制备产生和分泌胰岛素的肠内分泌细胞的方法[0001]政府利益的声明[0002]本发明是基于美国国立卫生研究院授予的资助金DK057539和DK58282在政府的支持下做出的。政府对本发明有一定的权利。[0003]发明背景1.[0005]糖尿病是一类以慢性高血糖以及长期并发症为特征的病症。这类病症包括I型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和其它类型的糖尿病。免疫介导型(I型)糖尿病(或胰岛素依赖型糖尿病，IDDM)是一种儿童和成人的疾病，目前还没有合适的治疗或预防方法。I型糖尿病占所有人糖尿病的约10%。[0006]I型糖尿病与非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的区别在于仅I型糖尿病涉及胰岛郎格罕细胞(pancreatic islets of Langerhans)中产生胰岛素的β细胞的特异性损坏；胰腺中的α细胞(产生胰高血糖素)或S细胞(产生生长激素抑制素)是多余的。胰腺β细胞的逐渐减少导致产生的胰岛素不足，因此引发伴随并发症的糖代谢异常。I型糖尿病主要发生在有遗传性糖尿病倾向的人中。虽然I型糖尿病的病因主要是来自基因组分，但是环境或非生殖基因因素也发挥着重要作用。在美国，患有I型糖尿病的人为1/300。I型糖尿病的患者数每年以约3%-5%的速率增长。[0007]从1992年开 始，胰岛素已经成为治疗各型糖尿病和其它与胰岛素缺乏或产量减少有关的疾病的唯一可用的治疗方法，然而，胰岛素并不能预防所述疾病的长期并发症，所述疾病的并发症包括对血管、神经、眼睛和肾脏的损伤，这可能会影响视力、肾功能、心脏功能和血压，而且还可能引起循环系统的并发症。这是因为胰岛素治疗不能完全代替丧失的胰岛素功能。尽管经过数十年的研究，且在1974年出现了胰腺细胞移植以及埃德蒙顿方案(Edmonton Protocol)用于胰腺细胞移植成功的新主张,但是替换产生胰岛素的细胞的成功还是不乐观。与胰腺或胰腺移植有关的阻碍包括难以获得足量的组织，并且还没有克服被移植的胰腺存活率低和在受体体内成功发挥功能的问题。在移植四年后，还有不到10%的已经接受胰腺细胞移植的患者仍然表现为胰岛素依赖型。而且，尽管有了新的免疫抑制方法，但仍对18%的患者存在严重的副作用。[0008]因此，需要其它的治疗方案来治疗、预防和/或降低发展成与胰腺功能受损相关的糖尿病或其它疾病的风险。
[0009]在描述本发明的实施方式之前，应该理解的是，本发明并不限于描述的具体过程、组分或方法，因为这些可以变化。还应该理解的是，说明书中使用的术语仅是为了描述特定的实施例(version)或实施方式，而不是为了限制本发明的范围，本发明的范围由随附的权利要求限定。除非明确指明，否则，本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在本发明的实施方式的实践或试验中可以使用与本文中描述的这些相似或等价的任一方法和原料，但是现在描述的是优选的方法、设备和原料。本文提及的所有出版物都以引用的方式将其全部内容纳入本文。不能借助在先发明而将本发明理解为承认本发明没有资格早于这些公开文本。



[0010]附图中的各图仅以示例性方式而不是以限制性的方式来说明本发明，其中:
[0011]图1.NKO小鼠中的产生胰岛素的肠细胞。(A)对照小鼠和交叉有Neurog3_Gfp报告小鼠的NKO小鼠的肠中Neurog3-Gfp (红)和Foxol (绿)的共定位分析。(B)NKO小鼠中Neurog-Gfp和Foxol的共定位分析的缺乏。(C)胰腺(轮廓)和肠中的胰岛素免疫组织化学(红)染色。最初放大倍数:200X。样本是从I天大的小鼠中获得的。(D)在对照小鼠和交叉有Ins2-Gfp敲入小鼠的NKO小鼠的胰腺(顶部)和绒毛(底部)中的直接荧光。(E)用pNKO:Ins2-Gfp小鼠中的胰岛素(红)和Gfp (绿)进行两倍免疫荧光。(F)在NKO:Rosa26eGf小鼠和对照杂合同窝出生仔畜中进行谱系跟踪实验。用Gfp (绿)和胰岛素(红)进行免疫组织化学染色分析。Gfp+Ans+细胞(用箭头表示)是重组酶介导的重组发生的细胞的后代。图1的IG (临时图(prov)中的旧图1L)总结了 Ins2+细胞的定位。成年小鼠肠的示意图表明了神经元素3-Gfp+(红三角形)和Ins2+细胞的定位，这从NK0:1ns2-Gfp和ΝΚ0:神经元素3 - GFP小鼠中可以得出。将这个插入到图1F之后的PPT中。
[0012]图2.消化道Ins+细胞与胰腺β -细胞具有共同的基本特征。
[0013]用(A)葡糖激酶(Gck)、(B)激素原转化酶2 (Pc2)、(C)磺酰脲受体I (Surl), (D)葡萄糖转运子2 (Glut2)和(E)突触素进行免疫荧光。C中的插图显示了双阳性细胞的实例。最初放大倍数:100X (A、C、D、E)和200X (B)。
[0014]图3.胰岛素的分 泌和生物活性。(A，B)补充有指示浓度的葡糖糖和0.5mM 二氮嗪(Dzx)或IOnM格列本脲(Glib)的HEPES-Krebs Ringer缓冲液中培养的NKO (蓝柱)和对照(黑柱)肠中葡萄糖依赖型胰岛素和C肽的分泌。使用成年肠进行实验(n=4)。将WT胰腺作为对照。(C)NKO(蓝柱)或对照小鼠(黑柱)中酸-乙醇提取物对5天大的小鼠腹腔注射后的血糖水平的影响。用抗胰岛素中和抗体(Ins Ab)或同种型匹配对照IgG (IgG)预培养所述样品。在注射前，先将重组人胰岛素经过酸-乙醇沉淀(酸/EtOH) (a和b中n=8，c中 n=12)。
