专利名称：一种黑曲霉菌株及其应用的制作方法阿魏酸酯酶，包括肉桂酸酯酶和肉桂酸水解酶，是羧酸酯酶的一个亚类，指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来的酶，有利于植物细胞壁的降解和多糖的释放。MackenzieC R等于1987年在培养橄榄色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)时第一次观测到阿魏酸酯酶可以使麦麸释放阿魏酸。从那以后，人们认识到阿魏酸酯酶是半纤维素水解酶。研究表明真菌和细菌都能分泌阿魏酸酯酶，但到现在为止，大多数的阿魏酸酯酶都是从真菌而不是细菌中分离的。包含大量酯化阿魏酸的复合碳源如去淀粉麦麸、玉米皮、啤酒糟和甜菜渣等最适合用来产生阿魏酸酯 酶。在哺乳类动物的细胞中也检测到阿魏酸酯酶的活性，但这些酶还没有被分离纯化，蛋白序列需要与微生物酶进一步的比较。用阿魏酸酯酶处理植物性原料在食品、饲料和造纸等工业中有着光明的前景。植物细胞壁是一个由多糖网络组成的三维结构图，这些多糖包括纤维素，半纤维素，木质素等，它们之间通过羟基肉桂酸类酯键相连，所以在植物细胞壁中存在大量的酚酸化合物。在食品工业通过阿魏酸酯酶降解植物细胞壁，可以得到大量酚酸化合物。酚酸化合物由于具有强大的抗氧化功能，已愈发的受到人们的关注，尤其是阿魏酸，它不仅可以作为抗氧化剂，还具有一些生理作用，如抗血栓，抗癌等，同时它还可以作为合成香兰素的前体。在饲料工业中阿魏酸酯酶可以打破半纤维素和木质素之间相互的交联，从而使细胞壁的机构变得疏松，可以作为添加剂加快动物对食物的降解速度，同时还能加深动物对饲料的利用程度，减少营养物质的流失。在造纸工业可以部分地去除木质素，减少化学漂白齐U的使用量，增加了纸浆的白度，使纸的质量进一步提高。目前国内也有利用微生物发酵产阿魏酸酯酶的报道，CN102286442A公开了利用烟曲霉发酵生产阿魏酸酯酶，并取得了一定效果，但总体来说现有工艺产酶水平较低，发酵原料需要经过特殊的前处理，对产酶微生物的发酵特性、营养特性和发酵技术并未进行系统的研究，这也就限制了阿魏酸酯酶在实际工业中的应用。因此探索酶活高、安全的阿魏酸酯酶产生菌显得很有必要，具有极大的研究和开发价值。
本发明提供了一种黑曲霉菌株，解决现有工艺产酶水平低，发酵原料需经特殊前处理的问题。一种黑曲霉菌株，命名为黑曲霉(Aspergillus niger) ZJUQH2012147，该菌株已于2012年05月23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 6152。该菌株属半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，曲霉属，在麦芽汁琼脂培养基(MEA)上生长较快，25 °C黑暗条件下培养7天，菌落直径58-61mm，质地绒状；分生孢子头黑褐色，初期球形，后期开裂，菌落背面无任何色素；菌株具有足细胞，分生孢子梗高大，宽7. 5-12. 8 u m，壁光滑，顶囊球形，大部分表面可育，产孢结构双层，分生孢子近球形，浅到褐色，具小刺，3. 0-5. 5 iim。未见有性孢子。本发明还提供了所述黑曲霉ZJUQH2012147在生产阿魏酸酯酶中的应用。具体可以包括以下步骤 (I)将黑曲霉ZJUQH2012147接入种子培养基进行增殖培养，获得种子液；(2)将种子液接入发酵培养基进行发酵培养。培养条件影响菌株的繁殖能力以及产酶能力，所述增殖培养条件选择为温度25 30°C，时间100 200小时；更优选为，温度28°C，时间144小时。所述发酵培养条件可以为温度25 30°C，时间100 200小时；更优选为，温度28。。，时间120小时。发酵完成后，阿魏酸酯酶存在发酵液中，通过常规酶分离方法即可实现分离纯化。所述发酵培养可以是摇床培养，也可以是利用发酵罐工业化大规模培养，当采用摇床培养时，摇床转速优选为100 200r/min。以IL体积计,所述发酵培养基包括碳源20 40g,无机盐5 IOg,氮源5 20g,所述碳源为豆柏、麦麸、玉米棒和玉米杆中的至少一种，优选为豆柏、麦麸或它们的混合物。