专利名称：纳米乳剂疫苗的制作方法免疫接种是用于改善人们健康的主要特征。尽管针对许多常见病的多种成功疫苗的可利用性，传染病仍是健康问题和死亡的主因。在现有疫苗中固有的显著问题包括关于反复免疫接种的需要，和目前疫苗递送系统对于广谱疾病的无效。为了开发针对已抗拒疫苗发展的病原体的疫苗和/或克服商购可得疫苗的缺点(例如由于不利结果、费用、复杂性和/或利用不足(underutilization))，必须开发抗原呈递的新方法，其允许更少的免疫接种、更有效的使用和/或对于疫苗的更少副作用。发明概述本发明提供了用于免疫应答刺激的方法和组合物。具体而言，本发明提供了免疫原性组合物和使用其诱导针对副粘病毒科的致病性病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的免疫应答(例如免疫(例如保护性免疫))的方法。本发明的组合物和方法尤其在临床(例如治疗和预防医学(例如接种疫苗))和研究应用中有用。在一些实施方案中，本发明提供了包含纳米乳剂(nanoemulsion)灭活的免疫原(例如副粘病毒科的致病性病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的免疫原性组合物，所述纳米乳剂包含水相、油相和溶剂。在一些实施方案中，免疫原包含副粘病毒科的致病性病毒(例如灭活的RSV (例如使用本发明的乳剂或通过其他方式灭活的)。在一些实施方案中，RNA病毒是副粘病毒科的病毒。例如，在一些实施方案中，病毒是副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)。在一些实施方案中，病毒是肺炎病毒亚科病毒。在优选实施方案中，病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含纳米乳剂灭活的RSV。在一些实施方案中，纳米乳剂是W8(I5EC，尽管本发明并不限于其。例如，在一些实施方案中，纳米乳剂选自本文描述的纳米乳剂制剂之一。在一些实施方案中，组合物包含1-50%纳米乳剂溶液，尽管更多和更少的量也在本发明中有用。例如，在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约1.0% - 10%、约10%-20%、约20% - 30%,3约30%-40%、约40% - 50%、约50%-60%或更多纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约10%纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约15%纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约20%纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约12%纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约8%纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约5%纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约2%纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含约纳米乳剂溶液。在一些实施方案中，免疫原性组合物(例如施用于受试者以在受试者中生成免疫应答)包含MlO6噬斑形成单位(PFU)的副粘病毒科的灭活致病性病毒(例如RSV)，尽管也可以利用更多(例如约乜106 PFU,8x106 PFUUxIO7 PFUJxIO7 PFU、4xl07 PFU、8xl07 PFU、IxlO8 PFU、IxlO9 PFU或更多PFU的通过纳米乳剂灭活的RSV)和更少(例如约 IxlO6 PFU、5xl05 PFUUxIO5 PFU,5x1 O4 PFUUxIO4 PFU、5x103 PFUUxIO3 PFU或更少PFU的通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒(例如RSV))量。在一些实施方案中，组合物是稳定的(例如在室温(例如达12小时、1天、2天、3天、4天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、1年或更多)。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含药学可接受的载体。本发明并不限于任何具体药学可接受的载体。实际上，可以利用任何合适的载体，包括但不限于本文描述的那些。在一些实施方案中，免疫原性组合物进一步包含佐剂。本发明并不限于任何具体佐剂，并且本文描述的任何一种或多种佐剂在本发明的组合物中有用，包括但不限于偏向Thl免疫应答的佐剂。在一些实施方案中，免疫原包含病原体产物(例如包括但不限于衍生自病原体的蛋白质、肽、多肽、核酸、多糖或膜组分)。在一些实施方案中，免疫原和纳米乳剂在单一容器中组合。 在一些实施方案中，本发明提供了在受试者中诱导针对副粘病毒科的致病性病毒(例如呼吸道合胞病毒(RSV))的免疫应答的方法，其包括提供包含纳米乳剂和免疫原的免疫原性组合物，其中所述免疫原包含通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)));和在这样的条件下给受试者施用组合物，从而使得受试者生成针对病毒的免疫应答。