[0015]图4.STZ-介导的消融后消化道Ins+细胞的再生。(A) NKO小鼠(正方形)和对照小鼠(菱形)中喂食的葡萄糖水平。箭头表示STZ给药(STZ)和处死(SAC)的时间。从第3天至第28天，给药WT对照小鼠胰岛素(2-4U/qd) (n=16)。(B) STZ后NKO小鼠和WT对照小鼠的存活图(n=16并且，各自地)。(C)给药STZ前后NKO小鼠中的口服葡萄糖耐受性试验和给药STZ后WT对照小鼠中的口服葡萄糖耐受性试验。(D)用抗胰岛素(DO和D3)以及抗胰岛素和抗Pc2抗体(D28)进行注射STZ前(DO)后(D3和D28) NKO肠中的消化道Ins+细胞的免疫组织化学染色分析。右图中显示的是注射STZ前(DO)后(D28)的对照胰腺部分的胰岛素免疫染色。(E)注射STZ后消化道Ins+细胞的谱系追踪。用如该方法所示STZ处理NKO:1ns2-Gfp双突变小鼠，并用抗Gfp (绿)或Pc2 (红)抗体给肠部分染色。在D和E中，我们从每个区域测量到了三种水平的十二指肠、空肠、回肠和结肠(n=4)。最初的放大倍数:200X。
[0016]图5.肠Neurog3的定位。用Neurog3_Gfp转基因小鼠的新生消化道中的抗Neurog3 (红)和抗Gfp (绿)进行免疫组织化学染色分析。两种检测方法的完全重叠表明ffp是消化道中Neurog3定位可靠的标记。最初的放大倍数:100X。
[0017]图6.肠内分泌祖细胞中Foxol消融扩大了 Neurog3+细胞池。(A)在WT和NKO小鼠中用抗Neurog3抗体(绿)进行免疫组织化学染色分析。(B)在Neurog3_Gfp和NK0:Neurog3-Gfp小鼠中用抗Gfp抗体和抗嗜铬粒蛋白A (Chromagranin A)抗体(分别为绿和红)进行免疫组织化学染色分析。最初的放大倍数:A和B中都为20X。(C)肠上皮细胞制备中 Neurog3mRNA 的水平(n=8)。(D)从 Neurog3_Gfp 和 NK0:Neurog3_Gfp 小鼠分离的肠上皮细胞制备中的流式细胞术数据。(E)D中数据的定量(n=6)* = P〈0.05，**=P〈0.01。
[0018]图7.消融了 Foxol的消化道中产生胰腺激素的细胞。显示NKO小鼠的末端回肠和结肠的Gcg+和Pp+细胞(绿)的荧光免疫组织化学染色分析，而不是对照小鼠的。最初的放大倍数:200X。
[0019]图8.用抗胰岛素抗体(红)进行荧光免疫组织化学染色分析，这显示的是4个月大的成年NKO小鼠结肠中存在Ins+细胞。最初的放大倍数:100X。
[0020]图9.从NKO小鼠(蓝)中富含DTZ的片段和对照小鼠(黑)中结构上匹配的片段中分离出的消化道上皮细胞制剂中Insl和Ins2mRNA表达的qPCR分析(n=8)。* = P〈0.05.[0021]图10.PKO小鼠的产生和分析。(A)—天大的PKO小鼠和交叉有Neurog3_Gfp转基因报告小鼠的对照小鼠中的Foxol (绿)和Gfp免疫化学染色(红)。(B)9个月大的PKO小鼠回肠中胰岛素免疫染色(红)。(C) 一天大的PK0:Neurog3-Gfp和Neurog3_Gfp对照小鼠的十二指肠中的胰岛素(红)和Gfp免疫染色(绿)。最初的放大倍数:200X。
[0022]图11.从NKO小鼠(蓝)`中富含DTZ的片段和对照小鼠(黑)中结构上匹配的片段中分离出的消化道上皮细胞制剂中β细胞分化物Gck、Pc2、Kir6.2和Surl的mRNA表达的qPCR 分析(n=8 )。* = Ρ〈0.05，**=Ρ〈0.0I。
[0023]图12.调节从NKO小鼠(蓝)中富含DTZ的片段和对照小鼠(黑)中结构上匹配的片段中分离出的消化道上皮细胞制剂中β细胞分化物Nkx6.l、MafA、Pdxl、NeuroDl、Pax4、Nkx2.2 和 Arx 的转录因子的 mRNA 表达的 qPCR 分析(n=8)。* = Ρ〈0.05，**=Ρ〈0.01。
[0024]图13.β细胞转录因子表达的免疫组织化学染色分析。(A) Pdxl表达和(B)NKO小鼠和WT对照小鼠的成年结肠和末端回肠中的Nkx6.1 (绿)。胰岛素的免疫反应活性用红色表示在两块板组合中。两个转录因子的细胞质定位可能是由于固定步骤。最初的放大倍数:400 X (顶端)和200 X (底部)。
[0025]图14.NKO小鼠中Aes的表达。从NKO小鼠(蓝)中富含DTZ的片段和对照小鼠(黑)中结构上匹配的片段中分离出的消化道上皮细胞制剂中Aes mRNA表达的qPCR分析。**=Ρ〈0.01。(B)给药STZ后成年NKO小鼠和WT对照小鼠结肠中抗胰岛素(绿)和Aes (红)的免疫反应活性。最初的放大倍数:200Χ。(C)用NK0:Rosa26eGfp和对照小鼠的胰腺和消化道中的Pc2和Aes抗体(红)进行的免疫组织化学染色分析。最初的放大倍数:20X。
[0026]图15.Foxol作用模型。在胰腺中，N3Prog会产生所有的内分泌细胞类型(橙色标志)。在消化道中，它们会产生消化道内分泌细胞(橙色标志)，其中，一些消化道内分泌细胞与胰腺有共同之处，而一些消化道内分泌细胞是消化道特有的。在这些过程中，Foxo是自由的，也就是它可以使这些事件发生。胰腺特异性细胞类型包括产生胰岛素的β细胞、产生胰高血糖素的α细胞和产生胰腺多肽的细胞，在正常的消化道中没有发现这些细胞类型。我们提出，通常Foxo会对消化道中这些细胞类型的产生发挥抑制作用，并且Foxo抑制会导致消化道中出现这些细胞类型。
[0027]图16.放大倍数为IOOX时活体(live)突光显微照片。将隐窝(crypts)从转运Ins2位点处GFP报告基因的WT或NKO的末端回肠和结肠中分离，并在体外培养。第3天:未观察到隐窝细胞转化为Ins_GFP细胞，因为在正常小鼠和Neur0g3-F0X0l敲除小鼠中没有绿色细胞。
[0028]图17.第6天:由于FoxolDNA失活，隐窝细胞转化为Ins+GFP细胞，这可由表示胰岛素+GFP细胞的绿色细胞证明。将隐窝从搬运Ins2位点处GFP报告基因的WT或NKO的末端回肠和结肠中分离，并在体外培养。分离的肠细胞在培养基I中保持3天，然后转换到培养基2中保持3天。放大倍数为IOOX时的活体荧光显微照片。
