉴定图见图3-1和图3-2。
将470bp的扩增产物连接到pGEM-T-easy载体上得到重组质粒pGEM-T-IGF-II-5’-470。将重组质粒pGEMT-IGF-II-5’-470用pGEM-T-easy的一对通用引物进行序列测定，测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆的470bp产物是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II5’端基因。
实施例4斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因3’端片段的合成操作按GeneRacer Kit Protocol来进行。根据试剂盒的要求，依据已测序的IGF-II中间片段的序列设计了两条上游引物GSP1和GSP2以进行嵌套PCR。第一条上游引物(GSP1)是从已测序的IGF-II中间片段的序列第279位碱基起20个碱基5’-GTGGAAATAGCGTCGGCAGA，第二条上游引物(GSP2)是从第476位碱基起18个碱基5’-ACCCGCCAAGTCCGAAAG。
第一次PCR以上述例3得到的PCR产物稀释产物(1∶100)为模板，引物为GSP1，经PCR方法扩增第279位至3’poly A端的核苷酸序列，使用Biometra?的PCR仪设定PCR操作程序，反应条件为95℃预变性5分钟；下边为32个循环95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。第二次PCR以第一次PCR产物为模板，经PCR方法扩增，反应条件为95℃预变性5分钟；下边为32个循环95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。
两次PCR扩增产物的电泳鉴定图见图4-1和图4-2。
将750bp的扩增产物连接到pGEM-T-easy载体上得到重组质粒pGEMT-IGF-II-3’-750。将重组质粒pGEMT-IGF-II-3’-750用pGEM-T-easy的一对通用引物进行序列测定，测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆的750bp产物是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II3’端基因。
实施例5斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因全长序列的拼接将已经测序的IGF-II编码片段、5’RACE片段和3’RACE片段进行拼接，得到斜带石斑鱼的IGF-II基因的全长，为1166bp，并从141bp处的起始密码开始，到其终止密码结束，推测出其氨基酸序列。IGF-II基因全长和推测的氨基酸序列见序列表。
实施例6斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因的合成根据拼接好的斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因cDNA全序列，设计合成两段引物，上游引物是在第282位碱基起的15个碱基前加上Kpn I的限制酶切位点以及EK酶识别位点5’-CGGGGTACCGATGACGATGACAAGGAAATAGCGTCGGCA，共39bp；下游引物是在第491位碱基起的前16个碱基加上Not I的限制酶切位点和终止密码子5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTATCATTCGGACTTGGCGGGT，共38bp。以斜带石斑鱼胰岛素样生长因子中间片段重组质粒DNA为模板，经PCR方法扩增胰岛素样生长因子II原第48位至第117位氨基酸序列相应的DNA序列即斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因，PCR反应条件为95℃预变性5分钟；下边为32个循环95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物的电泳鉴定图见图5。从图6可见PCR扩增了一段长约256bp的序列。
实施例7含斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因的大肠杆菌表达载体pTRX-IGF-II的构建质粒pGEM-T-easy-IGF-II-E经限制酶EcoR I酶切后，酶切产物用E.Z.N.A.?Gel Extraction Kit回收。接着再将回收产物和载体质粒pTRX用Kpn I和Not I进行双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化约240bp的斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因片段；大肠杆菌表达质粒pTRX经限制酶Kpn I及Not I双酶切后分离纯化5.8kb的大片段，与240bp的斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因片段按1∶3混合，用MBI T4连接酶22℃连接16小时后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌BL21中，筛选具氨苄青霉素抗性的转化子，以标准方法提取质粒，筛选大小约6.0kb的重组质粒，用限制酶Kpn I及Not I双酶切重组质粒，得到240bp和5.8kb的两个片段，大小分别与斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因和表达载体pTRX大小相同，证明斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II基因已克隆入大肠杆菌表达载体pTRX中，重组质粒命名为pTRX-IGF-II。质粒构建图和酶切分析图分别见图6-1及图6-2。
