专利名称：一种玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法玉米苗期根腐病是ー种分布广、危害严重、病原菌种类繁多和防治较困难的世界性病害。该病是由多种病原菌复合侵染引起，主要危害玉米的根及茎基部，引起根系及茎基部受害部位变褐坏死，影响作物对水分和养分的吸收，地上部叶片边缘出现黄褐色云纹状斑。 玉米苗期根腐病的症状表现为在玉米3-6叶期，地上部生长受到抑制，株型矮小，下部叶片从叶缘开始出现黄化症状，进而叶片或整株变黄，或出现褐色斑；胚根和须根上有褐色病斑，或腐烂，或缢縮。轻者可逐渐恢复，但是生长趋势明显减弱，影响产量，重者死亡，造成缺苗断垄。国外报道引起玉米根腐病的病原菌有禾生腐霉菌、禾谷镰刀菌、蠕孢菌、串珠镰刀菌、尖抱镰刀菌、立枯丝核菌等，主要病原菌为腐霉菌和镰刀菌。国内报道的病原菌有 串珠镰刀菌、串珠镰刀菌胶孢变种、禾谷镰刀菌、蠕孢菌、腐霉菌、丝核菌等。吉林省的优势种为镰刀菌占66-80%，丝核菌占5%-10% ；浙江省串珠镰刀菌占49%-79. 7%，腐霉菌的分离频率也较高；河北省以镰刀菌为主，立枯丝核菌为辅。总的看来，玉米根腐病的主要病原菌为串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌，不同地区病原菌组成因生态环境的不同而略有差异。玉米苗期根腐病的初侵染源为种子和土壌中的病原菌，在适宜的条件下侵入植株地下部，引起发病。传统的防治方法主要是化学药剂拌种。但该防治方法存在较多缺点一是化学药剂只能杀死种子及周围的病原菌，而对稍远ー些的病原菌却无能为力，而且在杀死病原菌的同吋，也将有益微生物无选择地杀死；ニ是药剂防治，药量大，毒性大，污染重， 长期使用会导致病原菌产生抗药性，使化学药剂失去了原有的防治作用。木霉菌作为ー种生防菌，可以防治很多经济作物的主要病害，对发生在根部和叶部病害都有很好的防治效果，近年来对储藏期病害也有研究。木霉菌对ー些土传植物病原菌的防治具有很好的效果，这些病原菌包括丝核菌属(胁办^如/？む)、小核菌属腫)、镰刀菌属(R/sarium)、腐霉属(Pythium)、疫霉属 iPhytophthora)等，并且木霉菌的不同种、同种不同菌株甚至同一菌株的不同后代个体都存在着拮抗性的差异及拮抗对象种类上的差別。作为普遍存在并具有丰富资源的拮抗微生物，在土传病害的生物防治中具有重要的地位。木霉菌的作用机制几乎包括了所有可能机制，并因此而受到广泛的关注，也是其用途广泛、效果突出的重要原因。据报道，木霉菌至少有如下几种作用机制竞争作用、抗生作用、溶菌作用、寄生作用、诱导抗性、协同拮抗作用。自从1932年Wfeindling发现木霉菌对植物病原真菌有拮抗作用，70多年来国外专家、学者对木霉菌生物药剂的开发做了许多尝试和深入的研究。美国的Top shield(哈茨木霉T2》、以色列的Trichodex (哈茨木霉T39)、新西兰的木霉制剂Trichodry和 Trichoflow、俄罗斯Kolombet博士研制的木霉制剂(Mycol)、韩国Chung教授研究开发的木霉制剂YC458、西班牙Monte教授采用哈茨木霉和绿色木霉混合开发的生防制剂TUSAL，这些制剂在植物病害防治中都取得很好的防治效果和明显的增产作用。近年来，国内的科研人员也把生物防治的注意力转移到拮抗木霉菌上来，并使其逐步在田间得到应用。丁万隆等用木霉制剂防治西洋参立枯病，李良做了哈茨木霉T. harzianum防治茉莉白絹病,邪云章等用绿色木霉T. vi ride防治人参根腐病都取得了一定的效果。但现有的木霉菌在防治玉米苗期根腐病方面防病效果不佳，保苗率较低，应用效果不理想。