[0029]图18.第 6天:在Foxol消融的隐窝中，隐窝细胞转化为Ins+GFP细胞的转化率提高(即NKO小鼠)放大倍数为200 X时的活体荧光显微照片。将隐窝从转运Ins2位点处GFP报告基因的WT或NKO的末端回肠和结肠中分离，并在体外培养。转化效率提高，可由表示胰岛素+GFP细胞的绿色细胞的增加证明。将分离的肠细胞在培养基I中保持I天，在培养基2中保持2天，并转换到培养基4b中保持3天。
[0030]图19.第6天胰岛素+GFP细胞为活细胞。绿色细胞表示胰岛素+GFP细胞。蓝色表示死细胞。将隐窝从转运Ins2位点处GFP报告基因的WT或NKO的末端回肠和结肠中分离，并在体外培养。将分离的肠细胞在培养基I中保持I天，在培养基2中保持2天，并转换到培养基4b中保持3天。
[0031]图20.第6天:隐窝细胞转化成的Ins+GFP是由于FoxolRNA抑制作用的细胞；绿色细胞表示胰岛素+GFP细胞。放大倍数为200X时的活体荧光显微照片。将隐窝从转运Ins2位点处GFP报告基因的WT的末端回肠和结肠中分离，并在体外培养。将分离的消化道细胞在培养基I中保持I天，在培养基2中保持2天，并用50nM的FoxolsiRNA处理正常小鼠的消化道细胞(右)或将GC含量匹配的阴性对照小鼠(左)在培养基4b中保持72小时。


[0032]一种治疗或预防哺乳动物中与胰腺功能受损有关的疾病或病症的方法，所述方法包括用治疗有效量的药剂对哺乳动物进行给药，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，所述药剂选自由与编码一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA充分互补的分离的shRNA、siRNA、反义RNA、反义DNA、嵌合反义DNA/RNA、microRNA和核酶，以及与一种或多种Foxo蛋白特异性结合以降低一种或多种蛋白的生物活性的抗体或它的生物活性片段或变体组成的组中。所述疾病或病症选自包括I型糖尿病、2型糖尿病、代谢综合征、葡萄糖耐受不良、高血糖症、胰岛素敏感性下降、空腹血糖增加、餐后血糖增加和肥胖症组成的组中。所述治疗有效量是指产生效果的量，所述效果选自由葡萄糖耐受性增强、血清胰岛素增加、胰岛素敏感性增强、空腹血糖降低、餐后血糖下降、体重增加减少、脂肪量降低、体重减轻增加和胃肠道中生成产生和分泌胰岛素的肠内分泌细胞组成的组中。在优选的实施方式中，将所述药剂给药至胃肠道。
[0033]其它的实施方式涉及用于治疗或预防哺乳动物中与胰腺功能受损有关的疾病或病症的药物制剂，所述药物制剂含有有效量的药剂，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，所述药剂选自由与编码一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA充分互补的分离的shRNA、siRNA、反义RNA、反义DNA、嵌合反义DNA/RNA、microRNA和核酶，以及与一种或多种Foxo蛋白特异性结合以降低一种或多种蛋白的生物活性的抗体或它的生物活性片段或变体组成的组中。在某些实施方式中，所述有效量是指产生效果的量，所述效果选自由葡萄糖耐受性增强、血清胰岛素增加、胰岛素敏感性增强、空腹血糖降低、餐后血糖下降、体重增加减少、脂肪量降低、体重减轻增加，以及在胃肠道中生成产生和分泌胰岛素的肠内分泌细胞组成的组中。
[0034]另一个实施方式涉及一种制备肠内分泌细胞的方法，在哺乳动物中，所述肠内分泌细胞产生和分泌胰岛素，所述方法包括用药剂对哺乳动物进行给药，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，所述药剂选自由与编码一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA充分互补的分离的shRNA、siRNA、反义RNA、反义DNA、嵌合反义DNA/RNA、microRNA和核酶，以及与一种或多种Foxo蛋白特异性结合以降低一种或多种蛋白的生物活性的抗体或它的生物活性片段或变体组成的组中。在一个实施方式中，应答于药剂的给药，产生胰岛素的肠内分泌细胞还产生一种或多种胰腺激素，所述胰腺激素选自由以下胰腺激素组成的组中:胰高血糖素、胰腺多肽、葡糖激酶和葡萄糖转运体2(glut2)。在一个实施方式中，产生胰岛素的肠内分泌细胞还产生一种或多种蛋白，所述蛋白选自由激素原转化酶Pc2、Pdx1、MafA、Nkx6.1、Nkx2.2和Pax4组成的组中。
[0035]另一个实施方式涉及一种增强哺乳动物中葡萄糖耐受性或胰岛素敏感性的方法，所述方法包括用治疗有效量的药剂对哺乳动物进行给药，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，所述药剂选自由与编码一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA充分互补的分离的shRNA、siRNA、反义RNA、反义DNA、嵌合反义DNA/RNA、microRNA和核酶，以及与一种或多种Foxo蛋白特异性结合以降低一种或多种蛋白的生物活性的抗体或它的生物活性片段或变体组成的组中。
