尖孢镰刀菌bm201、其产生的复合果胶酶及复合果胶酶的制备方法和应用的制作方法 CGMCC NO.9108 20140422 [0002] 果胶类物质是由多个D-乳糖醛酸通过α -1，4糖苷键相互连接形成的直链状聚合 物。果胶类物质广泛存在于植物初生壁和细胞间隙中，构成相邻细胞中间层黏结物。同时 果胶类物质还能与纤维素和半纤维素等非淀粉多糖交织在一起形成细胞壁。 [0003] 果胶酶是一种能够分解果胶质类物质的复合酶，由于果胶类物质广泛存在于植物 细胞的各个部位中，现有技术多通过果胶酶对植物细胞中的果胶进行分解，以破坏植物细 胞结构和植物组织结构。果胶酶可用于植物中生物活性物提取的前处理过程中，广泛应用 于果汁澄清、麻类脱胶、纺织行、造纸、饲料、环境保护及污水处理等行业。另外，果胶酶在果 实脱皮方面的应用也有较好的前景，它能够降低脱皮过程中对果肉的能耗，减少废水的排 放，提尚广品的安全性。 [0004] 基于果胶酶的特性及广泛用途，目前有关产果胶酶微生物的筛选、发酵条件优化 等的研宄异常活跃，成为生物酶制剂领域中的一个新的研宄热点。目前能够生产微生物果 胶酶的菌种很多，来源极其广泛，主要包括细菌、真菌、放线菌，其中以曲霉和杆菌研宄报道 为多。 [0005] 脐橙加工中脱囊衣工艺目前主要采用传统柑橘罐头酸碱处理的工艺，需人工剥 皮、分瓣，生产效率低；酸碱囊衣用水量大，环境污染严重；脱除囊衣后的橙汁胞易受污染， 降低了产品的安全性；现有脱囊衣工艺不适合处理具有囊衣厚、囊衣与果实结合紧密结构 的脐橙去皮果球。



[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种尖孢镰刀菌种新菌株。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供上述菌株在生产复合菌剂中的应用。
[0008] 本发明的第三个目的在于提供上述菌株产生的复合果胶酶。
[0009] 本发明的第四个目的在于提供上述复合果胶酶在分解植物果实外皮中的应用。
[0010] 本发明的第五个目的在于提供上述复合果胶酶在含果肉饮料和/或罐头中的应 用。
[0011] 本发明的第六个目的在于提供上述复合果胶酶用于去除含囊衣植物果实中囊衣 的方法。
[0012] 根据本发明的一个方面，提供了一种尖孢镰刀菌，尖孢镰刀菌为尖镰孢ΒΜ201，尖 孢镰刀菌的拉丁名为Fusarium oxysporum，保藏号为CGMCC No. 9108。
[0013] 根据本发明的另一方面还提供了一种上述菌株的发酵培养方法，培养基：包括 脐橙果渣、柑橘果渣或柚子皮废弃物中任一或任意种的混合物；发酵条件：28?32°C， ρΗ5· O?6. 0,压力为(λ 06MPa?(λ 08MPa，搅拌速度50?70r/分钟，通空气量8L/分钟，发 酵72?120小时产酶量达到峰值。
[0014] 根据本发明的另一方面还提供了一种由上述尖孢镰刀菌菌株产生的复合果胶酶。
[0015] 进一步地，包括聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、纤维素酶或半纤维素酶 中任一或其中任意种的混合物。
[0016] 进一步地，聚半乳糖醛酸酶的平均酶活为10300U/mL以上，果胶裂解酶的平均酶 活为320U/mL以上，果胶酯酶的平均酶活为11400U/mL以上，纤维素酶的平均酶活为5300U/ mL以上，半纤维素酶的平均酶活为198U/mL以上。
[0017] 根据本发明的另一方面还提供了一种含上述尖孢镰刀菌菌株和/或上述复合果 胶酶的果胶分解剂。
[0018] 根据本发明的另一方面还提供了一种含有上述的果胶分解剂的含果肉饮料或食 品罐头。
[0019] 根据本发明的另一方面还提供了一种复合果胶酶的制备方法，包括以下步骤：1) 制备发酵液：发酵培养权利要求1菌株，得到发酵液；2)分离复合果胶酶粗品：将所得发酵 液离心取上清，加硫酸铵至溶液中硫酸铵浓度为75?80g/mL，离心后对沉淀进行半透膜透 析处理取袋内物为复合果胶酶粗品；3)提纯：对复合果胶酶粗品进行干燥浓缩后再过滤除 菌，得到复合果胶酶。