本发明并不受选择用于施用本发明的组合物的途径的限制。在一些实施方案中，施用免疫原性组合物包含使受试者的粘膜表面与组合物接触。在一些实施方案中，粘膜表面包含鼻粘膜。在一些实施方案中，诱导免疫应答在受试者中诱导针对副粘病毒科的病毒(例如RSV)的免疫。在一些实施方案中，免疫包含全身免疫。在一些实施方案中，免疫包含粘膜免疫。在一些实施方案中，免疫应答包含在受试者中增加的IFN-Y表达。在一些实施方案中，免疫应答包含在受试者中增加的IL-17表达。在一些实施方案中，免疫应答包含增加的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5和IL-13)表达的不存在。在一些实施方案中，免疫应答包含针对副粘病毒科的灭活的病毒(例如RSV)的全身IgG应答。在一些实施方案中，通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒(例如RSV)在这样的条件下施用于受试者，从而使得10 - IO3噬斑形成单位(PFU)的灭活的病毒存在于施用于受试者的剂量中，尽管也可以利用更多(例如约104、105、106、IO7UO8或更多)和更少(例如约1-10或更少)PFU的通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒(例如RSV)。在一些实施方案中，15%纳米乳剂溶液用于灭活病毒。在一些实施方案中，纳米乳剂包含W8(I5EC。在一些实施方案中，免疫保护受试者免于展示出通过副粘病毒科的病毒(例如RSV)引起的疾病的病征或症状。在一些实施方案中，免疫保护受试者免于由后续暴露于副粘病毒科的活病毒(例如RSV)的攻击。在一些实施方案中，组合物进一步包含佐剂。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，诱导免疫应答在受试者中诱导针对副粘病毒科的病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的免疫。在一些实施方案中，诱导针对副粘病毒科的病毒(例如RSV)的免疫包含全身免疫。在一些实施方案中，免疫包含粘膜免疫。在一些实施方案中，免疫应答包含受试者中增加的IFN-Y表达。在一些实施方案中，免疫应答包含受试者中增加的IL-17或其他类型Thl细胞因子表达。在一些实施方案中，免疫应答包含针对免疫原的全身IgG应答。在一些实施方案中，免疫应答包含针对免疫原的粘膜IgA应答。在一些实施方案中，每个剂量包含副粘病毒科的纳米乳剂灭活的病毒(例如RSV)的量，其足以生成针对病毒的免疫应答。副粘病毒科的病毒(例如RSV)的有效量是无需进行定量的剂量，只要当施用于受试者时，副粘病毒科的病毒(例如RSV)的量在受试者中生成免疫应答。在一些实施方案中，当本发明的纳米乳剂用于灭活副粘病毒科的活病毒(例如RSV)时，预期每个剂量(例如施用于受试者以诱导免疫应答))包含10 - IO10 pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含IO5 - IO8 pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含IO3 -IO5 pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含IO2 - IO4 pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含10 pfu病毒/剂量；在一些实施方案中，每个剂量包含IO2 pfu病毒/剂量；并且在一些实施方案中，每个剂量包含IO4 Pfu病毒/剂量。在一些实施方案中，每个剂量包含超过101° pfu病毒/剂量。在一些优选实施方案中，每个剂量包含IO3 pfu病毒/剂量。本发明并不限于任何具体纳米乳剂组合物。实际上，本文描述了在本发明中有用的多种纳米乳剂组合物。类似地，本发明并不限于纳米乳剂中存在的具体油。预期了多种油，包括但不限于大豆、鳄梨、角鲨烯、橄榄、低芥酸菜子、玉米、油菜籽、红花、向日葵、鱼、香料和水不溶性维生素。本发明也不限于具体溶剂。预期了多种溶剂，包括但不限于醇(例如包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和辛醇)、甘油、聚乙二醇和基于有机磷酸酯的溶剂。包括油、溶剂及其他的纳米乳剂组分在下文进一步详细描述。在一些实施方案中，乳剂进一步包含表面活性剂。本发明并不限于具体表面活性剂。预期了多种表面活性剂，包括但不限于非离子和离子型表面活性剂(例如TRITONX-100 ；TffEEN 20 ；禾口 TYL0XAP0L)。在某些实施方案中，乳剂进一步包括阳离子含卤素化合物。本发明并不限于具体阳离子含卤素化合物。预期了多种阳离子含卤素化合物，包括但不限于十六烷基卤化吡啶 、十六烷基三甲基卤化铵、十六烷基二甲基乙基卤化铵、十六烷基二甲基苄基卤化铵、十六烷基三丁基卤化If、十二烷基三甲基卤化铵和十四烷基三甲基卤化铵。本发明并不限于具体卤化物。预期了多种卤化物，包括但不限于选自氯化物、氟化物、溴化物和碘化物的卤化物。在再进一步的实施方案中，乳剂进一步包括含季铵化合物。