[0036]一个实施方式涉及一种制备产生胰岛素的肠内分泌细胞的方法，所述方法包括:a.从哺乳动物中获得不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞的细胞群，b.在使有效部分细胞群产生胰岛素的条件下，将细胞群与药剂按一定量进行接触，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，和c.收集产生胰岛素的肠内分泌细胞。另一个实施方式涉及一种治疗或预防哺乳动物中与胰腺功能受损有关的疾病或病症的方法，所述方法包括给哺乳动物再引入足量的产生胰岛素的肠内分泌细胞，以治疗或预防所述疾病或病症。另一种实施方式涉及由所述方法制得的产生胰岛素的肠内分泌细胞并涉及含有所述细胞的药物制剂。
[0037]另一种实施方式是一种用于预防哺乳动物中与胰腺功能受损有关的疾病或病症的药物，所述药物含有治疗有效量的药剂，所述药剂降低一种或多种Foxo蛋白或它的生物活性片段或变体的表达或生物活性，所述药剂选自由与编码一种或多种Foxo蛋白的基因或mRNA充分互补的分离的shRNA、siRNA、反义RNA、反义DNA、嵌合反义DNA/RNA、microRNA和核酶，以及与一种或多种Foxo蛋白特异性结合以降低一种或多种蛋白的生物活性的抗体或它的生物活性片段或变体组成的组中。
[0038]其它的实施方式涉及用于鉴别诱导哺乳动物消化道不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞表达胰岛素的药剂的基于细胞的高通量筛选分析的变化方案，所述变化方案包括:a.分离包括消化道不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞的细胞群，并在适于产生和分泌胰岛素的条件下培养所述细胞群，b.提供不产生胰岛素的肠内分泌祖细胞的对照细胞群和测试细胞群，c.将测试细胞群与测试药剂接触，d.测定对照细胞群和测试细胞群的胰岛素表达水平，和e.如果测试细胞群中的胰岛素水平明显高于对照细胞群中的胰岛素水平，筛选出该测试药剂。在某些实施方式中，消化道肠内分泌细胞中编码胰岛素的基因可以与被可视化(visualized)的蛋白或肽可操作地连接。
[0039]定义
[0040]本文中使用的术语“动物”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物，如人、犬、牛、马、袋鼠、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人类动物。优选的动物、患者或受试者为人。
[0041]“列举的疾病或病症”是指以胰腺功能受损为特征的疾病或病症，包括不适当的低胰岛素水平、I型和2型糖尿病、代谢综合征、肥胖症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、胰岛素敏感性下降、空腹血糖增加、餐后血糖增加。由不适当的低胰岛素水平是指胰岛素水平低至足以成为所述疾病或病症的至少一种症状的原因。胰腺功能受损的病理与受试者产生和/或分泌胰岛素的胰腺的生产力减退和/或分泌胰腺肽如胰高血糖素、胰腺多肽、生长激素抑制素的能力改变(增加或减少)有关。与胰腺功能受损有关的病症包括有时被称作成年隐匿性自身免疫性糖尿病的病症、前驱糖尿病(pre-diabetes)、空腹血糖受损、葡萄糖耐受性受损、空腹闻血糖症、膜岛素抵抗综合征和闻血糖症状。
[0042]实施方式中使用的荧光示踪剂包括GFP和其衍生物、双脒基黄(Diamidinoyellow)、快蓝(Fast blue)、辣根过氧化物酶、霍乱毒素B、伪狂犬病病毒、羟芪巴脒(Hydroxystilbamidine)、德克萨斯红和异硫氰酸突光素，以及本领域已知的其它物质。本文描述的实验中使用了绿色荧光蛋白(GFP)，然而，现在有许多GFP的突变体[ShanerN, Steinbach P,Tsien R(2005).guide to choosing fluorescent proteins"(PDF).NatMethods2 (12):905 - 9.]。从http://nic.ucsf.edu/dokuwiki/doku.php?id=fluorescent_proteins中可以找到各种突光蛋白的名单。
[0043]“活性剂”是指使任何肠内分泌祖Ins—细胞分化为Ins+细胞的任何药剂、多肽、核酸、小分子。优选的活性剂是那些降低Foxo蛋白表达或生物活性的活性剂(包括分别通过降低基因或mRNA的转录或翻译,或降低生物活性)。核酸活性剂包括siRNA、shRNA和反义RNA或DNA ;多肽包括抗体和抗体片段和酶如COPl。
[0044]“干细胞”是指未分化的细胞，所述细胞可以无限分裂而自我更新，并分化为多种类型的细胞。所述PKO小鼠实验(图4)是敲除包括干细胞的所有消化道细胞中的Foxol，而且结果表明其表型与NKO相似。
[0045]消化道中的“祖细胞”是指来源于干细胞的细胞，是多能细胞，但自我更新能力有限。
[0046]“N3肠内分泌祖细胞”和“N3Prog”是指表达神经元素3 (neim)genin3)的胰岛素阴性消化道祖细胞的子集(subset),产生Ins^肠内分泌细胞。已经发现消化道中的N3Prog,后称作“消化道N3Prog”有分化为产生和分泌胰岛素的细胞(“消化道Ins+细胞”)的潜力，但是这种能力在发育过程中会受到Foxol的抑制。胰腺N3Prog在胎儿发育过程中分化为胰腺产生胰岛素的细胞，但仍然不清楚的是，出生后是否有N3Prog，或出生后胰腺N3Prog在正常或异常条件下是否能够分化为胰腺的激素分泌细胞。应该注意的是，虽然肠内分泌细胞(消化道)和胰腺N3Prog通常都被称作N3细胞，但它们具有不同的特征。
[0047]“不产生胰岛素的消化道祖细胞”或“Ins_消化道Prog”广义地指能够分化为产生胰岛素的消化道细胞(消化道Ins+细胞)的任何消化道祖细胞，包括干细胞和N3Prog。
