专利名称：农杆菌介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株遗传转化方法芝麻枯萎病是芝麻主要病害之一，主要分布在我国北部、中部芝麻栽培区，发并普遍且严重。该病由尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株侵染引起，在无寄主的情况下，病原菌厚垣孢子能够在土壤中存活6年以上，单一采用化学防治、物理防治及生物防治等方法不能对该病进行较好地防控，目前人们对尖孢镰刀菌芝麻专化型致病机理认识尚不够深入，研究进展缓慢。在镰刀菌致病性研究方面，有报道利用遗传转化的病原菌成功开展了病原菌致病及侵染机理等相关研究。为获得带有GFP等外源标记基因的尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株， 构建尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株突变体库，目前急需探讨一种能成功获得尖孢镰刀菌芝麻专化型遗传转化的方法，以推动我国芝麻枯萎病害研究进展，为今后的病原菌致病相关基因克隆以及病原菌与芝麻互作研究奠定基础。
本发明目的在于提供一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型病原菌遗传转化的方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株遗传转化方法，包括以下步骤(1)制备尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株分生孢子悬浮液；(2)尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株的T-DNA转化。步骤(1)方法如下挑取少量尖孢镰刀菌菌丝接种于PDA平板上，于M_27°C条件培养5-7d后，加4-6mL无菌水涂布，上面铺两层灭菌擦镜纸，然后将菌液收集到EP管中，用无菌水调节其浓度，制备成孢子悬浮液备用。步骤⑵的转化如下1)从新鲜培养的LB平板上挑选携带有表达载体质粒的农杆菌AGL-I单克隆，接种于5mL LB液体培养基上，200rpmJ8 °C下过夜培养；2)取 200-400 μ L农杆菌AGL-I培养液，加入到5mL诱导液体培养基(IM)中，振荡培养5_6 个小时，使菌液OD6tltl达到0. 5-0. 6 ；3)取上述农杆菌AGL-I菌液100 μ L，与100 μ L IX IO6 个/mL的尖孢镰刀菌分生孢子悬浮液均勻混合，120rpm、22°C振荡培养Mh，然后将上述菌液均勻涂布于IM平板上的硝酸纤维素膜表面，22°C共培养两天；4)两天后，用无菌剪刀把硝酸纤维素膜剪成宽0. 8cm的小条，放于筛选培养基上在^TC的温度下培养至转化子产生；5)用无菌牙签挑取单个转化子接种到PDA平板上，26°C培养再次筛选鉴定，保存得到的转化子，用于阳性检测。1)中的液体培养基组成为50 μ g · ml/1抗生素和50 μ g · mL—1利福平。2)中的诱导液体培养基组成为50 μ g · mL—1抗生素和75 μ mol · Γ1乙酰丁香酮。所述的抗生素为卡那霉素。3)中所述的平板中含 75 μ mol · Γ1 乙酰丁香酮(AS，acetosyringone)。4)中的筛选培养基组成为PDA+100l·! g · mL—1抗生素+400 μ g · mL—1头孢氨苄 +eOygiL—1 链霉素。5)中的PDA平板上涂有100 μ g · mL—1抗生素。所述的抗生素优选为潮霉素。本发明的方法以尖孢镰刀菌芝麻专化型病菌为转化体，利用农杆菌介导的方法， 结合适宜的遗传转化受体系统，将外源T-DNA序列转入到尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株基因组中，首次获得了尖孢镰刀菌芝麻专化型转基因菌株。该方法重复性好，转化效率高，可用于今后的尖孢镰刀菌芝麻专化型突变体库构建；获得的菌株含有双标记基因，可用于芝麻枯萎病害机理分析，是芝麻枯萎病菌致病及芝麻抗病研究中的一个重要创新。该方法利用农杆菌介导途径，结合适宜的转化步骤和筛选方法，成功将外源基因序列高效转入尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株，方法简单可行，重复性好，转化效率高。本发明确定了尖孢镰刀菌芝麻专化型遗传转化的高效方法，也为今后探明芝麻枯萎病病菌致病机理及芝麻抗病机理， 以及有效防控芝麻枯萎病奠定了基础。图1是铺有硝酸纤维素薄膜的诱导液体培养基IM平板；图2是将硝酸纤维素薄膜剪成条状转移到选择性培养基上；图3是尖孢镰刀菌芝麻专化型转化子在抗性培养基上的初次筛选结果；图4是尖孢镰刀菌芝麻专化型不同转化子的二次筛选结果；图5是尖孢镰刀菌芝麻专化型不同转化子的PCR检测结果(1 :MakerDL200 ；2，3， 6,7,10,11 :6个阳性转化菌株的GFP基因PCR结果；4，5，8，9，12，13 :6个阳性转化菌株的潮霉素基因PCR结果；14 :1个阴性转化菌株的GFP基因PCR结果；15 :1个阴性转化菌株的潮霉素基因PCR结果)；图6是尖孢镰刀菌芝麻专化型阳性转化子的荧光检测结果。
