专利名称：一种胚性材料的超低温冷冻保存方法在林木体细胞胚胎发生和植株再生体系中，培养材料中的胚性细胞是否能较长时间保持旺盛的分和植株再生能力也是林木体胚产业化的 重要瓶颈。目前，还没有较好的用于保存胚性材料的方法，常用的就是低温保藏，这种方法虽然简单，但是保存时间短，而且细胞恢复困难，増殖能力低，根本不能长期保存。
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种胚性材料的超低温冷冻保存方法，以实现胚性材料长期保存井能使其保持高频增殖能力。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下 一种胚性材料的超低温冷冻保存方法，包括以下步骤 (1)取待保存的胚性材料，按10%的接种量接入高渗液体培养基，25°C，培养3 10d;其中，高渗液体培养基为添加有O. Γ0. 8mg/L山梨醇的M13基本培养基； (2)过滤步骤(I)预培养的胚性材料，装入冷冻管，向冷冻管中加入复合玻璃化保护剂，(TC，放置脱水O 70min，然后装入冷冻盒直接投入液氮速冻，液氮中长期保存；复合玻璃化保护剂为添加30%甘油和30%こニ醇的M13基本培养基。步骤(I)中，培养6 8d。步骤(I)中，在所述的高渗液体培养基中还加有f 5mg/L ABA和5(T200mg/L脯氨酸。步骤(2)中，所述的放置脱水，为先用60%复合玻璃化保护剂保护胚性材料过渡脱水lOmin，然后转到100%复合玻璃化保护剂脱水l(T60min，然后再投入液氮保存。有益效果与现有技术相比，本发明的胚性材料的超低温冷冻保存方法，操作简单，方便可行，解决了林木体胚产业化的重要瓶颈问题，可实现胚性材料长期保存到I年以上，井能使其保持高频增殖能力，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。
图I是预培养渗透剂浓度试验结果 图2是预培养时间试验结果 图3是不同温度进行细胞复苏结果 图4是胚性悬浮细胞复苏结果图5是可溶性淀粉在恢复培养中的作用结果图；图中，A、B为恢复5d时的状态，C、D为恢复25d时的状态；
图6是ABA对细胞存活的影响结果 图7是山梨醇处理后内源脯氨酸的变化结果 图8是外源脯氨酸对细胞的保护作用结果图。

为了提高冷冻细胞的存活率，需要将胚性细胞进行预处理，采取的措施是将需要冷冻保存的胚性细胞接种在含有山梨醇等渗透调节剂渗透剂的培养基上，通过渗透调节使细胞部分脱水，減少细胞内的水分，降低冷冻过程中冰晶的形成对细胞造成的伤害。通过TTC法检测细胞活力，从而确定合适的预处理条件。TTC法是细胞活力測定的常用方法，该方法用于检测细胞内脱氢酶的活性。脱氢酶使氯化三苯四氮哇(TTC)还原生成ー种红色复合物，此有色物质不溶于水，但溶于酒精。因此，用酒精抽提，然后用分光光度计测定485nm时的吸光度，吸光度高的细胞活性强，从而可以确定细胞的生理状态。将胚性悬浮细胞继代到高渗液体培养基中，预培养不同的天数。高渗液体培养基为在MS基本培养基中加入2. Omg/L 2，4-D、0. 2mg/L 6，BA、500mg/L LH和30g/L蔗糖，以及浓度分别为 O. Img/L、0. 2mg/L、0. 3mg/L、0. 4mg/L、0. 5mg/L、0. 6mg/L、0. 7mg/L 和 0. 8mg/L的山梨醇。结果如图I所示，表明在不同预培养浓度下细胞存活率不同，以山梨醇浓度O. 2mol/L O. 5mol/L时进行的预培养，细胞存活率随山梨醇浓度上升而逐渐上升，到0.6mol/L时活力达到最高。当山梨醇浓度超过O. 6mol/L吋，细胞存活率呈下降趋势。在