该些复合碳源含有大量酯化阿魏酸，适于生产阿魏酸酯酶。所述的氮源可以是有机氮源、无机氮源或它们的混合物，有机氮源可以选择蛋白胨、酵母粉或它们的混合物，无机氮源可以选用铵盐，如硫酸铵、氯化铵、硝酸钠等。无机盐主要包括细菌细胞生长所需的各种元素，如P、Na、K、Mg、Ca等，其用量可参考常规细菌培养基的配方。最优选的，所述发酵培养基选用如下任一培养基培养基I :豆柏 35. 0g, Na2HPO4 7H20 4g，NaCl 0. 2g，蛋白胨 15g，MgSO4 7H200. 3g, CaCl2O. 05g,蒸懼水 1000ml, pH 自然;培养基2 :豆柏 20. Og, KH2PO4 3g, Na2HPO4 7H20 6g, NaCl 0. lg, (NH4)2SO4 8g,MgSO4 7H20 0. 2g, CaCl2 0. 05g，蒸馏水 1000ml, pH 自然;培养基3 :豆柏 20. Og,麦麸 20. 0g, KH2PO4 3g，Na2HPO4 7H20 6g，NaCl 0. lg,酵母粉 8g，MgSO4 7H20 0. 2g，CaCl2 0. 05g，蒸馏水 1000ml, pH 自然。与现有技术相比较，本发明有益效果为(I)本发明黑曲霉菌株产阿魏酸酯酶活性高，易于实现阿魏酸酯酶的工业化生产。(2)本发明生产阿魏酸酯酶的工艺采用豆柏、麦麸等粗原料作为发酵原料，该粗原料无需进行前处理，生产成本低。(3)本发明对发酵工艺进行了系统优化，取得了较理想的产酶效果。初筛培养基KH2PO43g，Na2HPO4 7H20 6g，NaCl 0. lg，蛋白胨 8g，MgSO4 7H200. 2g, CaCl2 0.05g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，无菌的含阿魏酸甲酯的二甲基甲酰胺溶液(质量体积比为10% )0.3ml，pH自然。复筛培养基豆柏20g, KH2PO4 3g，Na2HPO4 7H20 6g，NaCl 0. lg,蛋白胨 8g，MgSO4 7H20 0. 2g, CaCl2 0. 05g，蒸馏水 1000ml, pH 自然。种子培养基马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，蒸馏水1000ml，pH自然。发酵培养基培养基I :豆柏 35. 0g, Na2HPO4 7H20 4g，NaCl 0. 2g，蛋白胨 15g，MgSO4 7H200. 3g, CaCl2 0. 05g,蒸懼水 1000ml, pH 自然;培养基2 :豆柏 20. Og, KH2PO4 3g, Na2HPO4 7H20 6g, NaCl 0. lg, (NH4)2S048g, MgSO4 7H20 0. 2g, CaCl2 0. 05g，蒸馏水 1000ml, pH 自然;培养基3 :豆柏 20. Og,麦麸 20. 0g, KH2PO4 3g，Na2HPO4 7H20 6g，NaCl 0. lg,酵母粉 8g，MgSO4 7H20 0. 2g，CaCl2 0. 05g，蒸馏水 1000ml, pH 自然。二、菌株的分离纯化从造纸厂、豆柏加工厂、小麦地和酒厂的土壤样品中采集到50份样品先经增殖培养基培养120h,稀释涂布于察氏培养基平板形成单菌落,再挑选50个菌落点种于初筛培养基上，选择显示白色透明圈的菌落进行摇瓶复筛，得到一株产酶活最高的菌株为W1，测定发酵液阿魏酸酯酶活力(此菌种28°C培养120小时酶活达到162. 84U/L)。经Y _射线诱变(剂量700Gy)，分别稀释菌液10倍、IO2倍、IO3倍，IO4倍、IO5倍、IO6倍，然后涂布菌液于初筛培养基，培养适当时间，挑选产生白色透明圈的菌落于摇瓶复筛(采用复筛培养基培养)，培养168小时后测定阿魏酸酯酶酶活，获得一株酶活最高菌株，命名为ZJUQH2012147，其酶活达到 213. 07U/L。