专利名称：来源于马尼拉水蛭的透明质酸酶,分离、纯化和重组生产方法图1)，等电点为7.2-8.0。表1马尼拉水蛭酶的制备纯化原材料的制备来自孟加拉的水蛭～15kg↓分离活动物冷冻这些动物↓头的制备～1kg水蛭头↓匀浆与抽提*酸沉淀离心**阶段I-样品36％硫酸铵沉淀上清液离心、透析**阶段II-样品阳离子交换EMD(SO3-)*层析透析***↓Con A-亲和层析透析***↓丙基-Fractogel层析*透析***↓透明质酸片段(HA)-亲和层析透析***↓二醇-LiChrospher层析****→140 000 WHO单位↓反相层析分析****表2马尼拉水蛭酶从1kg水蛭头中的纯化(富集) 表3马尼拉水蛭酶与已知水蛭透明质酸酶的比较 表中的星号是指关于活性测定和生物化学表征的信息(*_*****)。使用的活性测定和生物化学表征方法取决于分析样品中马尼拉水蛭酶的浓度。因此，它们在连续纯化步骤中通过适当技术连续扩展。*-活性测定-浊度降低检测**-活性测定-浊度降低检测-蛋白质含量测定(E280，Pierce BCA方法)-SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)-血红蛋白测定***-活性测定-浊度降低检测-蛋白质含量测定(E280，Pierce BCA方法)-SDS-PAGE-Western印迹(抗人血红蛋白抗体)****-活性测定-浊度降低检测-蛋白质含量测定(E280，Pierce BCA方法)-SDS-PAGE-Western印迹，抗人血红蛋白抗体-SDS-PAGE-Western印迹，抗Con A抗体-SDS-PAGE-Western印迹，抗肽抗体*****-MALDI-蛋白质含量测定(Pierce BCA方法)-SDS-PAGE-Western印迹-抗肽抗体马尼拉水蛭酶与伴刀豆球蛋白A的结合显示，透明质酸酶是一种糖蛋白，其糖成分终止于α-D-吡喃甘露糖基或α-D-吡喃葡糖基和空间相关的残基。马尼拉水蛭酶活性样品在SDS-PAGE中显示RF值几乎相同的两条带。较长的SDS-PAGE和不同的电泳条件可用于更好地分离这些条带。在这些实验中，能检测到另外两条较弱的带(图2)。它们全部的N端部分(30个氨基酸)分别测序，再次显示N端无差异。用内切-F-糖苷酶(PNGase)去糖基化后，观察到所有4条带产生一条带，MW降低约3。因此，观察到的电泳迁移率的差异极有可能是由于马尼拉水蛭酶分子糖基化模式的差异。神经氨酸酶、O-内切-糖苷酶和神经氨酸酶加O-糖苷酶处理对纯化的酶的分子量无影响(图3)。这些结果表明，马尼拉水蛭酶含有至少一种N-连接的寡糖链。O-连接的糖链不能用所用的方法检测到。作为结束的纯化步骤，进行RP-层析。尽管还不能检测到酶活性，但能除去盐和肽蛋白酶抑制剂(图4)。利用MALDI进一步表征含有蛋白质的级分。利用MALDI测定的马尼拉水蛭酶分子量为58.3。
肝素对该透明质酸酶的活性没有影响(图5)。马尼拉水蛭酶比欧洲医蛭透明质酸酶稳定许多倍(图6)。而且，部分纯化的马尼拉水蛭酶的样品在狗和大鼠血浆中显示极高的稳定性，范围为-20到+37。
HA-亲和基质的制备已经在文献中描述(Tengblad A.，生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，1979，578，281-289)。该HA-基质用于从相同来源中纯化软骨透明质酸盐结合蛋白或蛋白聚糖蛋白质-硫酸角质素核(Christner J.E.，分析生物化学(Anal.Biochem.)，1978，90，22-32)。利用亲和基质纯化的HA-结合蛋白(HABP)进一步用于关于透明质酸盐受体(Green S.J.等人，细胞科学杂志(J.Cell Science)，1988，89，145-156；Chan F.L.等人，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)，1997，107，289-301)或hyaluronan(Waldenstrom A.等人，1991，临床研究杂志，88，1622-1628；Waldenstrom A.等人，欧洲临床研究杂志(Eur.J.Clin.Invest.)，1993，23，277-282)在组织中分布的组织化学研究。