O.6mol/L山梨醇浓度下冷冻细胞存活率最高的结果说明，该浓度下细胞脱水最充分，同时没有高渗胁迫存在。通过不同预培养时间比较，结果如图2所示，表明随着预培养时间的増加，细胞冷冻后的活力明显上升，在第4d和第7d处理情况下细胞活力达到ー个小高峰，随后细胞活力开始下降，预培养时间短于3d时细胞活力明显偏低，随着预培养时间的延长细胞活力不断升高并趋于稳定，说明胚性悬浮细胞对高渗环境的ー个逐步适应的过程。预培养7d吋，细胞在每个处理情况下都达到了最高值。因此，认为预培养7d是合适的时间。在进行悬浮培养中，在I :9体积比的细胞和培养基的比例下，细胞在第7d处于细胞生长的对数生长期，细胞分裂旺盛，形态结构稳定，对冷冻，化冻造成的损伤有较强的抵抗力。实施例2
将实施例I预培养的胚性悬浮细胞过滤，取适量体积(约ImL)的细胞加入冷冻管(5mL)中，向管中加入ImL复合玻璃化保护剂(含30%体积甘油、30%体积こニ醇的M13基本培养 基)，在0°C下，放置脱水O 70min，然后将冷冻管装入冷冻盒直接投入液氮，长期保存。预培养时间对冷冻保存的成功有着极其重要的作用，通过调节渗透压，可以提高细胞的抗逆性同时降低细胞内的含水量，从而降低冰晶产生的程度，減少对细胞的伤害。通过确定以含有O. 6mol/L山梨醇的M13号培养基为预处理培养基，细胞与培养基体积比为
I:9，以含30%こニ醇和30%甘油的M13基本培养基作为复合玻璃化保护剂，先放入60%体积(用水稀释)的复合玻璃化保护剂过渡脱水O或lOmin，然后放入100%复合玻璃化保护剂脱水时间(TeOmin为试验条件，对预培养时间进行筛选。结果显示，在预培养初期，随着培养时间的増加，细胞活力迅速上升，在培养3天时达到最高值，随后开始下降，在第5天开始细胞活力維持在ー个相对稳定的阶段，在13天时明显下降。随着预培养时间的増加，细胞冷冻后的活力明显上升；在第4天和第7天，各处理细胞活力达到ー个小高峰，随后细胞活力开始下降，预培养时间短于3天时细胞活力明显偏低，随着预培养时间的延长细胞活力不断升高并趋于稳定，体现了杂交鹅掌楸胚性悬浮细胞对高渗环境的ー个逐步适应的过程。在不同的过渡脱水和脱水时间情况下，在未经过复合玻璃化保护剂处理，直接把预培养 后的细胞放入液氮中，随着预培养时间的増加，细胞的抗性增强，呈上升趋势，在第8天达到高值，但与经过复合玻璃化保护剂处理后的相比，其活力低于经过处理的细胞，可以发现在过渡脱水lOmin，脱水30min在各个预培养时间情况下都能活得ー个较高的细胞活力，说明处理对细胞能起到最大限度地保护作用。实施例3
将实施例2储存胚性悬浮细胞的冷冻盒从液氮中取出，迅速将冷冻管置于不同温度梯度水浴中，快速化冻2min。吸去冷冻保护剂，向冷冻管加入ImL的清洗培养基(即预培养基，为O. 6mol/L山梨醇的愈伤增殖培养基)，停留2min，重复3次洗涤。在本实施例设置了五个水浴温度梯度，结果如图4所示，发现复苏温度在37°C时，复苏细胞的活力达到最高点。对于杂种马褂木来说，该温度条件下，细胞的活力要高于40°C的化冻温度。通过恢复培养让细胞迅速地从逆境条件恢复到正常培养的环境中。由于冷冻保护剂是高渗条件(O. 4M蔗糖)，如果渗透压降低过快将导致细胞过快膨胀，从而对细胞膜产生伤害。因此缓慢地降低滲透压可以最大限度地提高细胞存活率，该试验步骤过程如下
第一歩高渗恢复培养把洗涤后的细胞团物质迅速转移到垫有滤纸的高渗恢复培养基。a.培养时间梯度为l、2、3、4、5、6d，25°C培养。根据试验结果表明，在含0.4M蔗糖