[0020] 进一步地制备发酵液步骤包括活化步骤、种子培养步骤和发酵步骤，活化步骤中 所用活化培养基包括8?10g/L干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意 种的混合物、1. 5 ?2. 0g/L(NH4)2S04、l. 0 ?I. 5g/L Κ2ΗΡ04、0· 5 ?I. Og/L KC1、0. 5 ?0· 8g/ L MgS04、0. 1 ?0· 2g/LFeS04、0. 01 ?0· 02g/L EDTA 铁钠盐、0· 5 ?0· 8g/L 牛胆盐和 I. 5 ? 2%琼脂，活化培养基pH 5. 0?6. 5 ;种子培养步骤中所用种子培养基和液体发酵步骤中所 用发酵培养基包括15g/L?20g/L脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种的 混合物、2g/L ?2. 5g/L(NH4)2S04、0. 6g/L ?lg/L MgS04、lg/L ?2g/L K2HPO4和 lg/L ?2g/L KCl ;发酵培养基和种子培养基灭菌条件为121°C下灭菌30分钟；活化步骤：将菌种接种至 活化培养基上，在28°C?32°C下培养2?3天，将所得孢子配成I. 5 X IO5?2 X 10 6个/mL 的孢子悬浮液；种子培养步骤：将装瓶量3?5%的孢子悬浮液接种至种子培养基在28? 32°C，120?150r/分钟下培养36小时，得到种子菌液；发酵步骤：将装罐量10?15 %的 种子菌液接入发酵培养基中，在28?32°C，pH 5. 0?6. 0,压力0. 06?0. 08MPa，搅拌速度 50?70r/分钟，通空气量8L/分钟的条件下发酵72?120小时，得到发酵液。
[0021] 进一步地，分离复合果胶酶粗品步骤包括以下步骤：1)对发酵液在5000?7000r/ 分钟下离心15?20分钟，取上清进行超滤，取滤液加无水硫酸铵，得到硫酸铵酶液；2)对 硫酸铵酶液在8000?IOOOOr/分钟下离心25?30分钟，取沉淀，用pH 6?6. 5的0. Olmol/ L柠檬酸缓冲液对所得沉淀进行半透膜透析，4°C下处理18?24小时，每隔3?4小时更换 一次柠檬酸缓冲液，取袋内物为复合果胶酶粗品。
[0022] 根据本发明的另一方面还提供了一种将上述复合果胶酶用于去除含囊衣植物果 实中囊衣的方法，包括以下步骤：含囊衣植物果实去皮后得到囊衣果球；将经过保温激活 后的复合果胶酶溶液加入囊衣果球中，得到果球混合物，在40?50°C，pH3. 5?5. 5下恒温 果球混合物得到果球；保温激活为将复合果胶酶溶液置于40?50°C水浴中保温30分钟， 以提尚酶活性。
[0023] 进一步地，植物果实为脐橙和/或柑橘时，按料液体积比为1:3将10?15%的复 合果胶酶溶液加入囊衣果球中，恒温时间为1. 5?2. 5小时；恒温步骤中每隔30分钟对果 球混合物进行搅拌。
[0024] 根据本发明的另一方面还提供了一种按上述方法到的果球，果球表面囊衣覆盖面 积小于果球表面积5%，果球出汁率为57%以上，透光率为36%以上。
[0025] 本发明具有以下有益效果：
[0026] 本发明提供的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)BM201能同时产聚半乳糖醛酸 酶、果胶裂解酶、果胶酯酶、纤维素酶、半纤维素酶等多种果胶酶，形成复合果胶酶。由于所 产复合果胶酶中各种酶的比例协调，相互作用因而将其用于去除植物果实表皮时，能提高 对果实表皮去除率，提高生产效率。该菌株还能用于分解果皮等废渣，减轻环境污染，变废 为宝。
[0027] 本发明提供的方法将该菌株所产复合果胶酶能用于柑橘类果实脱囊衣生产，提供 囊衣去除效率，提高生产效率。
[0028] 本发明提供的复合果胶酶发酵方法以廉价的脐橙、柑橘及柚皮果渣废弃物作为 BM201的碳源和诱导物，采用液态深层发酵方式生产复合果胶酶，工艺简单、稳定、产量高、 成本低。所得复合果胶酶不仅可避免柑橘传统酸碱去囊衣法存在的生产效率低、重金属残 留、产品质量不稳定，还可用于对加工副产物进行资源综合利用，降低生产成本。
[0029] 本发明中所用尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)BM201菌株于2014年4月22 日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称，CGMCC)，保藏单位地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研宄所，邮编100101。保藏编号为CGMCC No. 9108,该菌的分类命名为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)。