然而，我们实验室发展的这种凝胶的制备方法使人们能生产可准确确定HA片段浓度(1-15mg/ml)的凝胶。这又使得人们能使用这些凝胶，利用它们对hyaluronan的不同亲和力，不仅用于hyaluronan结合蛋白的纯化，而且用于其分离。这种选择性制备能利用不同长度的HA片段来控制。这种分离可使人们能更好地表征生物学相关的多种受体(例如在肿瘤学中)。
按照所述方法制备的HA-基质能用于1)已知HA-结合蛋白的纯化2)未知HA-结合蛋白的纯化3)新HA-结合蛋白的鉴定4)透明质酸酶的纯化用本发明所述方法获得的HA-片段能利用现代分析方法(NMR，MALDI-MS)表征，并应用于对蛋白质-蛋白质相互作用的研究。此外，这些片段也能应用于关于血管生成和新血管生成过程的研究。
附图简述图1蛋白质标准、马尼拉水蛭酶样品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE-CBB染色)(在二醇-LiChrospher层析后)。
1-宽范围蛋白质标准2-马尼拉水蛭酶，4μg3-Orgelase，6μg4-血红蛋白，40μg图2a)SDS-PAGE(CBB染色)和b)HA-亲和层析后对4种马尼拉水蛭酶活性样品的SDS-PAGE-Western印迹(3-6道)。在该实验中使用兔P3-2A多克隆抗肽抗体。
图3下列样品的SDS-PAGE(CBB)1-LW-MM-低分子量标记(BioRad)2-马尼拉水蛭酶3-N-糖苷酶F(PNGase F)4-用PNGase F处理后的马尼拉水蛭酶5-用O-糖苷酶处理后的马尼拉水蛭酶6-用O-糖苷酶和神经氨酸酶处理后的马尼拉水蛭酶7-O-糖苷酶和神经氨酸酶8-分子量标记(MWM-预染色的，BioRad)图4下列样品的反相层析a)核糖核酸酶标准b)马尼拉水蛭酶样品(比活140kU/mg)图5肝素对马尼拉水蛭酶(-O-)和牛睾丸透明质酸酶(-·-)的透明质酸酶活性的影响X轴IU肝素；Y轴保留的％活性图6透明质酸酶在缓冲液和血浆中的稳定性测定(a)马尼拉水蛭酶(4℃)，(b)马尼拉水蛭酶(-20℃)(c)马尼拉水蛭酶(37℃)(d)牛睾丸透明质酸酶(Y)和欧洲医蛭透明质酸酶(A)
X轴温育天数；Y轴WHO(IU)单位图7通过测定从马尼拉水蛭中分离并纯化的根据本发明的蛋白质的序列而获得的天然马尼拉水蛭酶的氨基酸序列(对应于SEQ IDNo.1)。
图8重组马尼拉水蛭酶克隆(克隆21)的核苷酸(上面的行)和氨基酸序列；(对应于SEQ ID No.2，3)。
图9重组马尼拉水蛭酶克隆(克隆31)的核苷酸(上面的行)和氨基酸序列；(对应于SEQ IDNo.4，5)。
图10重组马尼拉水蛭酶克隆(克隆31)的核苷酸(上面的行)和氨基酸序列；(对应于SEQ ID No.6，7)。
图11用于马尼拉水蛭酶的大肠杆菌表达载体图12用于马尼拉水蛭酶的Baculo供体质粒图13用于马尼拉水蛭酶的酵母表达载体本发明通过下列实施例详细描述。然而，这些实施例不将本发明限制于实验中使用和在实施例中所述的普通材料、方法、物理参数、化合物、生物材料、表达载体和宿主等。如果没有另外提出，使用现有技术中周知的标准技术和通常可获得的材料。
实施例1(一般说明)使用马尼拉水蛭的粗提物进行多次预实验，以建立纯化方法。
选择并验证下列方法硫酸铵沉淀法，阳离子和阴离子交换层析，利用肝素-Fractogel、Con A-Sepharose的亲和层析，在辛基-Sepharose、丙基-、苯基-、丁基-Fractogel上的疏水作用层析(HIC)，制备等电聚焦和制备电泳。
结果显示，酸和铵沉淀、阳离子交换、Con A-Sepharose、丙基-Fractogel HIC和二醇-LiChrospher和透明质酸片段-Sepharose(HA-Sepharose)层析适用于马尼拉水蛭酶的纯化。我们实验室制备的HA-Sepharose基质成功地用于该糖苷酶的纯化。
除非另外指出，所有制备都在低温下进行。
纯化按照以上所示的方案进行(表1)。
实施例2用于纯化的原材料的制备；水蛭头的制备。
