专利名称：一种利用黑曲霉水解灯盏乙素制备野黄芩素的方法灯盖花，又名灯盖细辛，是植物短葶飞蓬(Mrigeron breviscapus (Vant.)Hand-Mazz)的干燥全草，主要分布在云南、广西等地，味辛、微苦，性温，具有祛风除湿、温络止痛、散寒解表之功效。现代药理学研究表明，灯盏细辛提取物具有降低血浆粘度、舒张血管、降低血管阻力、抑制缺血后血小板聚集、抗缺血再灌注损伤及改善脑功能等作用(中草 药，2006，37 (8):附9-附11)，由此引起了人们对灯盏细辛有效成分进行研究的广泛兴趣。经过多年研究，人们从灯盏细辛中分离得到了黄酮类化合物、咖啡酸酯类化合物、氨基酸及多糖类等多种化学成分，并发现灯盏乙素是灯盏花提取物的主要活性成分。研究表明，灯盏乙素还具有抗肿瘤、抗病毒、抗肝纤维化、抗老年痴呆等多种药理作用。但是，有关灯盏乙素的药代动力学研究表明，灯盏乙素口服给药后，灯盏乙素的血药浓度很低，即生物利用度很低，认为口服几乎不吸收(中国医药工业杂志，2003，34 (12) :618-620)，这极大地制约了其临床疗效的发挥。近年来，有关灯盏乙素的体内代谢研究表明，野黄芩素为灯盏乙素的主要代谢产物(Planta Med 2007, 73: 363-365)，而且，野黄芩素比灯盏乙素具有更高的生物利用度(中国药学杂志，2007，42 (18) :1418-1421)。因此，野黄芩素的研究、开发与利用受到了人们的关注。当前，仅在少数几种植物中发现有天然的野黄芩素存在，而且含量极低，因此，试图从植物中提取获得大量的野黄芩素是不现实的。为了大量制备野黄芩素，以往通常采用酸性条件下水解灯盏乙素获得，但酸水解法反应条件不易控制，转化率低，同时会对环境造成污染，应用范围受到限制。
本发明为了解决现有技术存在的反应条件不易控制、转化率低、环境污染严重等技术问题，提供了一种条件温和、利于环保、适合工业化生产的制备野黄芩素的方法。本发明的技术解决方案是一种利用黑曲霉水解灯盏乙素制备野黄芩素的方法，利用黑曲霉水解灯盏乙素葡萄糖醛酸基，制备野黄芩素。即利用黑曲霉niger AS 3. 795)对底物灯盏乙素进行生物转化，利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取，并利用DlOl大孔吸附树脂柱色谱和重结晶对转化产物进行纯化。具体步骤如下 a)土豆液体培养基的配制取新鲜土豆，去皮，切成2cm3小块，加入5倍量水煮沸，保持沸腾状态30分钟，用纱布过滤残渣，滤液加水定容(每200克土豆配制I升培养液)，定容后加入2%葡萄糖。将配好的培养液进行分装，250mL的锥形瓶可装入60mL培养液，500mL锥形瓶可装入200mL培养液。用纱布及牛皮纸将瓶口封好，放入高压灭菌锅中灭菌。灭菌条件为115°C灭菌30min。b)微生物的培养将黑曲霉(Aspergillus niger AS 3. 795)从PDA固体培养基上接种至上述配制好的土豆液体培养基中，置于摇床中于160rpm，26°C条件下培养两天。 c)加入底物将底物灯盏乙素用适量乙醇溶解，配成5. Omg/mL的乙醇溶液。加入到已培养两天的微生物发酵液中，在相同条件下继续培养四天。d)发酵液的处理发酵液抽滤后收集滤液，减压条件下低温浓缩至小体积，用等体积乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并浓缩至干，获得粗浸膏。e)转化产物的分离纯化将步骤d)得到的粗浸膏利用DlOl大孔吸附树脂柱色谱进行分离，分别用50%、60%和95%乙醇水溶液洗脱，得到Q1-UQ1-2和Q1-3三个流分，Q1-2在60%乙醇水溶液中反复重结晶，得到转化产物野黄芩素。其纯度经高效液相色谱检测达到99%以上。该转化产物具有以下理化数据yellowamorphous powder ；UV λ MeOH maxnm 281,336 ;FeCl3 显色呈阳性；ESI-MS m/z :285 [Μ-ΗΓ ; 1H-NMR (DMSO-J6) δ 6. 