[0030] 除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。 下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。




[0031] 构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实 施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0032] 图1从左至右是本发明优选实施例的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)BM201菌 株的在活化培养基上28°C?32°C下培养2?3天的菌落示意图、菌落局部放大示意图和菌 丝形态示意图；
[0033] 图2从左至右是本发明优选实施例的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)BM201菌 株产生的分生孢子、分生孢子梗、孢子囊的形态示意图。


[0034] 以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定 和覆盖的多种不同方式实施。（注意可选和优选混合使用）
[0035] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0036] 本文中涉及到的百分号" ％"，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比， 除另有规定外，是指溶液IOOmL中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时容量 的比例。
[0037] 本发明提供了一种尖孢镰刀菌，该尖孢镰刀菌为保藏证明上的建议分类命名为尖 镰孢，鉴定参据的生物材料样品为BM201。尖孢镰刀菌的拉丁名为Fusarium oxysporum，保 藏号为CGMCC No. 9108(Fusarium oxysporum)BM201，该菌株通过以下手段获得：
[0038] 1、菌株的初筛
[0039] 菌株初筛所用土壤样品采集于邵阳市武闪县级市某处常年种植（种植脐橙时间 大于10年）脐橙的果园。将土壤样品用无菌水进行10倍梯度稀释，取稀释度为1〇_ 3的菌 悬液，接种于筛选培养基上，在30°c下培养3天后，分别测量水解圈、菌落直径的大小，选择 水解圈直径/菌落直径相对较大的菌株进行复筛。
[0040] 其中所用筛选培养基配方为8?10g/L干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃 物中任一或任意种的混合物，1. 5 ?2. 0g/L(NH4)2S04, L 0 ?I. 5g/L Κ2ΗΡ04,0· 5 ?I. Og/L KC1，0. 5 ?0· 8g/LMgS04,0. 1 ?0· 2g/L FeS04,0. 01 ?0· 02g/L EDTA 铁钠盐，0· 5 ?0· 8g/ L牛胆盐，0· 01?0· 02g/L刚果红；I. 5-2%琼脂，ρΗ5· 0?6· 5。
[0041] 2、菌株的复筛
[0042] 将保存的水解圈直径/菌落直径相对较大的菌株接种于种子培养基中，在30°C下 120r/分钟振荡培养2?3天，得到发酵液，分别测定所得发酵液中聚半乳糖醛酸酶、果胶裂 解酶、果胶酯酶、纤维素酶或半纤维素酶中的酶活，对同时产聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶 酶活最高的菌株进行平板划线分离，得到尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)BM201。