在孟加拉国收集的马尼拉水蛭水蛭立即骤冻，然后贮存于-40℃至-80℃中。它们在冷冻状态下切下头部，头的重量约占体重的5％。
实施例3马尼拉水蛭酶从水蛭头的提取方法在典型纯化中，1kg冷冻水蛭头在Waring搅拌器中用2500ml含0.025％硫柳汞和17mg/ml海藻糖的冷0.1M乙酸缓冲液pH4.0(MerckKGaA，Art.No.1.08216)匀浆。轻轻搅拌匀浆，并立即加入下列蛋白酶抑制剂1.PMSF 1.7mg/ml 10.0mM2.亮抑蛋白酶肽 10.0μg/ml 20.0μM3.胃酶抑制剂A 0.7μg/ml 1μM4.EGTA 380.35μg/ml 1.0mM5.p-APMSF 40.0μg/ml 20.0μM在低温下连续搅拌4小时，并以4900转/分离心20分钟。收集上清液溶液(上清液I)，并与随后通过提取组织沉淀获得的上清液II合并。
合并的上清液代表阶段I物质。该方法总结于下列方案中 *样品的活性测定和生物化学表征利用活性测定-浊度降低检测和蛋白质含量测定(E280，Pierce BCA方法，SDS-PAGE)进行。
测定水蛭匀浆的酶活性是不可能的，因为血红蛋白(用血红蛋白测定试剂盒测定，Merck KGaA，13851)和其他蛋白质含量极高。而且，透明质酸酶活性在酸沉淀之前的阶段不能测定。这些提取物的最终比活(每mg蛋白质的活性)约为10-30 WHO单位。根据SDS-PAGE，粗提物含有大量不同的蛋白质，主要的分子量为～120、55～60、45、31、28、22、15和14-10。
实施例4阶段I物质的硫酸铵沉淀步骤然后，选择硫酸铵沉淀步骤作为马尼拉水蛭酶纯化的第一步，这导致该酶富集～5倍。
通过在+4℃下缓慢加入固体硫酸铵(Merck KGaA)至36％w/v，从阶段I的粗提物中沉淀酶学惰性的物质。搅拌该混合物1小时并离心。弃去沉淀物。上清液对流动的去离子水透析过夜，并对20mM磷酸缓冲液pH6.0透析24小时。这些提取物的终比活约为40-150 WHO单位。根据SDS-PAGE，阶段II提取物含有大量不同的蛋白质。
实施例5阳离子交换层析以分批吸附方式使用阳离子交换剂。富含酶的透析样品(阶段II)与1升Fractogel EMD SO3-650(S)阳离子交换剂，Merck KGaA，Art.No.16882温育过夜。在通过离心结束温育后，用缓冲液洗涤阳离子交换剂，再次离心，并使HPLC-Superformace柱充满凝胶。用20mM磷酸缓冲液pH4.9洗涤该柱后，用含有0-1M线性NaCl梯度的相同磷酸钠缓冲液pH6.0从该柱上洗脱下结合的蛋白质。每3分钟收集级分(9ml)，监测280nm的吸光度。马尼拉水蛭酶在0.15-0.18M NaCl浓度时被洗脱。测定所有级分的活性和蛋白质含量，合并级分，并对含有叠氮钠和17mg/ml海藻糖的20mM磷酸缓冲液pH6.0透析过夜。
进行蛋白质浓度、“合并液”的比活的测定和SDS-PAGE分析。尽管有极高的产量(活性)和高比活(每mg蛋白质的WHO活性单位，相当于IU)，样品的SDS-PAGE分析结果仍显示许多蛋白质的混合物。利用Fractogel EMD SO3-650(S)_(Merck KGaA，德国)的阳离子交换层析导致约10-50的极高的纯化倍数。该步骤在减少血红蛋白杂质上极其有效。而且，我们发现，分批方法是处理大体积阶段II上清液(5-16升)的极有用的初始步骤。
实施例6伴刀豆球蛋白A-Sepharose亲和层析利用Con A凝集素亲和层析在阳离子交换后进行对富含酶的合并液的进一步纯化。可从Pharmacia Biotech，Art.17-0440-01购得的Con A-Sepharose_用乙酸缓冲液0.1M+0.5M NaCl pH8.0；0.1M硼酸+0.1％Triton×100 pH6.0，最后用0.1M乙酸缓冲液+0.5M NaCl pH6.0洗涤。样品对20mM乙酸缓冲液+0.5M NaCl+1mM CaCl2+1mM MgCl2pH6.0+1mM MnCl2透析过夜，在室温下加于1000ml ConA柱上，并用510ml 100mM乙酸缓冲液+0.5M NaCl+1mM CaCl2+1mM MgCl2pH6.0+1mM MnCl2洗脱2小时。
