专利名称：一种黑曲霉原生质体融合选育高产内切型菊粉酶菌株及其制备方法低聚果糖是一种良好的双歧因子和水溶性膳食纤维，可做为功能性食品或者饲料的原料或添加剂。低聚果糖具有抗肿瘤、刺激双歧杆菌生长、防治便秘、抑制肠内腐败物质形成、提高机体免疫力、改善脂质代谢、降低胆固醇等作用，同时可作为膳食纤维用于防治糖尿病和减肥，也可用来改善肠胃功能，降低血脂和预防高胆固醇病等。因此，具有重要的健康、药用开发价值。传统工业化大规模生产低聚果糖是由蔗糖经果糖基转移酶合成，反应的副产物葡萄糖是酶的抑制剂，反应进行不彻底，混合物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖占总量< 55%-60%(干基)，且工艺复杂、生产成本高。目前，如何提高内切型菊粉酶的酶活，是这个新工艺能否用于工业化生产的关键。据文献报道，现在利用细胞诱变和工艺条件的优化来提高微生物生产内切型菊粉酶酶活的较多，但未有利用原生质体融合技术进行菌株酶活的报道。
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种黑曲霉原生质体融合选育高产内切型菊粉酶菌株及其制备方法。它以二种黑曲霉为菌种，经含有菊糖的培养基活化、牛蒡汁液体摇瓶培养后，利用纤维素酶和蜗牛酶水解黑曲霉菌丝细胞的细胞壁，在恒温下振荡，制备原生质体；经原生质体融合后，内切型菊粉酶的酶活比二个出发菌株分别提高了 33. 41%和47. 44%。原生质体融合后再生，经过传代后，内切型菊粉酶的酶活与再生菌株相比偏差较小，遗传性状稳定。该菌株可用于工业化生产内切型菊粉酶。原生质体融合的意义在于打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。可与其他育种方法相结合，如把常规诱变和原生质体诱变所获得的优良性状，组合到一个单株中，经过原生质体的融合和再生选育出酶活最高的菌株。本发明是以如下技术方案实现的一种黑曲霉原生质体融合选育高产内切型菊粉酶菌株，其特征是它以二种黑曲霉为菌种，经含菊糖初筛培养基活化、诱导培养基诱导培养、牛蒡汁液体培养基摇瓶培养后，利用复合酶液水解黑曲霉菌丝体，制备原生质体；将二种原生质体溶液各取lml，加入30%聚乙二醇6000 2ml和0. 01mol/L氯化钙lml，使二种原生质体进行融合，再将原生质体混合液加入到再生培养基中，经再生培养、摇瓶液体深层发酵获得内切型菊粉酶发酵液，过滤取上清液，用3，5- 二硝基水杨酸比色定糖法测定内切型菊粉酶的酶活。所述的一种黑曲霉原生质体融合选育高产内切型菊粉酶菌株，其特征是所述复合酶液为蜗牛酶和纤维素酶。一种制备权利要求1所述的黑曲霉原生质体融合选育高产内切型菊粉酶菌株的方法，其特征是按如下步骤进行(1)二个菌种分别接种于含菊糖的初筛培养基上活化1-2次，诱导培养基诱导培养1 次，取菌块接种于牛蒡汁液体培养基中，28-30°C进行摇瓶培养4-5天；(2)二个菌种分别取一瓶液体培养的菌丝，过滤，收集菌丝球，用无菌水冲洗2-3次，在无菌滤纸上吸干水分，称湿重；(3)各取Ig菌丝体，放入到装有20ml、1%酶解液1:20的IOOml锥形瓶中，在^-32 水浴、lOOr/min振荡器中震荡2_4h，用冰浴终止酶解，经双层无菌镜头纸过滤，用高渗缓冲溶液溶液洗涤沉淀3次，在沉淀中加入200ml高渗缓冲溶液，此为原生质体溶液；(4)将两种原生质体溶液各Iml+ 30%聚乙二醇6000 2ml + 0. Olmol/L氯化钙lml， 30°C静置15—20min，2000r/min离心lOmin，用无菌镜头纸过滤，用高渗缓冲溶液洗涤2_3 次，用高渗缓冲溶液悬浮沉淀20ml，吸0. Iml分别涂布于5个再生培养基中，30 培养2_3 天；(5)选择20株透明圈大的菌株，每个菌株移入2个初筛培养基培养，待菌丝体生长出来后每个菌株挖取1 cm 2置于发酵培养基中进行发酵培养，培养4天，发酵液过滤取上清液， 测定内切型菊粉酶的酶活。本发明的优点是采用该技术所获得的黑曲霉菌株通过深层发酵后在培养液中生产内切型菊粉酶，经提取、分离后可水解菊糖生产低聚果糖，广泛应用于食品工业，该方法具有较高的可重复性。