的高渗愈伤増殖培养基上培养2d较为合适。b.加入0、0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5M浓度的蔗糖调节渗透压。根据试验结果以蔗糖渗透压浓度为O. 4M吋，恢复培养的细胞可以迅速达到良好状态，在转到愈伤增殖培养基中培养5d后就可以看到新的愈伤长出。第二歩低渗的恢复培养
a.培养天数为l、2、3、4、5、6d，含O. 3M蔗糖的低渗愈伤增殖培养基上培养2d较为合适。b.加入0、0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5M浓度的蔗糖调节渗透压，根据试验测定在渗透
压浓度O. 3M时，细胞的恢复时间最短，在转到愈伤增殖培养基中培养第5d就长出新的愈伤组织，最后转移到愈伤增殖培养基上进行培养。复苏后重新诱导成的体细胞胚胎，经过超低温冻存与复苏处理后的胚性材料，在体胚诱导培养基上培养，经过3个月的体胚发育过程，如图4所示，能够实现高频体细胞胚胎发生，与没有冻存的材料发育过程相一致。
实施例4
将实施例2冻后的胚性悬浮细胞分别接种在添加有lmg/L、2mg/L、5mg/L、I Omg/L、20mg/L可溶性淀粉的O. 4M蔗糖愈伤增殖培养基培养2天后，转到O. 3M蔗糖的愈伤增殖培养基上培养2天，再转到正常生长培养基上。观察结果如图5所示，发现接种在淀粉培养基上效果最好，细胞恢复生长的延滞较短，为2 4d，细胞生长迅速。其它两个处理，许多细胞团要先变成黄褐色，经过9 14d的延滞后才开始生长。直接转接在未加可溶性淀粉的培养基上，许多团块变成白色或者褐色，不能生长。通过试验加入不同浓度的可溶性淀粉，可以有效地消除湿润现象，使细胞在进行滲透平衡过程时损伤最小，试验结果表明10mg/L体细胞胚胎的发生频率高。、
实施例5
在实施例I的预培养基中加入不同浓度的ABA，通过ABA提高细胞的抗逆性，从而提高细胞的存活率，在本试验中，在预培养阶段加入不同浓度lmg/L、2 mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L的ABA，结果如图6所示，发现在4mg/L时能显著地提高细胞的抗冻性，细胞存活率达到了80%。实施例6
在植物的组织、器官和全株实验中，发现脯氨酸的积累与抗渗透胁迫之间有显著的正相关，可以作为衡量细胞对逆境适应能力的指标。经过不同浓度的山梨醇预培养后，细胞的抗冻活力有所差异，结果如图7所示，在超低温保存后，O. Γ0. 6mol/L山梨醇培养后的细胞其脯氨酸含量呈直线上升；山梨醇浓度在O. 5,0. 7mol/L处的脯氨酸含量与冷冻前几乎持平，在O. 6mol/L时脯氨酸含量超过冷冻前并达到最大值。说明超低温条件下，尽管细胞会部分死亡，但是其体内的脯氨酸含量还是会相对的增加用来保护细胞，这也与在O. 6mol/L山梨醇预培养下超低温保存后细胞活力最高相一致。在实施例I的预培养基中，加入脯氨酸后，细胞的存活率随着浓度增加而提高。如图8所示，在150mg/L时细胞存活率达到最高值，但脯氨酸含量继续增加后，细胞存活率开始下降，说明高浓度脯氨酸可能对细胞产生了一定的毒害作用，导致细胞在外加高浓度脯氨酸情况下，细胞活力快速下降。


本发明公开了一种胚性材料的超低温冷冻保存方法，包括以下步骤取待保存的胚性材料接种入高渗液体培养基，25℃培养3~10d；过滤胚性材料装入冷冻管，加入复合玻璃化保护剂，0℃放置脱水0～70min，然后装入冷冻盒直接投入液氮速冻，液氮中长期保存即可。本发明的胚性材料的超低温冷冻保存方法，操作简单，方便可行，解决了林木体胚产业化的重要瓶颈问题，可实现胚性材料长期保存到1年以上，并能使其保持高频增殖能力，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。