随后利用含有0.5M甲基-α-D-吡喃甘露糖苷的相同缓冲液解吸。在280nm下连续监测洗脱。测定已收集的3ml级分的透明质酸酶活性。合并活性级分，对含有叠氮钠和17mg/ml海藻糖的20mM磷酸缓冲液pH6.0透析过夜。
进行蛋白质浓度、“合并液”的比活的测定和SDS-PAGE分析。该步骤在除去剩余血红蛋白上极有效。ConA层析导致4-10的纯化倍数。该倍数因原材料的质量而不同。
实施例7丙基Fractogel疏水作用层析向透明质酸酶活性Con A-合并液中加入硫酸铵至2M的终浓度。然后将样品与150ml丙基-Fractogel EMD丙基650(S)_，Merck KGaA，德国，Art.No.1.10085在室温下温育1小时，用含有2M硫酸铵的0.1M磷酸缓冲液pH7.0平衡。待温育结束后，用相同缓冲液洗涤凝胶两次，制备HPLC-Superformance(2.6cm×60cm)柱。用0.1M磷酸缓冲液pH7.0洗脱结合的蛋白质。每3分钟收集6ml级分，直接对去离子水透析(2-3小时)，然后对20mM磷酸缓冲液pH6.0透析。测定级分的透明质酸酶活性。合并活性级分，并对含有叠氮钠和17mg/ml海藻糖的20mM磷酸缓冲液pH6.0透析过夜。进行合并液的蛋白质和活性测定。
该层析步骤的纯化倍数约为3-5。前一步骤中从载体凝胶中释放的少量Con A以及其他蛋白质杂质被去除。
实施例8透明质酸寡糖亲和柱的制备(a)用牛睾丸透明质酸酶对hyaluronan(HA)的水解通过在甲苯存在下在4℃下混合过夜，将透明质酸7g溶解于1.25升含0.15 NaCl和0.5mM EDTA的0.1M乙酸钠缓冲液pH5.2中。之后将含HA溶液的pH调节为5.2，并在升温到37℃后加入牛睾丸透明质酸酶(Merck KGaA；700 WHO单位/mg)。对于7g HA，使用在用前立即溶解于50ml上述缓冲液的210mg酶。使水解在恒定搅拌下在37℃下进行30分钟，通过在沸水浴中100℃加热5分钟终止。通过以10000g离心30分钟澄清反应混合液，弃去含有变性蛋白质的沉淀，上清液通过上面放置有一个玻璃纤维预过滤器的0.2μm滤膜。利用通过如下具有不同分子截断值的树Diaflo超滤膜(Amicon)过滤，分级分离含有HA寡糖(HAOS)的澄清溶液。
(b)通过超滤对HAOS的分级分离由上一步获得的含HAOS溶液通过30YM Diaflo超滤膜过滤。保存存留液用于其他研究，而滤过液通过10YM Diaflo超滤膜进行第二次超滤。再保存存留液用于其他研究，而通过10YM的溶液通过3YM Diaflo膜进行最后一次超滤。之后，含HA-OS的存留液，约10ml溶液，用于进一步的纯化。该级分HAOS 3-10如下纯化并进一步用于与Sepharose偶联。
(c)HAOS 3-10的纯化HA-OS 3-10用Biogel P2_柱纯化(脱盐)。该柱(4cm×100cm)用Biogel2基质_装填，200-400目(BioRad)，用5倍柱体积的水洗涤(Milli Q，Millipore)。由前一步获得的HAOS 3-10级分(15ml；1.5g寡糖)加于该柱上。该柱用水洗脱，收集15ml级分，分析HA寡糖的存在。合并在盐(用AgNO3检测)之前洗脱的含寡糖级分，并再次用3 YM Diaflo膜浓缩。
(d)HAOS 3-10的分析为了确定Sepharose的偶联效率，洗涤凝胶(同一批)并悬浮于水中以制备50％浆液。从用作对照的Sepharose HAOS 3-10结合物和Sepharose悬液中一式三份取出100μl等份，加入在盖有特氟隆螺旋帽的管中的2.5ml 2.2N三氟乙酸(TFA，Merck KgaA)中。为了水解，用氩冲洗该混合液，并在100℃下温育16小时。在水解结束时，样品在氮气下干燥，重悬浮于水中，用于测定葡糖胺和糖醛酸。为了确定每次水解糖醛酸和葡糖胺分解的程度，包括含有已知量UA或GIcNAc的对照样品，并在相同条件下温育。
在上述条件下，在两次独立实验中每1ml排出的Sepharose凝胶偶联5、8、9、11和15mg HAOS 3-10。该结果基于UA和葡糖胺测定。