73 (1Η,s, Η-3), 6. 56 (1Η, s, Η_8)，7.90 (2Η, d, J=8.6 Hz, Η_2’，6’)，6.91 (2Η, d,J=8. 6 Hz, Η-3，，5，)，12.78 (1Η, s, 5-0Η). 13C-NMR(DMSO-J6) δ 163.6(02)，102.4(03)，182.1(04)，147.1(05)，129.2(06)，153.4(07)，93.9(08)，149.7(09)， 104. I (C-IO), 121.6(01，)， 128. 4 (C—2，，6，)， 116. O (C—3，，5，)，161. l(C-4，)。本发明是利用黑曲霉水解灯盏乙素葡萄糖醛酸基，制备野黄芩素。克服了现有技术存在的反应条件不易控制、转化率低、环境污染严重等技术问题，提供了一种条件温和、利于环保、适合工业化生产的制备野黄芩素的方法。
称取灯盏乙素15. Og于IOOOmL圆底烧瓶中，加入IOOmL乙二醇、IOOmL水和IOmL浓盐酸，于90°C加热搅拌反应5 h。TLC方法监测反应进程，反应结束后，向反应瓶中加入500mL水，有大量沉淀析出，室温静置8 h后，过滤，过滤物水洗至中性，置60°C真空干燥箱中干燥48 h，得野黄芩素粗品7. 3 g。将上述野黄芩素粗品溶于适量甲醇中，用20g硅胶(100-140目)拌样，通风橱中挥去溶剂。然后，利用硅胶柱色谱(IOOcmX 4cm;柱床硅胶100g，200-300目)对其进行纯化，先后用乙酸乙酯、乙酸乙酯-丙酮(4 1，V/V)洗脱。收集乙酸乙酯-丙酮(4 I, V/V)段洗脱液组分，减压回收溶剂后，用70%甲醇-水溶液重结晶，得到浅黄色晶体5. Sg,转化率为62. 5%。其纯度经高效液相色谱检测达到98%。实施例2 :通过黑曲霉制备野黄芩素
a)土豆液体培养基的配制取新鲜土豆2kg,去皮,切成2cm3小块,加入IOL水煮沸,保持沸腾状态30分钟，用纱布过滤残渣，滤液加水定容至10L，定容后加入200g葡萄糖。将配好的培养液分装至500mL的锥形瓶中，每瓶装200mL培养液，大约可分装50瓶。将上述50瓶培养液用纱布及牛皮纸将瓶口封好，分批放入高压灭菌锅中灭菌。灭菌条件为115°C灭.菌 30min。b)微生物的培养将黑曲霉(Aspergillus niger AS 3. 795)从PDA固体培养基上接种至上述配制好的土豆液体培养基中，置于摇床中于160rpm，26°C条件下培养两天。c)加入底物将Ig灯盏乙素用200mL乙醇溶解，配成5. Omg/mL的乙醇溶液，将该溶液加入到步骤b)所述的发酵液中，每瓶发酵液加入4ml，然后在相同条件下继续培养四天。d)发酵液的处理发酵液抽滤后收集滤液，减压条件下低温浓缩至4-5L，用等体积乙酸乙酯萃取3遍，萃取液合并浓缩至干，获得粗浸膏2. lg。e)转化产物的分离纯化将步骤d)得到的粗浸膏利用DlOl大孔吸附树脂柱色谱进行分离，分别用50%、60%和95%乙醇水溶液洗脱，得到Q1-UQ1-2和Q1-3三个流分，Q1-2在60%乙醇水溶液中反复重结晶，得到转化产物野黄芩素480mg，转化率为77. 5%。其纯度经高效液相色谱检测达到99%以上。


本发明公开一种利用黑曲霉水解灯盏乙素制备野黄芩素的方法，利用黑曲霉水解灯盏乙素葡萄糖醛酸基，制备野黄芩素。包括如下步骤利用黑曲霉(AspergillusnigerAS3.795)对底物灯盏乙素进行生物转化，利用乙酸乙酯对发酵液中的转化产物进行萃取，并利用D101大孔吸附树脂柱色谱和重结晶对转化产物进行纯化。所制得的转化产物，其纯度根据高效液相色谱检测可达到99%以上。本发明克服了葡萄糖醛酸苷难以水解的缺点，能够在常温、常压等较为温和的条件下大量制备野黄芩素，有利于环境保护，降低了生产成本，适合于工业化生产。