专利名称：一种黑曲霉及其应用及发酵制备柠檬酸的方法柠檬酸是有机酸中的第一大酸，由于物理、化学等方面的优异性能，广泛应用于医药、化学、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域。柠檬酸的生产方法主要有两种一种是从天然含柠檬酸的果汁中提取；另一种是用发酵法进行生产，目前工业上主要以黑曲霉发酵法生产柠檬酸为主。具体的做法是将黑曲霉接种到发酵培养基中，发酵培养基中含有淀粉质原料酶解产物和氮源，经过发酵和固液分离得到柠檬酸的溶液。为了提高柠檬酸的生产能力，进行菌株改良，开发具有高产率的菌株是重点的研究方向。发明内容本发明的目的是为了提高黑曲霉发酵法生产柠檬酸的生产能力，提供一种新的黑曲霉菌株及采用该黑曲霉作为发酵菌种发酵制备柠檬酸的方法。为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种黑曲霉，其特征在于，所述黑曲霉的保藏编号为CGMCC5342。另一方面，本发明提供了一种如上所述的黑曲霉在发酵制备柠檬酸中的应用。第三方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成柠檬酸的条件下，将如上所述的黑曲霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。本发明提供的黑曲霉，保藏编号为CGMCC5342，采用该黑曲霉作为发酵菌种发酵制备柠檬酸，可缩短发酵周期、提高终点柠檬酸含量、单罐供酸量。具体的，实施例I采用本发明提供的黑曲霉发酵制备柠檬酸，发酵周期为52h，终点柠檬酸含量为14. 5g/100mL,单罐供酸量为34. 1kg，转化率为95. 0% ;而在其他条件相同的情况下，对比例I采用黑曲霉 Co827发酵制备柠檬酸，发酵周期为75h，终点柠檬酸含量为13. 9g/100mL,单罐供酸量为 33. 36kg，转化率为 94. 8%0本发明的其他特征和优点将在随后的
部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的菌株被命名为黑曲霉(Aspergillus niger),并于2011年10月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为 CGMCC5342。

以下对本发明的
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
一方面，本发明提供了一种黑曲霉，黑曲霉的保藏编号为CGMCC5342。
将该黑曲霉菌株分别接种在麦芽汁平板和察氏琼脂培养基上进行培养，并定期在显微镜下观察，发现
在麦芽汁琼脂培养基(麦芽汁为2° B6，琼脂为2g/100mL)上35°C、60%湿度下培养4d，菌落直径可达40-50mm，7d可达45_60mm，菌落平坦，边缘整齐，呈白色绒状，中间孢子黑色密集，反面无色或微黄，无分泌物，稍有霉味，分生孢子梗短，分生孢子头大圆形黑色， 老熟时开花状。
在察氏琼脂培养基上生长缓慢，分生孢子梗较长，分生孢子着生稀疏。
本发明中的黑曲霉菌株是通过将黑曲霉Co827作为出发菌株，在玉米原料配制的酸性平板培养基上经自然选育得到的。
酸性平板培养基玉米液化液10g/100mL、柠檬酸20g/100mL、琼脂3g/100mL。
用黑曲霉Co827发酵生产柠檬酸，在初始糖一定的情况下，取产酸高的发酵罐批的发酵醪液，在无菌室内用无菌吸管吸取ImL发酵醪液后用划线分离法使菌体附着于上述酸性平板培养基上。在36°C、65%湿度的培养箱内培养至培养基上长出白色的、表面有分生孢子梗的黑曲霉菌落，然后挑取单菌落至麦芽汁琼脂培养基(麦芽汁为2° B6，琼脂为 2g/100mL)斜面上在36°C、60%湿度的培养箱内培养5天左右，待单菌落孢子丰满后及时收至4°C冰箱中保藏。
将分离获得的多个菌株进行摇瓶筛选，摇瓶培养基配方为玉米液化液15重量％，玉米液化清液85重量％。摇床培养条件为转速350rpm，培养温度36± I °C，时间 70-85h。
通过摇瓶筛选出产酸高的菌株再次在上述酸性平板培养基上进行分离，通过摇瓶进行筛选，直至获得一株产酸高、发酵周期62小时以下且性能稳定的菌株，即本发明的黑曲霉，保藏编号为CGMCC5342。
发酵周期是指从接种开始至发酵液中还原糖含量达到0. 3g/100mL以下的这段培养时间。
根据GB/T 5513-2008检测还原糖含量。
另一方面，本发明提供了如上所述的黑曲霉在发酵制备柠檬酸中的应用。
第三方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，所述方法包括在生成柠檬酸的条件下，将如上所述的黑曲霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。