[0048]“肠内分泌细胞”是指胃肠道专有的内分泌细胞，大多数细胞是不再产生神经元素3的N3Prog的子代。肠内分泌细胞是胰岛素阴性细胞(消化道Ins_);它们产生各种其它的激素，如胃泌激素、胃饥饿素、神经肽Y、肽ΥΥ3_36 (ΡΥΥ3_36)血清素、分泌素、生长激素抑制素、胃动素、缩胆囊素、抑胃肽、神经降压素、舒血管肠肽、葡萄糖依赖型促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素-样-肽-1 (glucagon-like peptide-1)。
[0049]“消化道Ins+细胞”和“胰岛素阳性消化道细胞”是指产生和分泌来源于Ins_消化道的胰岛素的任何肠内分泌细胞。消化道Ins+细胞有胰岛素阳性表型(Ins+)，从而它们可以表达成熟β细胞的标记物，并分泌应答于葡萄糖和磺酰脲的胰岛素和C肽。消化道Ins+细胞主要来自N3Prog，且也来自于消化道干细胞。这些细胞是在NKO (敲除了 Foxol)小鼠中意外发现的。与胰腺β细胞不同的是，消化道Ins+细胞在消融(ablation)后可通过β细胞毒素、链脲毒素的作用再生，并逆转小鼠的高血糖症。
[0050]“ΝΚ0小鼠”或“敲除了 Foxol的小鼠”是指在N3Prog中不表达Foxol的转基因小鼠。并不是敲除了 Foxol的小鼠(下文称作“ΝΚ0小鼠”)消化道中的所有肠内分泌细胞都产生和分泌胰岛素；一些也是不产生胰岛素的细胞(下文称作“Ins_”)。
[0051]在降低Foxo蛋白的表达或生物活性的情况下，显著的降低是指将Foxo蛋白的水平降低至足以使肠内分泌细胞或其它不产生胰岛素的细胞获得Ins+表型，包括表达胰岛素。`
[0052]明显高于测试中的对照水平是指可通过通常使用的测试方法(酶联免疫吸附测定法或放射免疫法)进行检测，而在对照细胞群中通过这样的测试不能检测到胰岛素。Foxo蛋白表达水平的显著下降是指下降量大于对照值的50% (注释:我们知道下降量高达50%时，什么也不会发生，因此所述下降量必须高于50%)。
[0053]在测定对照细胞群和测试细胞群胰岛素表达水平的条件下，在与使测试细胞群变成产生胰岛素的细胞的药剂接触后，明显更高是指胰岛素的任何可靠的可检测水平，因为未处理的细胞是不产生胰岛素的细胞。筛选试验领域的技术人员根据试验能够定义明显更高或明显更低。
[0054]“预防疾病”包括但不局限于预防可能易感染疾病(或病症)的受试者中发生的疾病，但还未被诊断为患有所述疾病；抑制疾病，如抑制组织疾病的发展；如通过疾病的恢复减轻疾病；如通过减轻疾病的症状和/或延迟疾病的发作减轻由疾病引起的症状。一个实例是降低高血糖症患者的血糖水平，和/或对受试者的血糖水平保持可接受的控制。本领域技术人员可以确定所述治疗、预防、症状和/或病症，而且标准的教科书中也有记载。
[0055]“治疗”患者的疾病、病症或症状是指采取措施以获得有益的或想要的效果，包括临床效果。为了本发明的目的，有益或想要的临床效果包括但不局限于减轻或改善所述疾病的一种或多种症状；缓解疾病的程度；延迟或减慢疾病的恶化；改善和减轻或稳定病情。
[0056]当所述疾病为I型糖尿病时，所述症状包括尿频、烦渴、极度饥饿(extremehunger)、非正常的体重降低、容易疲劳(increased fatigue)、易怒、视力模糊、外阴瘙痒(genital itching)、奇怪的周身疼痛(odd aches and pains)、口干、皮肤干痒、阳痿、阴道酵母菌感染(vaginal yeast infections)、切伤和擦伤的愈合不良、过度或非正常的感染。这些症状与特征性的临床实验发现有关，所述临床实验发现包括高血糖(血液中过高的糖浓度，即>125mg/dl)、血糖失控(即血糖浓度在生理范围上下频繁且过度的改变，通常保持在40-125mg/dl)、饭后血糖波动、血胰高血糖素的波动、血甘油三脂的波动，而且包括病症的结果改善或缓解速率的下降，所述病症是由更高频率的包括微血管疾病的糖尿病加速和/或引发的，微血管疾病包括但不局限于伴随或不伴随中风、心绞痛、冠心病、心肌梗死、周围性血管疾病、肾病、肾脏损伤、蛋白尿升高、视网膜病变、视网膜中血管的新血管形成、神经病(包括可能造成四肢失去知觉和截肢和/或来自神经病变的中枢、自主和外围神经病变，或造成血流量减少)、皮肤病症(包括但不局限于糖尿病皮肤病变)、糖尿病脂性渐进坏死(Necrobiosis Lipoidica Diabeticorum)、糖尿病性大疱病(bullosis diabeticorum)、硬皮水疱病(cleroderma diabeticorum)、环状肉芽肿、细菌性皮肤感染(但不限于葡萄球菌，这会导致更深的感染)，以及胃轻瘫(gastoparesis)(胃排空异常)。I型糖尿病可以用本领域普通技术人员熟知的方法来进行诊断。例如，通常地，糖尿病患者的空腹血浆血糖的结果大于126mg/dL葡萄糖。血糖水平为100-125mg/dL葡萄糖的患者通常被诊断为前驱糖尿病。其他症状也可以用于诊断糖尿病、相关疾病和病症，以及受胰腺功能降低影响的疾病和病症。
[0057]症状“减少”是指症状的严重性或频率的降低，或症状的消除。
[0058]“与胰腺功能受损有关的病理”或胰腺功能异常是与受试者的产生和/或分泌一种或多种胰腺激素的胰腺的功能减退有关的病理，所述胰腺激素包括胰岛素和/或胰腺肽如胰高血糖素、胰腺多肽或生长激素抑制素。与胰腺功能受损有关的病理包括I型糖尿病和2型糖尿病。其它的病理包括那些有时被称作成年隐匿性自身免疫糖尿病、前驱糖尿病、空腹血糖受损、葡萄糖耐 受性受损、空腹高血糖症、胰岛素抵抗综合征和高血糖病症。
[0059]用本领域中已知的任何方法用药物或治疗性的药物组合物对受试者“进行给药”或“给药”包括直接给药，包括自我给药(包括口服给药或静脉注射、皮下注射、肌肉注射或腹腔内注射，通过肛门直肠给药)、直接进入靶组织内或上的局部给药(如有消化道InsTrog的消化道区域，如消化道N3Pix)g)或通过将治疗有效量的药物或组合物递送到靶细胞或组织的任意途径或方法进行给药。