(e)使用的测定分析样品中糖醛酸的含量按照Bitter T.和Muir H.M.，分析生物化学，1962，4，330-334测定。
己糖胺含量用Rondle C.J.M.和Morgan W.T.J.，生物化学杂志，1995，61，586-593的方法分析。
实施例9透明质酸片段Sepharose层析(HA-Sepharose层析)含有8-10mg/ml的层析基质如下所述制备。含酶样品对20mM乙酸缓冲液+0.15M NaCl pH4.0透析，并加于25ml HA-Sepharose柱上。在用相同缓冲液洗涤后，用含0.15-1M NaCl梯度的20mM乙酸缓冲液进行洗脱。
1ml级分在透明质酸酶活性测定试验中检测，合并，对含有叠氮钠和17mg/ml海藻糖的20mM磷酸缓冲液pH6.0透析过夜。进行合并液的蛋白质和活性测定。该层析步骤的纯化因数约为3。
实施例10二醇-LiChrospher层析对Milli-Q-H2O透析的20ml活性样品加于二醇-LiChrospher柱上。然后用15ml Milli-Q-H2O平衡该柱，用2ml水洗涤5分钟。用20mM乙酸缓冲液pH5.9(梯度，0-5mM NaCl)进行活性样品洗脱15分钟，用含5mM NaCl的梯度20mM-100mM乙酸缓冲液pH5.5进行35分钟。测定级分的透明质酸酶活性。合并活性级分并对含有叠氮钠和17mg/ml海藻糖的20mM磷酸缓冲液pH6.0透析过夜。进行合并液的蛋白质和活性测定。纯化因数3。
实施例11RP 18e层析该纯化步骤只能用作最后一步，其目的在于获得不含盐和其他蛋白质杂质(例如肽蛋白酶抑制剂)的样品。透明质酸酶活性完全丧失，因为马尼拉水蛭酶对该步骤中使用的有机溶剂没有抗性。马尼拉水蛭酶样品加于RP 18e柱上。收集0.25mg/min级分。在0.1％TFA存在下进行洗脱，使用水到99％乙腈的梯度。RP纯化的样品能直接用于氨基酸测序、MALDI测定、糖结构分析，和作为标准用于其他批次马尼拉水蛭酶的纯化。
实施例12活性测定——浊度降低检测用浊度降低测定进行透明质酸酶活性测定。可购得的hyaluronan(分离自不同的动物组织和液体，如人脐带、公鸡冠)和透明质酸酶(来源于牛睾丸、猪睾丸、蜂毒的内切-β-氨基葡糖苷酶；来源于Streptomyceshyalurolyticus的裂合酶)制剂用于建立合适的活性测定条件。我们实验室中部分纯化了来源于欧洲医蛭的内切-β-葡糖醛酸糖苷酶。
通过将HA溶解于0.3M磷酸缓冲液pH5.3中制备hyaluronan贮存液(浓度为2mg/ml)。该溶液在测试前直接用相同缓冲液稀释至0.2mg/ml的浓度。含酶样品用含0.01％牛白蛋白和77mM NaCl的20mM磷酸缓冲液(酶稀释缓冲液)稀释为适量的酶(0.5-5 WHO单位)。向0.1ml这些样品中加入0.1ml hyaluronan(0.2mg/ml)溶液，混合并在37℃下温育45分钟。测试一式两份进行。通过用1.0ml白蛋白试剂(溶于80mM乙酸/40mM乙酸钠缓冲液pH3.75中的0.1％白蛋白)稀释终止该反应。在室温或37℃温育10分钟后，读取600nm的光密度，活性通过与标准比较(SLT-程序)表示为WHO(IU)单位。牛睾丸透明质酸酶的WHO制剂(HumphreyJ.H.，世界卫生组织公告(Bull.World Health Org.)1957，16，291-294)用作标准。
实施例13蛋白质估测通过测量溶液在280nm的紫外吸光度确定柱洗脱液的蛋白质含量。合并级分的蛋白质浓度利用Pierce微量测定法测定。BSA溶液用作参照蛋白质。
实施例14SDS-PAGE电泳按照Laemmli方法进行电泳(自然，1970，227，680-685)。使用下列凝胶4-20％梯度或12.5％分离胶及4％积层胶。样品在十二烷基硫酸钠和β-巯基乙醇存在下进行电泳。在用考马斯亮蓝染色和/或银染(按照Pharmacia说明)后显示蛋白质。
实施例15等电聚焦为了对马尼拉水蛭酶制剂进行等电聚焦研究，采用供应商(Pharmacia)提供的方法。聚焦后，固定凝胶并进行银染(按照Pharmacia方案)。