由于本发明提供的制备朽1檬酸的方法相对于现有技术的改进主要在于使用本发明的黑曲霉作为发酵菌种，本发明的黑曲霉的发酵周期为52-62小时，因此本发明方法的发酵时间优选为52-62小时，对于其他条件和操作没有特别的要求，例如，发酵条件可以为本领域常规的发酵条件，例如，发酵的条件可以包括温度为30-40°C，优选为35-37°C ;起始PH值为4-5 ;通气量为0. 1-1体积(体积 分钟)，优选为0. 3-0. 8体积(体积 分钟)。
发酵过程就其本质来说是由微生物参与的生物化学反应过程，因此微生物细胞的4数量、状态、代谢情况对产物的生物合成有着重要的影响。菌体浓度的大小对发酵产物的产率有着重要的影响。理论上菌体浓度越大，产物的产量也越大，但是菌体浓度过高会产生其他影响，如营养物质消耗过快，发酵液中的营养成分发生明显的改变，如有毒物质的积累等，这些可能改变菌体的代谢途径。因此，本发明中，以每升发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量优选为I. 8 X 107-3. 8 X IO7个孢子，进一步优选为2. 2X 107-3. 6X 107个孢子。
孢子的数量可以通过本领域公知的方法测定，例如，通过血球计数板计数。
本发明中，发酵培养基为本领域技术人员公知的概念，指微生物发酵所需的供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。发酵液也为本领域技术人员公知的概念，指接入微生物菌株的液体培养基(该液体培养基也即本发明中所称发酵培养基)，经过一段时间的培养后所得产物。
根据本发明，对发酵培养基的成分没有特别的要求，只要可以用于柠檬酸发酵的发酵培养基即可。优选地，发酵培养基含有由淀粉质原料酶解得到的酶解产物，且优选由淀粉质原料酶解得到的酶解产物的量占发酵培养基总量的80-100重量％。一般地，淀粉质原料酶解得到的产物称为液化液，液化液经固液分离得到酶解残渣和液化清液，通常可以将液化清液用于制备发酵培养基，也可以将液化清液与液化液混合后用于制备发酵培养基。 因此，本发明中，所述由淀粉质原料酶解得到的酶解产物包括上述经固液分离得到的液化清液，也包括未经固液分离的液化液，还包括上述二者的混合物。发酵培养基优选由液化液和液化清液与水混合或不与水混合得到，且进一步优选以发酵培养基的总重量为100重量份为基准，液化清液的用量为80-85重量份，液化液的用量为15-20重量份。
根据本发明，液化清液可以通过多种方法制备得到，例如，可以通过如下方法制备得到将淀粉质原料粉碎，将粉碎后的产物进行酶解，酶解得到的产物再经固液分离，得到液化清液和酶解残渣，固液分离的条件使酶解残渣的固含量为45-55重量％，优选为49-51 重量％。
根据本发明，淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备柠檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种，优选情况下，所述淀粉质原料为玉米。
所述酶解步骤可以通过本领域常用的方法完成，比如向粉碎产物中添加产酶微生物和/或酶，在产酶微生物的生长温度和/或酶有活力的温度下保温完成。所述产酶微生物为能够分泌淀粉酶的产酶微生物。所述酶包括淀粉酶。
由于微生物生长会产生副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克粉碎后的粉碎产物的干重计，淀粉酶的用量为15-50个酶活力单位。
本发明中，酶活力单位的定义为在pH值为6. O、温度为70°C的条件下，I分钟将I 毫克淀粉转化为还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
酶解的温度可以在很大范围内改变，优选为70_105°C，更优选为90_95°C。酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选酶解的时间为90-150分钟，更优选为 100-120分钟。酶解的pH值可以在很大范围内改变，优选为5. 0-7. 0，更优选为5. 4-6. 2，进一步优选为5. 8-6. O。
淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，淀粉酶一般包括a -淀粉酶、 ^ -淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。
根据本发明，优选使用a -淀粉酶和/或异淀粉酶。
根据本发明，固液分离的方法与装置为本领域技术人员所公知，例如，压滤机或离心机。
黑曲霉可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵培养基中之前，将黑曲霉经过种子培养，之后将得到的种子液加入到发酵培养基中。黑曲霉种子培养的程度可以通过取样显微镜镜检、酸度测定和PH测定来确定，当pH < 2. O、酸度> lg/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时停止培养。