[0060]“受试者”或“患者”是哺乳动物，通常是人，但可选地为兽医学上有意义的哺乳动物，包括但不局限于马、牛、绵羊、犬和猫。
[0061]活性剂或药物组合物的“治疗有效量”是可以实现预期治疗效果的量，所述效果如缓和、改善、减轻或消除受试者的疾病或病症的一种或多种临床表现。完整的治疗效果通过单剂量给药不一定会出现，可能仅在多剂量给药后才会出现。因此，可以通过一次或多次给药来实现治疗有效量的给药。
[0062]药物的“预防有效量”是对受试者给药时，会有预期预防效果的药物量，所述预防效果如预防或延迟疾病或症状的发作(或复发)，或降低疾病或症状发作(或复发)的可能性。完整的治疗效果通过单剂量给药不一定会出现，可能仅在多剂量给药后才会出现。因此，可以通过一次或多次给药来实现治疗有效量的给药。对于糖尿病，治疗有效量也可以为增加胰岛素分泌、提高胰岛素敏感性、提高血葡萄糖耐受性或减少体重、体重降低或脂肪量的量。
[0063]药剂的“有效量”是产生预期效果的量。
[0064]“药物学上可接受的”是指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分兼容，并
且对其接受者无害。
[0065]“Foxo 蛋白”包括小鼠的 Foxol、Foxo2、Foxo3 和 Foxo4 ;人的 F0X01、F0X02、F0X03和F0X04，和任何其他动物的Foxol-4蛋白，包括变体、和同源基因(orthologs)、和其生物活性片段。需要注意地是，虽然F0X02是单独被发现的，但是被证明与F0X03基因相同。虽然它们具有两个匪数，但是它们指向相同的基因位点。
[0066]“Foxo基因”是指编码Foxo蛋白的任意基因，包括同源基因和其生物活性片段。
[0067]“Foxo mRNA”是指编码Foxo蛋白的任意mRNA，包括同源基因和其生物活性片段。
[0068]“联合”给药包括在一段时间内对患者平行用两种药剂进行给药，如用单克隆抗F0X01、3和/或4抗体(或抗Foxol-4)或对抗其它同源基因的抗体)和在一段时间内降低F0X0U3和/或4表达或生物活性的药剂、共同给药(co-administration)(其中在大约相同的时间用药剂进行给药，如相互给药时间在几分钟至几小时内)、和联合制剂(co-formulation)(其中将药剂结合或混合成一种适合口服、皮下给药或胃肠外给药的单一剂型)进行给药。``
[0069]本发明的实施方式部分基于如下发现:敲除了 Neim)g3-F0X0l (NKO)的小鼠中编码Foxol蛋白的基因的体细胞消融使显著比例的消化道N3Prog分化为胰岛素阳性肠内分泌细胞(消化道Ins+细胞)，所述肠内分泌细胞产生和分泌生物活性胰岛素和C-肽和其他胰腺激素和转录因子。重要地是，消化道Ins+细胞在葡萄糖的刺激下以剂量依赖性方式分泌胰岛素，而且NKO突变小鼠消化道中的酸-乙醇提取物在体内有降血糖作用。而且，对NKO小鼠的体内研究显示:与胰腺β细胞不同的是，胰腺β细胞在用毒素链脲霉素处理后不会再生，而全功能的消化道Ins+细胞在NKO小鼠中可以再生，这可以在仅10天后就能使得高血糖症发生自发地逆转，并且在实验的92天中保持比未处理的动物(自由采食时约为250mg/dL或空腹约为160mg/dL)保持明显更低的血糖水平。重要地是，与未处理动物不同的是，所述动物在缺少胰岛素治疗的情形下总是死亡，75%的NKO动物在没有任何附加治疗的情形下会存活，消化道Ins+细胞分泌胰岛素的能力与环境中的血糖浓度成正比，这是胰腺中产生胰岛素的健康细胞的主要特征，到目前为止，还没有其他群组具有此特征。
[0070]数据显示消化道N3Prog具有分化为产生和分泌胰岛素的细胞的能力，但是这种能力会受Foxol基因表达的抑制。一些消化道干细胞也可以分化为Is+细胞，因此，本文中使用的术语“消化道Ins—Prog”包括能够变成Ins+细胞的任何消化道祖细胞。
[0071]以前没有人记载或猜测过保留有分化为产生胰岛素的细胞的能力的消化道中祖细胞的存在。因此，活性剂广泛地包括使消化道Ins—Prog细胞分化为消化道Ins—细胞的任何药剂。优选为降低Foxo蛋白表达或生物活性的药剂。本文中描述的筛选试验是为了鉴别活性剂。虽然本领域中有用瘦素——一种调节饮食的激素——处理可以导致消化道中出现Ins+细胞的先例，但这个过程与本文所述的过程并不同，因为本文需要另一种类型的消化道细胞“L”细胞的部分转化，“L”细胞是肠内分泌细胞。因此，没有人报道过消化道N3细胞能够产生消化道Ins+细胞，也没有任何人报道瘦素处理后Ins+细胞具有产生胰岛素的功能，更不用说以糖剂量依赖性的方式产生胰岛素。
[0072]在编码各种Foxo蛋白(Foxol、3或4蛋白)的基因和动物自身的Foxo蛋白中分别有显著的核酸和氨基酸序列同源性，所述动物包括人和小鼠。虽然优选用减少的Foxol产生消化道Ins+细胞,但是一种或多种Foxo或mRNA的表达降低或一种或多种Foxo蛋白的生物活性降低都会使显著比例的消化道InS_Prog分化成消化道Ins+细胞。
[0073]使用富含有隐窝的肠片段(segments of intestines)和从正常小鼠中分离的消化道Ins_Prog培养的细胞群的某些实验已经表明:将消化道Ins_Prog与可充分与小鼠Foxol mRNA互补的siRNA接触能够降低产生消化道Ins+细胞的Foxol的表达。这表明肠内分泌祖细胞转化 为产生胰岛素的细胞的能力并不限于对Foxol基因(即DNA)的操作，而且也能够通过抑制FoxolmRNA来实现。