实施例8能高效表达斜带石斑鱼胰岛素样生长因子II的大肠杆菌重组株pTRX-IGF-II-BL21的构建CaCl2法将pTRX-IGF-II转化E.coli BL21，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含pTRX-IGF-II的重组转化子pTRX-IGF-II-BL21。
实施例9利用大肠杆菌基因工程菌pTRX-IGF-II-BL21生产重组斜带石斑鱼胚胎期胰岛素样生长因子II挑取大肠杆菌基因工程菌pTRX-IGF-II-BL21单菌落接种在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200转/分培养过夜，次日按1∶50接种量接种于适当体积的相同培养基中，37℃培养至A600为0.5～0.6，加入IPTG(终浓度为0.8mmol/l)和20％葡萄糖(终浓度为0.2％)，于37℃诱导培养10小时后收菌。合成的斜带石斑鱼胚胎期胰岛素样生长因子II在大肠杆菌基因工程菌pTRX-IGF-II-BL21中已获得高效表达。
取少量细胞加2×电泳上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶电泳。结果见图9，显示经诱导的pTRX-IGF-II-BL21在约23.5kD的位置上出现一条新的蛋白带，未诱导的pTRX-IGF-II-BL21不出现此带，证明斜带石斑鱼胚胎期胰岛素样生长因子II已在pTRX-IGF-II-BL21中诱导表达。
将重组斜带石斑鱼胚胎期胰岛素样生长因子II采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫活性鉴定。一抗为兔抗人IGF-II多克隆抗体，二抗为羊抗兔IgG-AP。结果见图7，显示兔抗人IGF-II多克隆抗体能识别我们用大肠杆菌表达的融合IGF-II蛋白，结合pTRX-gIGF-II-m1重组子的DNA测序结果，证明得到的蛋白是重组斜带石斑鱼IGF-II。
序列表<110>中山大学<120>一种石斑鱼胰岛素样生长因子II基因、含有该基因的载体、重组株及其应用<160>2<210>1<211>1166<212>DNA<213>斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)<220><221>CDS<222>(141)...(785)<220><221>Sig_peptide<222>141..281<400>1gaaagtcgcc tggtctttgg gacagcagcc tctcacacat catctctata 50gccgcaccaa ctgggaaact aactcacctg caatctctcc aaccaaataa 100ccccctcccc ctccgacgtt tttgactact gccaactgac atg gag acc149Met Glu Thr1ccg caa aga tac gga cac cac tca ctt tgc cac acc tgc cgg aga acg197Pro Gln Arg Tyr Gly His His Ser Leu Cys His Thr Cys Arg Arg Thr5 10 15gag agc agc aga atg aag gtc aag aag atg tcc tcg tcc agt cgc gcg245Glu Ser Ser Arg Met Lys Val Lys Lys Met Ser Ser Ser Ser Arg Ala20 25 30 35ctg ctg ttt gca ctg gcc cta acg ctc tac gtt gtg gaa ata gcg tcg293Leu Leu Phe Ala Leu Ala Leu Thr Leu Tyr Val Val Glu Ile Ala Ser40 45 50gca gag acg ctg tgt ggg gga gag ctg gtg gat gcg ctg cag ttc gtc341Ala Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val55 60 65tgt gaa gac aga ggc ttc tat ttc agt agg cca acc agc agg ggt agc389Cys Glu Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Thr Ser Arg Gly Ser70 75 80aac cgg cgc aac cag aac cgt ggg atc gta gag gag tgt tgt ttc cgt437Asn Arg Arg Asn Gln Asn Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg85 90 95agc tgt gac ctc aac ctg ctg gag cag tac tgt gcc aaa ccc gcc aag485Ser Cys Asp Leu Asn Leu Leu Glu Gln Tyr Cys Ala Lys Pro Ala Lys100 105 110 115tcc gaa agg gac gtg tcg gcc acc tct ctg cag gtc ata ccc gtg atg533Ser Glu Arg