实施例16由兔免疫血清制备免疫球蛋白(抗-ConA、抗血红蛋白和抗-肽兔抗体)利用下列免疫原产生兔血清伴刀豆球蛋白A凝集素、血红蛋白与肽-KLH偶联物的混合物。肽序列与马尼拉水蛭酶的14氨基酸N端部分相同(KEIAVTIDDKNVIA)。
按照标准Pharmacia说明用蛋白A Sepharose(Pharmacia，17-0780-01)柱纯化血清。利用SDS-PAGE和ELISA试验核实IgG样品的纯度。
实施例17Western-免疫印迹测定合适的样品等份和预染色的已知分子量的蛋白质标记如上所述进行SDS-PAGE。使用预染色的BioRad分子量标记。在转移缓冲液存在下将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶向固定的聚二氟乙烯(PVDF)膜电泳转移(0.8mA/cm2)100分钟。PVDF膜与封闭液(PBS，pH7.5+2％脱脂奶)在室温下温育1小时。然后，该膜与用封闭液适当稀释的抗体在室温下温育2小时。该膜用TBS+0.05％吐温20，pH7.5洗涤，并与BioRad的山羊抗兔碱性磷酸偶联物(第二抗体)在室温下温育2小时。该膜用TBS+0.05％吐温20洗涤两次，并与BCIP碱性磷酸酶底物液温育10分钟。加入终止缓冲液终止反应。
实施例18氨基酸测序马尼拉水蛭酶的N端33个氨基酸残基的序列通过Edman降解获得。在马尼拉水蛭酶活性样品进行SDS-PAGE后，将条带转移到PDVF膜上，用考马斯蓝染色，切下并测序。对于利用RP-柱层析在最后一个纯化步骤后获得的样品，发现有相同的氨基序列。
实施例19酶活性的pH依赖性(对于从马尼拉水蛭和欧洲医蛭头中分离的透明质酸酶)在本实验中使用的透明质酸酶样品从马尼拉水蛭或欧洲医蛭头中提取，并利用硫酸铵沉淀和阳离子交换层析部分纯化。含有500 WHO单位/ml的每一样品在-20℃、+4℃和37℃和pH 2.6-9.0下温育(对于pH2.6-5为20mM乙酸；对于pH5-9为20mM磷酸缓冲液)。酶活性在1、2和7天温育期后测定。在酸性和碱性极端pH时，对于两种透明质酸酶观察到相同程度的活性抑制。然而，在较长的温育期间，马尼拉水蛭酶比欧洲医蛭透明质酸酶更稳定例如在pH7.0和4℃和37℃下温育7天后，马尼拉水蛭酶分别保留初始活性的75％和60％。在相同条件下温育的欧洲医蛭透明质酸酶在1天后已经失活。
实施例20在狗血清存在下透明质酸酶的稳定性测定(对于从马尼拉水蛭和欧洲医蛭头中分离的透明质酸酶)
5kU/ml马尼拉水蛭酶样品、欧洲医蛭和牛睾丸透明质酸酶用狗或大鼠柠檬酸化血浆稀释至250U/ml的终浓度。然后，这三种溶液在-20℃、+4℃和37℃下温育0-7天。在该实验中包括用缓冲液稀释的含相同透明质酸酶的对照。最后，测定透明质酸酶活性。
实施例21污染酶活性在水蛭透明质酸酶纯化过程的每一阶段，都按照Twining S.S.(分析生物化学，1984，143，30-34)利用通用蛋白酶底物(BoehringerMannheim，目录号1080 733)检测制剂中能降解蛋白质的其他酶。
实施例22肝素对透明质酸酶活性的影响透明质酸酶切割hyaluronan导致还原糖的释放。释放的糖的量通过改进的Park法(Park J.和Johnson M.；生物化学杂志1949，181，149)比色测定。为了确定肝素对马尼拉水蛭酶和牛睾丸透明质酸酶活性的影响，进行两种活性测定一种在肝素存在下，第二种不含肝素。透明质酸酶样品25μl(3.2 WHO单位)与含有0-24单位肝素的25μl肝素(Liquemin，Fa.Hoffmann LaRoche)溶液在37℃下温育30分钟。然后，加入50μl hyaluronan(2.5mg/ml)，在37℃下继续温育30分钟。通过在100℃下加热2分钟终止反应。然后，向灭活的消化液中加入100μl碳酸盐-氰化物和100μl铁氰酸钾溶液。样品在沸水浴中加热15分钟，然后在冰浴中冷却。之后，向反应混合液中加入0.75μl硫酸铁铵溶液。在室温下温育15分钟后，用Shimadzu分光光度计测量690nm的显色。在每次试验中包括合适的空白和无酶对照。对于所分析的样品类型，用希望的还原糖(葡萄糖醛酸或N-乙酰-葡糖胺)作为标准。