[0074]至少部分基于这些发现，本发明的某些实施方式涉及产生哺乳动物消化道Ins+细胞的方法，所述方法通过将消化道Ins—Prog与药剂接触而使细胞变为消化道Ins+细胞。优选的药剂包括那些降低编码一种或多种Foxo蛋白的一种或多种Foxo基因或mRNA表达的药剂，或将一种或多种Foxo蛋白的生物活性降低到允许消化道InS_Prog分化为具有消化道Ins+细胞表型的细胞的水平的药剂。在动物中，消化道Ins—Prog可以在原位与药剂接触，或可以将浓缩的消化道Ins—Prog细胞群从消化道中分离，或可以使用培养基中的肠外植体。实施例10中描述了其中的一些方法。某些其他实施方式涉及分离的消化道Ins+细胞本身和组织外植体，所述组织外植体包括消化道Ins+细胞，优选肠道组织，但也包括人工组织。其他的方法包括从在体外已经被重编(reprogramme)为消化道N3Prog的细胞中产生Ins+细胞。也就是说，通过处理其他类型的细胞而间接获得了消化道N3细胞。例如，其他细胞通过“重编”细胞从皮肤活检中形成产生胰岛素的细胞。虽然作者没有专门对其进行测试，但是可以想象地是，为了变成产生胰岛素的细胞，这些细胞经过了 N3Prig阶段。本发明的实施方式中可以使用这些方法和本领域中已知的其他方法。Maehr R, etal.，Proc Natl Acad Sci USA.2009Sepl5;106 (37):15768-73.Epub2009Aug31, Generation ofpluripotent stem cells from patients with typeldiabetes。
[0075]本文所述治疗方法的疗效可以通过确定所述方法是否改善了所治疗的疾病的任意症状来进行监测。或者，可以监测血清胰岛素或C肽(胰岛素分泌的副产品和功能Ins+细胞的指标)的水平，在治疗时该水平应该有所提高。或者，可以通过监测正接受治疗的受试者的血糖、葡萄糖耐受性、脂肪量、体重增加、酮体或列举的疾病或病症的其它指标(indicia)来测量疗效。
[0076]除了胰岛素分泌减少，胰腺功能受损包括产生和/或分泌一种或多种胰腺激素的能力的改变，所述胰腺激素包括一种或多种胰腺多肽，如胰高血糖素、胰腺多肽、生长激素抑制素或胃饥饿素。熟知的与胰腺功能受损有关的病理包括I型糖尿病和2型糖尿病。其他的病理包括那些有时指成年隐匿性自身免疫性糖尿病的病症、前驱糖尿病、空腹血糖受损、葡萄糖耐受性受损、空腹高血糖症、胰岛素抵抗综合征和高血糖症状。所有这些都属于治疗和预防糖尿病的含义。
[0077]其他实施方式涉及使用如测试药剂文库进行筛选以鉴别诱导消化道Ins—Prog分化为消化道Ins+细胞的那些药剂的方法。其中的一些方法将在下面标题为筛选试验部分进行描述。在体外试验中，所述筛选是高产出的。已经研发了体外系统，以在试管中从不产生胰岛素的消化道祖细胞产生消化道Ins+细胞。实施例10。某些其他实施方式涉及从消化道活体组织切片(gut biopsies)得到的胰岛素阴性祖细胞中通过生物工程制成的消化道Ins+细胞，所述消化道活体组织切片是从特殊的糖尿病患者或从有发展成糖尿病危险的患者中得到的，然后，将所述消化道Ins+细胞移植回患者中，以让自身消化道Ins+细胞提供胰岛素分泌调节的来源。
[0078]而且，已经发现使用药物二氮嗪(diazoxide)可以切断通过消化道Ins+细胞的胰岛素分泌，这是控制动物中产生任何不需要的胰岛素重要且安全的措施，所述动物已经被诱导而产生了消化道Ins+细胞，或已经通过给药消化道Ins+细胞作为治疗与产生低水平的胰岛素或胰腺功能受损有关的疾病的治疗方法进行了治疗。
[0079]本文中记载的数据提供了消化道Ins—Prog可以被诱导分化为消化道Ins+细胞的直接证据，所述消化道Ins+细胞以与环境中血糖浓度成正比的方式分泌生物活性胰岛素，而且消化道Ins+细胞可通过二氮嗪进行控制。
[0080]因此，本发明的某些实施方式涉及通过给药诱使消化道Ins—Prog分化为消化道Ins+细胞的治疗有效量的药剂治疗或预防I型或2型糖尿病或本文中定义的其他列举的疾病或病症的方法，所述列举的疾病或病症与动物中不适当低的胰岛素或胰腺功能受损有关。所述药剂包括那些降低Foxo或F0X0基因或mRNA表达的药剂，或将一种或多种F0X0蛋白的生物活性降低到允许消化道Ins—Prog变成消化道Ins+细胞的水平的药剂。在一些其他的实施方式中，可以通过用治疗所需的治疗有效量的消化道Ins+细胞，优选自体细胞或部分的自体细胞对动物进行给药来治疗或预防这些病症。
[0081]概述
[0082]再生医学的一个长期目标是识别调节产生胰岛素的β细胞的基因、细胞和生化过程，在患有I型糖尿病的患者中持续进行细胞替换以达到支持所述过程的目的。原始内胚层前体细胞具有内分泌命运的过程已经被详细报导3。神经元素是一类通常包括指定神经元分化的bHLH转录因子；神经元素3(NeUr0g30r N3)促进胰腺激素的产生。胰腺和肠内分泌细胞由以转录因子Neur0g3瞬间表达为特征的祖细胞产生(1-3)。关键的步骤似乎是神经元素3-表达细胞的形成，所述细胞继续分化为所有已知类型的胰腺细胞(1，22-23)。有趣的是，神经元素3+内分泌祖细胞(本文中的N3Prog)并不仅限于胰腺，而且也发现于胃和肠中，它们在肠内分泌系统中产生大多数细胞，所述肠内分泌系统为体内最大的内分泌器官(2-3)。尽管它们有共同的内胚层源，然而，胰腺和消化道N3Prog共享即使有也很少的特性:它们产生细胞类型，所述细胞类型产生不同的肽激素，并具有显著不同的发育命运和寿命(8)。胰腺内分泌祖细胞是在胚胎发育过程中形成的，并且除在特殊情况下(24)，成年器官中不再产生胰腺内分泌祖细胞(7)，然而，消化道N3Prog可以从消化道干细胞中不断地更新，并有助于人快速-周转内分泌细胞(3)。