优选情况下，种子培养的方法包括将黑曲霉接种在黑曲霉培养液中进行培养， 黑曲霉培养液中含有10-17重量％的玉米粉，以每升培养液为基准，黑曲霉的接种量为2.75X 108-3X 108 个孢子。
将经过种子培养得到的种子液加入到发酵培养基中进行发酵，通常用接入发酵培养基的种子液的体积占接入种子液后发酵培养基的体积的百分比来表示黑曲霉的接种量， 当接入发酵培养基的种子液的体积占接入种子液后发酵培养基的体积的8-12%时，能够满足以每升发酵培养基为基准，黑曲霉的接种量在2. 2 X 107-3. 6 X IO7个孢子范围内。因此， 接入发酵培养基的黑曲霉的优选的接种量可以表示为接种量为8-12%。
根据本发明，黑曲霉种子罐的培养液的制备方法没有特别的限制，只要得到的培养液能够适用于黑曲霉菌种的生长即可。
根据本发明，黑曲霉的种子罐的培养条件可以在很大范围内改变，例如培养的条件可以包括培养的温度为30-38°C，优选为35-37°C;起始pH值为5_6 ;通气量为0. 1-1体积(体积 分钟)，优选为0. 3-0. 8体积(体积 分钟)。
术语“通气量”一般以通气比来表示，通常以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V/V min)，例如通气比为I : 0. 1-1，简称通气量为0. 1-1体积(体积 分钟)。
发酵的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐。
按照本发明的方法制备得到的发酵产物柠檬酸可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求分离并精制，比如中和、酸解、脱色、浓缩、结晶、包装。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述
中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
在以下实施例中
根据GB 1987-2007标准检测所得柠檬酸溶液的浓度(即终点柠檬酸含量)。
单罐供酸量=柠檬酸溶液的浓度X柠檬酸溶液的体积。
转化率)=单罐供酸量/总糖的重量X100%，其中总糖的重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。
以下实施例使用的黑曲霉菌株A均为本发明的上述黑曲霉菌株(该菌株于2011 年10月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC5342)。
实施例I
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。
(I)将收获的56千克玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为400微米的粉碎后产物。
(2)将粉碎后产物按24重量％的浓度调浆，相对于每克粉碎后产物，加入20个酶活力单位的淀粉酶(诺维信公司，a-淀粉酶，本发明实施例中均为此淀粉酶)，进入喷射器，在93°C、pH为5. 9的条件下酶解100分钟得到产物。
(3)将一部分酶解得到的产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和酶解残渣，其中，酶解残渣的固含量为51重量％。
(4)配制发酵培养基，将180. 5千克的上述液化清液、35. 5千克的酶解得到的产物灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。
(5)将步骤(2)中的剩余部分的酶解得到的产物，加水稀释至总糖为10重量％， 得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121°c消毒，维持30分钟后快速降温至36°C，接入黑曲霉菌株A，每升培养液中黑曲霉的接种量为2. 75 X IO8个孢子。在35°C、起始pH值为5、0. 3体积(体积 分钟)的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH < 2.0、酸度> lg/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
(6)将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，接种量为 8 %，发酵条件包括温度为35°C，起始pH值为5，通气量为0. 3体积(体积 分钟)，发酵至发酵液中还原糖含量达到0. 3g/100mL以下停止发酵，发酵时间为52小时，然后进行固液分离得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率见表I。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。