[0043] 种子培养基的配方：15g/L?20g/L干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物 中任一或任意种的混合物、2g/L ?2. 5g/L(NH4)2S04、0. 6g/L ?lg/L MgS04、lg/L ?2g/L K2HP04、lg/L ?2g/L KCl0
[0044] 尖抱镜刀菌（Fusarium oxysporum)BM201 的鉴定
[0045] I、菌落形态、菌体及孢子显微镜观察
[0046] 参见图1和图2,在活化培养基上28°C?32°C下培养2?3天后所得菌落形态。 所形成的菌落的菌丝高为3?5mm，菌落中产生大量呈棉絮状的气生菌丝，气生菌丝为白 色，菌丝质密。从培养基顶面俯视观察所得菌丝，菌丝呈浅粉色，营养菌丝呈辐射状。分生 孢子梗单生、细长，所产生的孢子中较小的分生孢子着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端聚成 球团，单胞形成卵形、梨形或肾形。
[0047] 其中活化培养基由干粉状脐橙果渣、柑橘果渣与柚子皮废弃物中任一或任意种 的混合物 8 ?10g/L，（NH4)2S041. 5 ?2. 0g/L，K2HP041. 0 ?I. 5g/L，KC10. 5 ?I. 0g/L， MgS040. 5 ?0· 8g/L，FeS040. 1 ?0· 2g/L，EDTA 铁钠盐 0· 01 ?0· 02g/L，牛胆盐 0· 5 ?0· 8g/ L，琼脂 I. 5 ?2%，ρΗ5· 0 ?6· 5。
[0048] 2、pH 值及 3 % NaCl 耐受性
[0049] 尖抱镜刀菌（Fusarium oxysporum)BM201的生长pH范围为3. 0?8. 5,在含3% NaCl的条件下不能生长。
[0050] 3、18SrDNA 序列分析
[0051] (I)DNA 的提取
[0052] 提取尖抱镜刀菌（Fusarium oxysporum) BM201 的 DNA。
[0053] 提取DNA的方法可以为常规方法，例如离心收集菌丝，液氮研磨充分后，加入 400 μ LDNA提取buffer，充分混匀。65°C水浴，15分钟。加入130 μ L3MKAC，冰浴5分钟。 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1)，充分混勾。4°C下13000rpm离心10分钟。上清转入新的 离心管中，并加入等体积的异丙醇，室温沉淀20分钟，4°C下12000rpm离心15分钟，收集沉 淀，用75%乙醇漂洗3次，晾干后溶于50 μ LddH2O,即得到尖孢镰刀菌BM201的DNA。
[0054] (2) 18SrDNA 序列的 PCR 扩增
[0055] 以提取的尖孢镰刀菌BM201DNA作为模板，用真菌通用引物（f63? GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG ;lr3 ?GGTCCGTGITTCAAGACGG)扩增 BM201 菌株的 18SrDNA 序列。PCR反应体系为50 μ L，体系：基因组DNA2 μ L，上游引物2 μ L，下游引物2 μ L， 10PCRbuffer5 μ L，dNTPl μ L，Taq 酶 0· 5 μ L，ddH2032. 5 μ L。
[0056] PCR反应条件：94°C预变性2分钟；94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸80s，35 个循环；72°C延伸10分钟。PCR反应产物经I %琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA纯化试剂盒 回收目的DNA片段。回收方法及步骤见DNA纯化试剂盒说明书，将回收的ISSrDNA片段送 测序公司测序。
[0057] (3) 18SrDNA 序列分析
[0058] 所得18SrDNA片段通过在美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI)的BLASTS搜索比对获得同源性分析结果列于表1中。
[0059] 表1尖孢镰刀菌BM201的18S rDNA BLASTS搜索比对同源性结果表
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