[0083]这两种细胞群的 不同特点与位置特异性的传统理论一致，鉴于此，部分定向祖细胞会获得命令具体命运的 位置-依赖性特性(25)。哺乳动物细胞的分化过程被看作是分级喂食-正向的过程，其中多功能的祖细胞的命运受位置诱因的限制。因此，基于在胰腺中(而不是在消化道中)分化成产生胰岛素的细胞的位置特异性的现有理论预测神经元素3-阳性内分泌祖细胞(N3 Prog)。迄今为止，没有人知道F0X01、3和/或4-在消化道中表达细胞的发育、定位和功能特性。
[0084]转录因子Foxol调节胰腺β细胞功能的多个方面(4),并在Neurog3+胰腺内分泌祖细胞中广泛表达(5)。在分离的人胎儿胰腺上皮细胞中，FOXOl的降低可增加NEUR0G3+的量(39)。与胰腺相似地是，Foxol在大部分Neurog3+肠内分泌祖细胞中表达，如双重免疫组织化学法所鉴定的(图1a和5)。
[0085]研究了小鼠的消化道Ins_细胞中Foxol的作用，以确定它是否起到决定消化道N3Prog分化成的细胞类型的作用。实验详细描述了 Foxol在消化道InsTrog分化为消化道Ins+细胞中的作用，而且发现Foxol将肠内分泌祖细胞限制为不产生胰岛素的表型，实施例和实验的描述中阐明了该发现，所述实验明确了消化道Ins—细胞的特性和它们的治疗用途。在不受理论的束缚下，所述数据显示消化道N3Prog中Foxol的生理功能是将消化道N3Prog限制为肠内分泌谱系(lineage),从而抑制胰腺分泌谱系。虽然在胰腺中FOXOl与神经元素3共同表达，但FOXOl消融不会影响不同的胰腺内分泌细胞类型的产生(28-29)。
[0086]PKO和NKO小鼠的相似性表明上皮干细胞分化早期的Foxol表达的降低也会解除胰腺内分泌谱系的Foxol依赖性抑制。重要地是，消化道N3Prog在小鼠的整个生命中都产生消化道Ins_细胞。估计这与人的情况相同。这些路径是高度保守地，并且在编码神经元素3的基因中有人突变基因，其中描述了消化道功能的异常。因此，可以在任何时间用降低消化道N3Prog中FOXO蛋白的表达或生物活性的药剂进行给药，以引发内分泌胰腺分化表型。图20也显示了这一点，证明了通过siRNA的Foxol抑制可以诱导正常小鼠中的消化道细胞变成Ins+。因为肠细胞更新特别快，治疗时可能需要定期重新用这些药剂进行给药，如下所述。显示用链脲霉素处理的NKO小鼠能够在消化道中再生产生胰岛素的细胞的结果显示所述表型比生成一代细胞持续的时间更长。
[0087]F0X0 蛋白
[0088]F0X0转录因子使激素和养分诱因与细胞转录应答相结合，以调节不同的细胞过程，所述细胞过程包括细胞存活、细胞周期进程、DNA修复和胰岛素敏感性(见综述Tran etal.，2003)。除了它们的代谢功能，F0X0蛋白可以抑制多种细胞类型的末端分化(31-32)。在胰腺中，F0X01在负调节内分泌细胞群(26-28)和促进β细胞对压力的应答中发挥着重要的作用(29-30)。F0X01消融不会影响不同的胰腺内分泌细胞类型的产生(28-29)。
[0089]Nakae等(2002)证明了小鼠Foxol在不同的组织中表达，而且在肝脏、胰腺β细胞和脂肪细胞中是胰岛素敏感性的负调节子。胰岛素向F0X01发信号的受损为2型糖尿病的新陈代谢异常提供了统一的机制。对人的研究表明F0X01可通过人PKB/Akt、在胰岛素信号级联反应中位于PI3下游的丝氨酸/苏氨酸激酶实现负调节。该调节包括F0X01在三个PKB/Akt磷酸化共同位点上快速且分级的磷酸化作用(Tran et al.，2003)。
[0090]Foxo蛋白的定义特征是叉头框(forkhead box)或基序(motif ),具有约80-100个氨基酸的DNA结合区，且由三个螺旋(helices)和两个典型的大环或“翼状物”组成。给这些蛋白标准化命名后(Kaestner et al.，2000)，对于人，使用所有都大写的字母(如F0X0)，而对于小鼠，仅第一个字母大写(如Foxol)。在基因库(NM_002015.3)中识别的F0X01基因(以前也为F0X01、FKHl、FKHRJP F0X01A)是胰岛素应答组织中最多的FOXO同种型，所述胰岛素应答组织如肝脏细胞、脂肪细胞和胰腺细胞。F0X04(aka AFX、AFX1、MLLT7、MGC120490、F0X04)列于基因库 ΝΜ_005938.3 中；F0X03 (aka、F0X02、AF6q21、FKHRLl、F0X03A、FKHRLlP2 ；MGC12739、MGC31925、DKFZp781A0677)列于基因库NM_001455.3中。所有内容都通过引用的方式纳入本文。本领域技术人员根据这个序列并使用本领域已知的方法将能够构建合适的反义核酸和siRNA。
[0091]编码各种FOXO蛋白的基因和动物自身蛋白的基因之间的明显同源是指靶向于FOXOlmRNA的shRNA、SiRNA和反义RNA或DNA，或所述基因也可以与F0X03和F0X04充分互补，以减少它们的表达，所述动物包括人和小鼠。类似地，旨在靶向于F0X04或F0X03的siRNA和反义可以与F0X01充分互补，以减少其表达。因为实验是对小鼠进行的，所有的命名都使用的小写字母，然而，本文中使用的“Foxo”是指来自任何物种的任意Foxo蛋白、基因或mRNA。为了本发明的方法和组合物的目的，“ Foxo蛋白”包括同源序列(不同物种的类似物)，如Foxol和其生物活性片段。在某些实施方式中，目的消化道Ins+表型源于降低的一种或多种Foxo蛋白的表达或活性。因此，也希望减少包括F0X02、F0X04和F0X03的其他叉头蛋白而将不产生胰岛素的细胞变成产生胰岛素的细胞，或单独或伴随F0X01减少。
[0092]由于序列同源性，不利于小鼠Foxol的反义或siRNA可以在其他动物包括人中使用，反之亦然。因此，所有的基因IDs和序列号以及编码Foxo蛋白的相应核酸、基因、mRNA和cDNA都以引用的方式将其全部明确地纳入本文。
[0093]表I用于FOXO基因和 mRNA的基因ID号
[0094]