(I)将收获的56千克进行粉碎，得到平均粒子直径为380微米的粉碎后产物。
(2)将粉碎后的产物按27重量％的浓度调浆，相对于每克粉碎后的产物，加入50 个酶活力单位的淀粉酶，进入喷射器，在95°C、pH为5. 8的条件下酶解110分钟得到产物。
(3)将一部分酶解得到的产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出液化清液和酶解残渣，其中，酶解残渣的固含量为50重量％。
(4)配制发酵培养基，将177. I千克的上述液化清液、38. 9千克的酶解得到的产物灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。
(5)将步骤(2)中的剩余部分的酶解得到的产物，加水稀释至总糖为10重量％， 得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121°C消毒，维持30分钟后快速降温至36°C，接入黑曲霉菌株A，每升培养液中黑曲霉的接种量为2. 8 X IO8个孢子。在36°C、起始pH值为5.5,0. 6体积(体积 分钟)的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH < 2.0、酸度> lg/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
(6)将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，接种量为 10%,发酵条件包括温度为36°C，起始pH值为4. 5，通气量为0. 8体积(体积 分钟)，发酵至发酵液中还原糖含量达到0. 3g/100mL以下停止发酵，发酵时间为62小时，然后进行固液分离得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率见表I。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备柠檬酸的方法。
(I)将收获的56千克玉米进行粉碎，得到平均粒子直径为370微米的粉碎后产物。
(2)将粉碎后的产物按26重量％的浓度调浆，相对于每克粉碎后的产物，加入15 个酶活力单位的淀粉酶，进入喷射器，在90°C、pH为6. 0的条件下酶解120分钟，得到酶解产物。
(3)将一部分酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解液化清液和酶解残渣，其中，酶解残渣的固含量为49重量％。
(4)配制发酵培养基，将169千克的上述酶解液化清液和42. 2千克的酶解得到的产物灭菌后加入到300L的发酵罐中，得到发酵培养基。
(5)将步骤(2)中的剩余部分的酶解得到的产物，加水稀释至总糖为10重量％， 得到培养液，将培养液投入种子罐，加热到121°c消毒，维持30分钟后快速降温至36°C，接入黑曲霉菌株A，每升培养液中黑曲霉的接种量为3 X IO8个孢子。在37°C、起始pH值为6、0.8体积(体积 分钟)的通气条件下进行菌种培养；通过取样显微镜镜检、酸度测定和 pH测定对黑曲霉的生长进行观察，当pH < 2. O、酸度> lg/100mL、菌球大小均匀、菌丝粗壮伸出时，停止培养。
(6)将步骤(5)培养的黑曲霉菌种加入到步骤(4)的发酵罐中开始发酵，接种量为 12%,发酵条件包括温度为37°C，起始pH值为4，通气量为0. 6体积(体积 分钟)，发酵至发酵液中还原糖含量达到0. 3g/100mL以下停止发酵，发酵时间为56小时，然后进行固液分离得到柠檬酸溶液。测定柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率见表I。
对比例I
按照实施例I的方法发酵制备柠檬酸，不同的是，接入的黑曲霉菌株为现有技术常用的黑曲霉Co827，发酵至发酵液中还原糖含量达到0. 3g/100mL以下停止发酵，发酵时间为75小时，然后进行固液分离得到柠檬酸溶液。测定所得柠檬酸溶液的浓度，计算单罐供酸量和转化率见表I。
表I


本发明提供了一种黑曲霉(Aspergillus niger)，其特征在于，所述黑曲霉的保藏编号为CGMCC 5342。另一方面，本发明提供了一种上述黑曲霉在发酵制备柠檬酸中的应用。第三方面，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成柠檬酸的条件下，将上述黑曲霉接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。本发明提供的黑曲霉作为发酵菌种发酵制备柠檬酸，可缩短发酵周期、提高终点柠檬酸含量、单罐供酸量。