3)取上述农杆菌 AGL-I (pCAMBIA1304)菌液 100 μ L，与 100 μ L 1 X IO6 个 /mL 的尖孢镰刀菌分生孢子悬浮液均勻混合，120rpm、22°C振荡培养Mh，然后将上述菌液均勻涂布于IM平板上的硝酸纤维素膜表面(如图1)，22°C共培养两天。该平板中含 δμπιο ·!/1 乙酉先丁香酮(AS, acetosyringone)；
4)两天后，用无菌剪刀把硝酸纤维素膜剪成宽0. 8cm的小条，放于筛选培养基上 (PDA+100 μ g · mL-1 潮霉素 +400 μ g · mL"1 头孢氨苄 +60 μ g · LmL"1 链霉素)(如图 2)，26°C 培养至转化子产生(如图3)；
5)用无菌牙签挑取单个转化子接种到含有100 μ g · mL—1潮霉素的PDA平板上， 26°C培养再次筛选鉴定(如图4)，保存得到的转化子，用于阳性检测。
(3)转化子DNA提取与鉴定
1)钢珠石英砂振荡破壁SDS法提取DNA 取0. 5mg菌丝放入2mL离心管中，加入两个钢珠、少量石英砂及ImL SDS提取液，振荡6min ；4°C条件下，12000rpm离心IOmin ；取上清并加入等体积的氯仿/异戊醇04 1)混合液，翻转混勻，室温静置5分钟，12000rpm离心IOmin ；取上清，加0. 6倍体积预冷异丙醇，室温静置lOmin，IOOOOrpm离心IOmin ；弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀两次，IOOOrpm离心5min，弃上清液，通风干燥20min ；加500 μ LTE 缓冲液溶解30min，加等体积的氯仿/异戊醇04 1)，混勻，室温静置5min，12000rpm离心IOmin ；取上清，加0. 6体积预冷的异丙醇后翻转30次，室温静置lOmin，IOOOOrpm离心 IOmin0弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，两次，IOOOOrpm离心5min。通风干燥沉淀20min ；加 100 μ L TE缓冲液溶解，即为转化子DNA溶液，-20°C保存。
2) PCR扩增检测
为确定所获得的抗性尖孢镰刀菌株是否为阳性转化子，含有T-DNA插入片段，首先采用PCR扩增方法进行分子鉴定。根据T-DNA序列中的潮霉素抗性基因Hph以及绿色荧光蛋白基因GFP设计引物用于扩增，引物序列分别为
Hph-F5，-GCCGTGGTTGGCTTGTATG-3，
Hph-R5，-TCTGCGGGCGATTTGTGT-3，；扩增长度为 229bp ；
GFP-F5’ -TGGCCAACACTTGTCACTAC-3 ’
GFP-R 5，-AGGACCATGTGGTCTCTCTT-3，；扩增长度为 491bp ；
常规PCR反应加入适量菌的DNA作为PCR模板，然后按表1依次加入PCR反应试剂，置于PCR仪中进行反应。反应条件为95°C预变性3min，94 V变性30s、55°C退火30s、 72°C复性lmin (30个循环)，72°C延伸6min，14°C保温^nin。根据Tm值对退火温度加以调整。扩增后样品用琼脂糖凝胶电泳检验(如图5)。
表IPCR 反应体系(10 μ L)
Table2 reaction system used in PCR(IOyL)


本发明涉及一种农杆菌介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株遗传转化方法，包括以下步骤(1)制备尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株分生孢子悬浮液；(2)尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株的T-DNA转化。本发明的方法以尖孢镰刀菌芝麻专化型病菌为转化体，利用农杆菌介导的方法，结合适宜的遗传转化受体系统，将外源T-DNA序列转入到尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株基因组中，首次获得了尖孢镰刀菌芝麻专化型转基因菌株。该方法重复性好，转化效率高，用于今后的尖孢镰刀菌芝麻专化型突变体库构建；获得的菌株含有双标记基因，可用于芝麻枯萎病害机理分析，是芝麻枯萎病菌致病及芝麻抗病研究中的一个重要创新。