一种高产蛋白酶k的黑曲霉菌株及其应用的制作方法 【技术领域】，具体涉及一种高产蛋白 酶K的黑曲霉菌株及其应用。 [0002] 蛋白酶K(E.C. 3.4. 21.64)是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，是由真菌林伯 氏白色念球菌（Tritirachium album Limber)合成的胞外内肽酶，它是具有典型催化三元 组Asp39-His69-Ser 224的丝氨酸蛋白酶类中的一员。蛋白酶K具有高于30U/mg的特异活性， 是已知的内肽酶中最有活性的之一，并且非特异性水解天然的和变性的蛋白质。 [0003] 蛋白酶K具有非常重要的生物学意义，具有极高的酶活性和广泛的底物特异性， 能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键，常被用 于降解蛋白生产短肽。成熟蛋白酶K由279个氨基酸组成，两个二硫桥和两个键合的钙离子 使得紧密结构稳定。所以，与其他枯草杆菌蛋白酶相比，蛋白酶K对极端pH值、高温、离液 剂和去污剂具有高得多的稳定性，蛋白酶K在高温（达65°C )和宽pH范围（ρΗ7· 5 -12. 0) 具有高稳定性。在变性剂例如脲或SDS存在下其活性得以提高。上述性质使得蛋白酶K在 要求非特异性蛋白质降解的生物【技术领域】中具有很好的应用，特别是从粗提取液中分离核 酸（DNA或RNA)以及在DNA分析中预制备样品，另外蛋白酶K也可应用于蛋白质分析领域， 例如结构释析。 [0004] 但因为林伯氏白色念球菌生长缓慢，不适合大规模发酵，而且菌体在产生蛋白酶K 的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母 菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来 困难。因此利用基因工程技术实现蛋白酶K的异源重组表达是目前研宄的重点和发展趋 势。很多科研学者对改变蛋白酶K宿主菌做了多次尝试。Gunkel F.A.等将蛋白酶K转入 大肠杆菌体内，实现了蛋白酶K的胞内表达，然而表达量极低，Muelle R.等构建了蛋白酶 K的表达载体并将其转入毕赤酵母体内，证明了蛋白酶K可以在酵母体内表达；但还存在着 表达量难以满足生产要求的问题。


[0005] 本发明的目的是提供一种高产蛋白酶K的黑曲霉菌株及其应用，从而弥补现有技 术的不足。
[0006] 本发明一方面提供了一种黑曲霉mk37 (Aspergillus niger mk37)，已于2014年 12月30日被保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M2014677〇
[0007] 上述的黑曲霉mk37用于代谢合成蛋白酶K ;
[0008] 所述蛋白酶K的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。
[0009] 编码上述蛋白酶K的基因，其一种编码核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
[0010] 本发明通过紫外诱变方法获得的黑曲霉突变菌mk37能够高效表达来源于林伯氏 白色念球菌的蛋白酶K，其发酵酶活高达7772. 9U/mL，比出发菌株提高了 42%。与出发菌 株相比，突变菌株mk37的菌落较小、较密实，产孢子数量多，且菌丝分支多、短，菌丝生长更 密集，更适合高密度发酵，能有效降低蛋白酶K的生产成本。此外，本发明所述黑曲霉突变 菌mk37重组表达的蛋白酶K可广泛应用于食品加工领域，经蛋白酶K嫩化后的牦牛肉在色 泽、口感方面表现均优于对照组，且肉的平均剪切力、失水率、肌纤维直径，分别比对照组低 49. 12N/cm2、6. 21%、8. 56ym，从而说明本发明所述蛋白酶K对冷却牦牛肉的嫩化效果显 著。除了食品加工领域外，本发明所述蛋白酶K还可广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、酿 造等领域，均具有很好的效果。




[0011] 图1为突变株黑曲霉mk37与出发菌株菌落形态对比图；
[0012] 图2为突变株黑曲霉mk37与出发菌株菌丝形态对比图；
[0013] 图3为突变株黑曲霉mk37发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，箭头所指处即为重 组表达的蛋白酶K。


[0014] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下 列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook) 等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0015] 实施例1、蛋白酶K基因的合成
[0016] 来源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶K的氨基酸序列为SEQ ID NO :1，将此序列按 照黑曲霉的密码子偏爱性翻译成相应的核酸序列，使其不被Xho I和Xba I两个酶切位 点切断，得到的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。在蛋白酶K的核苷酸序列两端加 Xho I和Xba I酶切位点，交由上海生工生物工程有限公司进行合成，合成的蛋白酶K核苷酸序列被连 接在载体PSG-TS上，插入位点为t-a克隆，受体菌为大肠杆菌DH5a菌株。
[0017] 实施例2、蛋白酶K基因重组载体的构建
[0018] 将连在PSG-TS载体上的蛋白酶K基因用Xho I和Xba I双酶切，经琼脂糖凝胶 电泳，切胶回收酶切产物片段，与同样用Xho I和Xba I双酶切并切胶回收的质粒pGm连 接，转化感受态大肠杆菌（E. coli)DH5a后，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干 克隆进行测序（Invitrogen)。
[0019] 使用质粒小量制备试剂盒（Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质 粒。获得1个重组质粒，测序结果显示获得的DNA序列为SEQ ID NO: 2,其编码的蛋白序列 为SEQ ID N0:1。从而说明重组质粒构建成功，命名为pGm-ProK。
[0020] 其中的酶切及连接反应均参照表1。
[0021] 表1酶切体系及连接体系
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