本发明并不限于具体含季铵化合物。预期了多种含季铵化合物，包括但不限于烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基二甲基苄基氯化铵、η-烷基二甲基苄基氯化铵、η-烷基二甲基乙基苄基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵和η-烷基二甲基苄基氯化铵。在一些实施方案中，本发明提供了包含免疫原性组合物的疫苗，所述免疫原性组合物包含通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒(例如RSV)。在一些实施方案中，本发明提供了包含疫苗的试剂盒，所述疫苗包含乳剂和包含通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒(例如RSV)的免疫原性组合物，所述乳剂包含水相、油相和溶剂。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含关于使用试剂盒用于针对副粘病毒科的病毒(例如RSV)给受试者接种疫苗的说明书。在再进一步的实施方案中，本发明提供了诱导针对副粘病毒科的一种或多种病毒(例如RSV)的免疫的方法，其包括提供包含水相、油相和溶剂的乳剂；和副粘病毒科的一种或多种病毒(例如RSV)；组合乳剂与副粘病毒科的一种或多种病毒(例如RSV)，以生成疫苗组合物；和给受试者施用疫苗组合物。在一些实施方案中，施用包含使疫苗组合物与受试者的粘膜表面接触。例如，在一些实施方案中，施用包含鼻内施用。在一些优选实施方案中，施用在这样的条件下发生，从而使得受试者生成针对副粘病毒科的一种或多种病毒(例如RSV)的免疫(例如经由生成针对一种或多种免疫原的体液免疫应答)。本发明并不受生成的免疫应答的性质的限制(例如包含通过纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒(例如RSV)的免疫原性组合物的施用后。实际上，多种免疫应答可以在施用组合物的受试者中生成且测量，所述组合物包含纳米乳剂和通过本发明的纳米乳剂灭活的副粘病毒科的病毒(例如RSV)，包括但不限于免疫系统的细胞(例如B细胞、T细胞、树突细胞、抗原呈递细胞(APCs)、巨噬细胞、天然杀伤(NK)细胞等)的活化、增殖或分化；标记和细胞因子的上调或下调的表达；IgA、IgM和/或IgG滴度的刺激；脾大(例如增加的脾细胞构成)；各种器官中的增生、混合细胞浸润、和/或免疫系统的其他应答(例如细胞的)，其可以就本领域已知的免疫刺激而言进行评估。在一些实施方案中，施用包含使受试者的粘膜表面与组合物接触。本发明并不受接触的粘膜表面的限制。在一些优选实施方案中，粘膜表面包含鼻粘膜。在一些实施方案中，粘膜表面包含阴道粘膜。在一些实施方案中，施用包含肠胃外施用。本发明并不受选择用于施用本发明的组合物的途径的限制。在一些实施方案中，诱导免疫应答在受试者中诱导针对副粘病毒科的一种或多种病毒(例如RSV)的免疫。在一些实施方案中，免疫包含全身免疫。在一些实施方案中，免疫包含粘膜免疫。在一些实施方案中，免疫应答包含受试者中增加的IFN-Y和/或IL-17表达。在一些实施方案中，免疫应答包含全身IgG应答。在一些实施方案中，免疫应答包含粘膜IgA应答。在一些实施方案中，组合物包含15%纳米乳剂溶液。然而，本发明并不限于纳米乳剂的这个量(例如百分比)。例如，在一些实施方案中，组合物包含小于10%纳米乳剂(例如9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)。在一些实施方案中，组合物包含超过10%纳米乳剂(例如12%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%或更多)。在一些实施方案中，本发明的组合物包含本文描述的任何纳米乳剂。在一些实施方案中，纳米乳剂包含W2(i5EC。在一些优选实施方案中，纳米乳剂包含W8(i5EC。在一些实施方案中，纳米乳剂是X8P。在一些实施方案中，免疫保护受试者免于展示出通过副粘病毒科的病毒(例如RSV)引起的疾病的病征或症状。在一些实施方案中，免疫保护受试者免于由后续暴露于副粘病毒科的活病毒(例如RSV)的攻击。在一些实施方案中，组合物进一步包含佐剂。本发明并不受利用的佐剂类型的限制。在一些实施方案中，佐剂是CpG寡核苷酸。在一些实施方案中，佐剂是单磷酰脂质A。在本发明中有用的许多其他佐剂在本文中描述。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，免疫保护受试者免于展示出由副粘病毒科的病毒(例如RSV)的感染的病征或症状。在一些实施方案中，免疫减少在一次或多次暴露于副粘病毒科的病毒(例如RSV)时的感染危险。附图描述下述附图构成本说明书的部分并且包括以进一步证实本发明的某些方面和实施方案。通过参考与本文呈现的具体实施方案的描述组合的这些附图中的一个或多个，本发明可以得到更好理解。图1显示通过纳米乳剂杀死呼吸道合胞病毒(RSV)。图2显示在用纳米乳剂灭活的RSV (NE-RSV)免疫接种后RSV特异性抗体的诱导。图3显示给受试者施用NE-RSV导致增强的RSV特异性⑶8 T细胞应答。图4显示给受试者施用NE-RSV增强来自RSV攻击的小鼠的气道的BAL流体中的抗病毒细胞因子。图5显示用NE-RSV给小鼠接种疫苗增强在用活RSV攻击后在肺中的IL-17生产。