三、菌株的鉴定上述分离的菌株为曲霉属，自麦芽汁琼脂培养基(MEA)上生长较快，25°C黑暗条件下培养7天，菌落直径58-61_，质地绒状；分生孢子头黑褐色，初期球形，后期开裂，菌落背面无任何色素；菌株具有足细胞，分生孢子梗高大，宽7. 5-12. 8 u m，壁光滑，顶囊球形，大部分表面可育，产孢结构双层，分生孢子近球形，浅到褐色，具小刺，3. 0-5. 5 u m。未见有性孢子。测定的28SrRNA D1D2区序列如序列表SEQ ID NO. I所示。综合其菌落形态、显微特征以及rRNA基因序列等实验数据综合分析，可以鉴定为黑曲霉，并命名为黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUQH2012147。该菌株已于2012年05月23日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 6152。四、菌株的发酵培养及阿魏酸酯酶酶活测定将黑曲霉ZJUQH2012147接种到种子培养基进行在28°C下增殖培养144h，获取孢子。将发酵培养基(培养基I、培养2或培养基3) 30ml盛于250ml三角瓶中，接种生理盐水冲洗的孢子Iml (孢子数约为IO6个/ml)，28°C在旋转式摇床上培养120h，转速为140r/min0上述实施例中，酶的提取及活性测定方法如下将发酵步骤后所得的菌悬液置于低速离心机中3000rpm离心30min，取上清液即为粗酶液。用PH6. O柠檬酸盐缓冲液稀释一定倍数以测定酶活。用二次盐析的方法对粗酶液进行初步纯化，第一次加入硫酸铵浓度为40%，4°C过夜后于5000rpm离心30min，取上清，再加入硫酸铵至70%, 4°C过夜后再次于5000rpm离心30min,所得沉淀即为初步纯化的阿魏酸酯酶，然后用PH6. 0的柠檬酸盐缓冲液稀释，4°C保存待用。阿魏酸酯酶的测定如下因底物阿魏酸甲酯不溶于水,故用一级色谱纯甲醇溶解并配制成50mM。将其用90ml、0. IM的pH6. 0柠檬酸盐缓冲液稀释。取2mL稀释后的阿魏酸甲酯溶液重新加热至40°C，加入ImL稀释10倍的酶液。混合物于40°C下反应30min，再加热至100°C，IOmin后终止反应。反应混合物于室温冷却。以蒸馏水代替底物溶液体系为空白对照。酶解反应后的阿魏酸产物采用HPLC法定量分析，并在本试验中加以修改。实验中所采用的高效液相色谱条件为采用乙腈和0. 5%甲酸作为流动相，使用前用0. 45iim微膜过滤，将过滤好的溶剂常温下超声波处理半小时脱气。经前期试验摸索确定色谱条件为流动相为乙腈和0. 5%甲酸(体积比30 70)，C18反相柱(250X4. 6mm，4 y m)，检测温度30 0C，进样量10 u L，检测波长317nm。·阿魏酸酯酶的酶活定义为在40°C、pH6. 0条件下，每分钟水解底物阿魏酸甲酯产生I ii mol阿魏酸所需要的酶量为一个酶活力单位。培养基I培养获得阿魏酸酯酶酶活为138. 3U/L，培养基2培养获得阿魏酸酯酶酶活为116. 9U/L，培养基3培养获得阿魏酸酯酶酶活为173. 9U/L。李夏兰等(一株产阿魏酸酯酶青霉菌株的筛选、鉴定及生产特征.微生物学通报，2010,37(11) :1588-1593.)从腐烂的木质纤维中取样，通过富集培养，初筛和复筛得到一株橘青霉，其阿魏酸酯酶酶活最高达到20. 75U/L，本发明专利所获得酶活要远远高于报道的产酶菌株。
本发明公开了一种黑曲霉菌株及其应用，该菌株命名为黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUQH2012147，已于2012年05月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.6152。本发明还公开了所述菌株生产阿魏酸酯酶的方法，包括(1)将黑曲霉ZJUQH201217接入种子培养基进行增殖培养，获得种子液；(2)将种子液接入发酵培养基进行发酵培养。本发明黑曲霉菌株产阿魏酸酯酶活性高，易于实现阿魏酸酯酶的工业化生产。本发明生产阿魏酸酯酶的工艺采用豆粕、麦麸等粗原料作为发酵原料，该粗原料无需进行前处理，生产成本低。