本发明是通过如下技术方案实现的一种玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法，其特征在于包括如下步骤(1)土样采集选取玉米种植田块，每个地块5点取样，每取样点沿玉米根围从不同位置取样3次，取土深度0-20cm，同一田块5点取样后将其混合均匀装入无菌塑料袋；(2)土壤溶液的制备将采集到的土样敲碎、风干后过筛，取充分混匀的土样IOg于容量瓶中，加无菌水定容至IOOmL,振动30min,取IOmL 土壤悬浮液加入90mL无菌水中，依次稀释至10 —6倍,充分摇匀后用于分离；(3)木霉菌的分离纯化将稀释后的土壤悬浮液在振荡器上振荡10-20S，吸取ImL土壤悬浮液至LB琼脂平板中央，用涂布棒涂匀，并做好浓度标记，涂好的LB琼脂平板静置5min，使土壤悬浮液渗透进LB 琼脂平板中，将涂好的LB琼脂平板倒置于28°C恒温箱中培养，每浓度重复3次，待LB琼脂平板上长出菌落后，挑取菌落边缘幼嫩菌丝到PDA平板上反复纯化，从形成的单个分散的菌落上移植菌丝体于PDA斜面上冷冻保存；(4)木霉菌的筛选将分离的木霉菌株用PDA培养基复筛后即得。PDA培养基复筛属于现有技术，不再详述。本发明玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法的有益效果是方法简便易操作， 成本较低；筛选出的木霉菌制备得到木霉菌剂贮存期长，能有效贮存I年以上，防病效果佳，出苗率提高约45%，存活率比对照高50%，保苗效果好，感病指数降低60%，对人畜和生态环境无害，无残留，不产生抗药性，原料来源广，生产成本低于化学农药多菌灵等，还可以变废为宝，具有很好的经济效益和社会效益。
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
附图I为不同载体对木霉菌产孢量的影响图。

(A)玉米苗期根腐病病原菌的分离鉴定(I )方法①病原菌分离玉米苗期根腐病病原菌分离将玉米苗根部用清水冲洗干净，剪取根部病健交界处组织0. 5cm左右，用常规方法进行组织表面消毒后，分別放置在PDA和CMA培养基上，观で培养。5天后对分离物进行初歩鉴定。如果是镰孢菌iFusarium 577/7.)则转到F8液体培养基上，待其产生大型分生孢子后，挑取单孢进ー步纯化，供菌种鉴定及测试用。PDA培养基马铃薯去皮200g，切碎加水IOOOmL,煮沸20min，纱布过滤，滤液补足至IOOOmL,加葡萄糖20g，琼脂15g，加热至熔化；
CMA培养基取60g玉米粒放入水中煮lh，过滤，取液体加入20g琼脂，20g葡萄糖，加水至IOOOmL, pH=7. 0，分装，灭菌；
F8 液体培养基KH2PO4 2g ；KNO3 2g ；KCl Ig ；MgSO4 Ig ；FeSO4, FeCl3、MnSO4, ZnSO4 各 0. 0002g ；Sug Ig ；水 IOOOmL ；pH=5. 0，分装，灭菌。②病原菌鉴定
将分离物依据魏景超(真菌鉴定手册》和Maleolme. shurtleff.的《eompendium of corn disease)) (1980)所描述的无性器官形态特征及培养形状鉴定。(II)结果与分析
玉米苗期根腐病病原菌种类
从玉米苗期根腐病病株分离得到的病原菌有串珠镰孢菌、禾谷镰孢菌、尖抱镰孢菌、腐霉菌、立枯丝核菌等，其中串珠镰孢菌的分离频率最高，分别为43. 66% ；禾谷镰孢菌的分离频率为13. 57% ；其它病原菌的分离频率均在5%以下(表1)。结果说明，引起玉米苗期根腐病的主要病原菌为串珠镰孢菌和禾谷镰孢菌。表1玉米苗期根腐病病原菌分离频率


本发明涉及生物领域，特别公开了一种玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法。该玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法，其特征在于包括如下步骤(1)土样采集；(2)土壤溶液的制备；(3)木霉菌的分离纯化；(4)木霉菌的筛选。本发明玉米苗期根腐病生防木霉菌的筛选方法的有益效果是方法简便易操作，成本较低；筛选出的木霉菌制备得到木霉菌剂贮存期长，能有效贮存1年以上，防病效果佳，出苗率提高约45%，存活率比对照高50%，保苗效果好，感病指数降低60%，对人畜和生态环境无害，无残留，不产生抗药性，原料来源广，生产成本低于化学农药多菌灵等，还可以变废为宝，具有很好的经济效益和社会效益。