将二个黑曲霉出发菌株在30 下保温培养活化7天，取活化菌块于250ml摇瓶中，28°C 摇床培养5天。过滤，收集菌丝球，用无菌水冲洗；各取Ig菌丝体，放入到装有20ml、l%酶解液(1:20)的100ml锥形瓶中，在32 下振荡酶解池，用冰浴终止酶解，经双层无菌镜头纸过滤，用高渗缓冲溶液溶液洗涤沉淀3次，在沉淀中加入高渗缓冲溶液，此为原生质体溶液。将两种原生质体溶液各Iml再加入聚乙二醇6000和CaCl2溶液，2000r/min离心 lOmin，用无菌镜头纸过滤，用高渗缓冲溶液悬浮沉淀20ml，吸0. Iml分别涂布于再生培养基中，30 培养2天。选择透明圈大的菌株，转入初筛培养基培养，待菌丝体生长出来后，菌株挖取1 cm2菌块转入摇床培养4天，发酵液过滤取上清液，测定内切型菊粉酶的酶活，多数再生菌株的内切型菊粉酶的酶活比二个出发菌株提高30%和42%以上。实施例2、
将在^tlC下保温培养活化的二个黑曲霉出发菌株，取活化菌块于250ml摇瓶中，30 摇床培养4天。过滤，收集菌丝球，用无菌水冲洗；各取Ig菌丝体，放入到装有20ml、1%酶解液(1:20)的100ml锥形瓶中，在30 下振荡酶解池，用冰浴终止酶解，经双层无菌镜头纸过滤，用高渗缓冲溶液溶液洗涤沉淀3次，在沉淀中加入高渗缓冲溶液，制备出原生质体溶液。将两种原生质体溶液各Iml再加入聚乙二醇6000和氯化钙溶液，2000r/min离心lOmin，用无菌镜头纸过滤，用高渗缓冲溶液悬浮沉淀20ml，吸0. Iml分别涂布于再生培养基中，28°C培养4天。选择透明圈大的菌株，转入初筛培养基培养，待菌丝体生长出来后，菌株挖取1 cm2菌块转入摇床培养4天，发酵液过滤取上清液，测定内切型菊粉酶的酶活，多数再生菌株的内切型菊粉酶的酶活比二个出发菌株提高3 和40%以上。
实施例3、
将在^tlC下保温培养活化的二个黑曲霉出发菌株，取活化菌块于250ml摇瓶中，^tlC摇床培养4天。过滤，收集菌丝球，用无菌水冲洗；各取Ig菌丝体，放入到装有20ml、1%酶解液(1 20)的IOOml锥形瓶中，在^tlC下振荡酶解4h，用冰浴终止酶解，经双层无菌镜头纸过滤，用高渗缓冲溶液洗涤沉淀3次，在沉淀中加入高渗缓冲溶液，制备出原生质体溶液。将两种原生质体溶液各Iml再加入聚乙二醇6000和氯化钙溶液，2000r/min离心lOmin，用无菌镜头纸过滤，用高渗缓冲溶液溶液悬浮沉淀20ml，吸0. Iml分别涂布于再生培养基中， ^tlC培养3天。选择透明圈大的菌株，转入初筛培养基培养，待菌丝体生长出来后，菌株挖取1 cm 2菌块转入摇床培养4天，发酵液过滤取上清液，测定内切型菊粉酶的酶活，多数再生菌株的内切型菊粉酶的酶活比二个出发菌株提高30%和43%以上。再生菌株用石蜡油斜面保存。


本发明涉及一种内切型菊粉酶菌株，具体是涉及一种黑曲霉原生质体融合选育高产内切型菊粉酶菌株及其制备方法，属遗传技术领域。该制备方法以二种黑曲霉为菌种，经含有菊糖的培养基活化、牛蒡汁液体摇瓶培养后，利用纤维素酶和蜗牛酶水解黑曲霉菌丝细胞的细胞壁，在恒温下振荡，制备原生质体；经原生质体融合后，内切型菊粉酶的酶活比二个出发菌株分别提高了33.41%和47.44%。原生质体融合后再生，经过传代后，内切型菊粉酶的酶活与再生菌株相比偏差较小，遗传性状稳定。该菌株可用于工业化生产内切型菊粉酶。