实施例23马尼拉水蛭酶的去糖基化利用PNGase F酶(BioLabs Art.No.701L)按照使用说明书使马尼拉水蛭酶样品去糖基化。去糖基化在变性和自然条件下进行。O-聚糖酶、神经氨酸酶和神经氨酸酶+O-聚糖酶处理根据Boehringer Mannheim标准要求进行。所有样品都用SDS-PAGE和活性测定试验表征。
实施例24大肠杆菌表达载体的构建(图11)为了在大肠杆菌中表达，我们使用一种修饰形式的质粒pASK75，其携带tet启动区。{Skerra，基因151，(1994)，131-135页}。通过在XbaI与HindIII位点之间克隆一个新接头进行修饰。该新接头含有ompA前导序列、另一个多克隆位点和6×His尾代替strep-尾。
在pAsK75中克隆的接头序列。Xbal119CTAGATAACG AGGGCAAAAA ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTGTATTGC TCCCGTTTTT TACTTTTTCT GTCGATAGCG CTAACGTCAC CGTGACCGAC 179 GTTTCGCTAC CGTAGCGCAG GC AT CGA TGA ATT CGA GCT CGG TAC CCG GGGCAAAGCGATG GCATCGCGTC CG TA GCT ACT TAA GCT CGA GCC ATG GGC CCC 230ATC CCT CGA GGT CGA CCT GCA GGC AGC GCTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATAG GGA GCT CCA GCT GGA CGT CCG TCG CGATACTCTCCTAGCGTAGTGGTAGTGGT 286TCACTAATAGAAGTGATTATCTTCGA 为了构建马尼拉水蛭酶的表达载体，利用PCR方法导入5’ClaI和3’Ec047III限制位点是必要的。因此使用两条引物5’ATC GAT AAA GAG ATT GCC GTG AC和5’GTT GTT TCC GAT GCT AAA GCG CTPCR产物首先克隆到PCRII载体系统(Invitrogen)中并测序。
第二步，利用限制位点5’ClaI和3’Eco47III将马尼拉水蛭酶基因克隆到修饰的pASK75载体中。
在第二次PCR反应中表达并证明该重组马尼拉水蛭酶的活性后，除去His尾，将马尼拉水蛭酶基因的起始密码子与ompA前导序列直接融合。该PCR反应的引物是5’ACC GTA GCG CAG GCC AAA GAG ATT GCC GTG和3’CAC GGC AAT CTC TTT GGC CTG CGC TAC GGT。
实施例25Baculo供体质粒的构建(图12)为了在Baculo病毒表达系统中表达马尼拉水蛭酶，使用来自GibcoLife Technologies的Bac-To-BacTM杆状病毒表达系统。为了得到分泌系统，将蜜蜂蜂毒肽前导序列与马尼拉水蛭酶基因融合，并引入限制位点5’BamHI和3’KpnI。进行一次PCR反应。
5’引物CGG ATC CAT GAA ATT CTT AGT CAA CGT TGC CCT TGTTTT TAT GGT CGT ATA CAT TTC TTA CAT CTA TGC GAA AGAGAT TGC CGT GAC3’引物AAT GTT GAA GCA TAA GGT ACC将PCR产物克隆到PCRII载体(Invitrogen)中并测序。然后利用限制位点5’BamHI和3’KpnI将蜂毒肽-马尼拉水蛭酶融合体克隆到pFastBac载体中(图12)。
实施例26酵母表达载体的构建(图13)为了在酵母中表达，我们使用毕赤酵母(Pichia)多拷贝表达载体(Invitrogen)。为了构建用于马尼拉水蛭酶的表达系统，我们使用对马尼拉水蛭酶基因的PCR扩增法，这样产生相容的限制末端(5’EcoRI，3’NotI)，用于向合适的载体(pPIC9K)中连接。因此使用下列引物5’GTA GAA TTC AAA GAG ATT GCC GTG ACA3’GAT GCT AAT GTT GAA GCA TAA TGA GCG GCC GC在转化毕赤酵母原生质球之前，表达载体必须用SalI线性化。