Asp Val Ser Ala Thr Ser Leu Gln Val Ile Pro Val Met120 125 130ccc gca cta aaa ccg gaa gtc ccg agg aag ccg cat gtg acc gtg aag581Pro Ala Leu Lys Pro Glu Val Pro Arg Lys Pro His Val Thr Val Lys135 140 145tat tcc aaa tac gag gtg tgg cag agg aag gcg gcc cag cgg ctc cgg629Tyr Ser Lys Tyr Glu Val Trp Gln Arg Lys Ala Ala Gln Arg Leu Arg150 155 160agg ggt gtc ccc gcc atc ctg agg gcc aaa aag ttt cgg agg cag gcg677Arg Gly Val Pro Ala Ile Leu Arg Ala Lys Lys Phe Arg Arg Gln Ala165 170 175gag aag atc aaa gce cag gag cag gca gtc ttc cac agg ccc ttg atc725Glu Lys Ile Lys Ala Gln Glu Gln Ala Val Phe His Arg Pro Leu Ile180 185 190 195agc ctg ccc agc aaa ctg ccg ccc gtc ttg ctc gcc acg gac aac tat773Ser Leu Pro Ser Lys Leu Pro Pro Val Leu Leu Ala Thr Asp Asn Tyr200 205 210gtc aac cac aaa tga788Val Asn His Lys *215gcccgctgcc agccctttgc acagacaaga gtttggaggg agaaaaaaag actaggggat 848tatagctttg tctctgacgt catttctgtg gcagtcctct ttgacctccc ctgccctgtc 908cgagcccacc aatccctccc cctgctctca tccactactt cttgaccccc tggccctttt 968ctaatgcccc ccctcgaaac ccaacccacc catcctcctc cggcacacaa acatgccttc 1028acattcttcc tgtctgaact ctttcgctcc ctctctcttt cagtcactga cacaaaaggc 1088acaaacacaa acgatgaaca aaaagttaac aattcggctg aatgcaattc aggtggatcc 1148ttaagcaaaa aaaaaaaa1166<210>2<211>215<212>PRT<213>斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)<400>2Met Glu Thr Pro Gln Arg Tyr Gly His His Ser Leu Cys His Thr Cys 16Arg Arg Thr Glu Ser Ser Arg Met Lys Val Lys Lys Met Ser Ser Ser 32Ser Arg Ala Leu Leu Phe Ala Leu Ala Leu Thr Leu Tyr Val Val Glu 48Ile Ala Ser Ala Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Ala Leu 64Gln Phe Val Cys Glu Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Thr Ser 80Arg Gly Ser Asn Arg Arg Asn Gln Asn Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys 96Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Asn Leu Leu Glu Gln Tyr Cys Ala Lys 112Pro Ala Lys Ser Glu Arg Asp Val Ser Ala Thr Ser Leu Gln Val Ile 128Pro Val Met Pro Ala Leu Lys Pro Glu Val Pro Arg Lys Pro His Val 144Thr Val Lys Tyr Ser Lys Tyr Glu Val Trp Gln Arg Lys Ala Ala Gln 160Arg Leu Arg Arg Gly Val Pro Ala Ile Leu Arg Ala Lys Lys Phe Arg 176Arg Gln Ala Glu Lys Ile Lys Ala Gln Glu Gln Ala Val Phe His Arg 192Pro Leu Ile Ser Leu Pro Ser Lys Leu Pro Pro Val Leu Leu Ala Thr 208Asp Asn Tyr Val Asn His Lys 21

本发明公开了一种石斑鱼胰岛素样生长因子II基因，该基因是以石斑鱼肝脏总RNA为模板，经RT－PCR和RACE方法而得到的具有石斑鱼胰岛素样生长因子II基因全长cDNA序列的基因片段；本发明还构建了含该基因的载体和重组株；利用本发明可以获得来源稳定、成本便宜的石斑鱼胰岛素样生长因子II重组蛋白，并进一步制备适合海水鱼类使用的鱼苗苗种促生长剂或添加剂。