实施例26在大肠杆菌中的表达用含有与ompA前导序列融合的sarastatin结构基因的表达载体pRG72转化W3110感受态细胞。细胞生长至对数中期，然后加入200μg aTC/l诱导启动子。1小时后能清楚地检测到重组马尼拉水蛭酶。
实施例27重组杆状病毒和马尼拉水蛭酶的产生利用Bac-To-Bac表达系统的表达用供体质粒pTD13转化DH10Bac感受态细胞，该细胞含有具有一个mini-attTn7靶位点的杆粒和辅助质粒。供体质粒上的mini-Tn7元件在辅助质粒提供的转座蛋白存在下能转座到杆粒上的mini-attTn7位点上。根据lacZ基因的破坏鉴定含有重组杆粒的集落。由选择的含有重组杆粒的大肠杆菌克隆制备高分子量mini-prep DNA，然后用该DNA转染昆虫细胞。
在表达试剂盒说明手册中能见到详细叙述。
实施例28在酵母中的表达为了确定已经整合马尼拉水蛭酶基因，必须对His+Mut+-突变体筛查菌落。
用单菌落接种1升摇瓶中的100ml培养基。生长条件是28-30℃，250转/分，可达OD 2-6。为了诱导表达，首先离心培养物，倾弃上清液，将细胞沉淀重悬浮于1/5原始培养体积的新培养基中。每24小时加入100％甲醇至0.5％的终浓度以保持诱导。最多6天后，通过SDS-PAGE和活性测定分析上清液。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>来源于马尼拉水蛭的透明质酸酶，分离、纯化和重组生产方法<130>马尼拉水蛭酶<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>488<212>PRT<213>水蛭<400>1Lys Glu Ile Ala Val Thr Ile Asp Asp Lys Asn Val Ile Ala Ser Val1 5 10 15Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro20 25 30Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp Ile Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys35 40 45Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe50 55 60Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp65 70 75 80Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr Ile Thr Arg85 90 95Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Glu Asp100 105 110Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp115 120 125Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu Ile Gly Lys Lys Met Thr130 135 140Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val145 150 155 160Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn Ile Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro165 170 175Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly 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