图6显示给受试者施用NE-RSV提供改善的清除且在后续活病毒攻击时诱导保护性应答。图7显示在施用NE-RSV与对照比较的小鼠中各种基因的表达。图8显示在施用NE-RSV与对照比较的小鼠中肺组织学切片的过碘酸-希夫氏(PAS)染色。图9显示在施用NE-RSV与对照比较的小鼠中的细胞因子表达。图10显示显著的RSV特异性抗体应答在用NE-RSV接种疫苗后在小鼠中全身生成(A)和在用活病毒攻击后2天时接种疫苗的小鼠的支气管肺泡灌洗液中的总Ig。发明总体描述本发明提供了用于免疫应答刺激的方法和组合物。具体而言，本发明提供了免疫原性组合物和使用其诱导针对副粘病毒科的致病性病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的免疫应答(例如免疫(例如保护性免疫))的方法。本发明的组合物和方法尤其在临床(例如治疗和预防医学(例如接种疫苗))和研究应用中有用。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，用本发明的NE的NE处理(例如中和副粘病毒科的病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))保存病毒的重要抗原表位(例如可通过受试者的免疫系统识别)(例如同时中和和/或根除病毒的感染性潜力)，从而稳定其在乳剂的油和水界面中的疏水和亲水组分(例如从而提供受试者可以针对其产生免疫应答的一种或多种免疫原(例如稳定抗原))。在其他实施方案中，因为NE制剂通过孔穿透粘膜，所以它们可以将免疫原携带至树突细胞的粘膜下位置(例如从而起始和/或刺激免疫应答)。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，组合NE和副粘病毒科的病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))稳定病毒免疫原，且提供正确的免疫原性材料用于生成免疫应答。树突细胞贪婪地吞噬纳米乳剂(NE)油滴，并且这可以提供中和病毒免疫原的方式 (例如用纳米乳剂的副粘病毒科的病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的灭活后生成的抗原蛋白质或其肽片段)用于抗原呈递。虽然其他疫苗依赖于炎症毒素或其他免疫刺激用于佐剂活性(参见例如，Holmgren 和 Czerkinsky，Nature Med. 2005,11 ；45-53)，但当在动物和人中的研究中置于皮肤或粘膜上时，NEs未显示是炎症的。因此，尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但在一些实施方案中，本发明的包含NE的组合物(例如包含NE和副粘病毒科的一种或多种病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒))的组合物)可以充当对于免疫系统的“物理”佐剂(例如转运和/或呈递免疫原性组合物(例如副粘病毒科病毒的肽和/或抗原)。在一些实施方案中，本发明的组合物的粘膜施用生成粘膜(例如粘膜免疫的征兆(例如IgA抗体滴度的生成))以及全身免疫。细胞和体液免疫在针对多重病原体的保护中起作用，并且两者都可以由本发明的 NE制剂诱导。在一些实施方案中，给受试者施用(例如粘膜施用)本发明的组合物(例如肺炎病毒亚科病毒(例如RSV)的NE灭活)导致体液(例如特异性抗体的发展)和细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)免疫应答的诱导(例如针对肺炎病毒亚科病毒(例如RSV))。在一些实施方案中，本发明的组合物(例如NE灭活的肺炎病毒亚科病毒(例如RSV))用作疫苗(例如 RSV疫苗)。此外，在一些实施方案中，本发明的组合物(例如包含NE和副粘病毒科的病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒))的组合物)诱导(例如当施用于受试者时)全身和粘膜免疫。因此，在一些优选实施方案中，给受试者施用本发明的组合物导致针对暴露(例如致死性粘膜暴露)于副粘病毒科的病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的保护。尽管机制的理解不是实践本发明必需的，并且本发明并不限于任何具体作用机制，但粘膜施用(例如接种疫苗)提供针对病毒感染(例如在粘膜表面起始的那种)的保护。尽管迄今已证明难以刺激针对在粘膜表面侵入的病原体的分泌性IgA应答和保护(参见例如，Mestecky等人， Mucosal Immunology. 3ed edn. (Academic Press, San Diego, 2005)),但本发明提供了用于刺激针对副粘病毒科的病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的粘膜免疫(例如保护性IgA应答)的组合物和方法。定义
为了促进本发明的理解，下文定义了许多术语和短语。如本文使用的，术语“微生物”指微生物的任何物种或类型，包括但不限于细菌、病毒、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。术语微生物包含本身且自发地对于另一种生物(例如动物，包括人和植物)是致病性的那些生物，和产生对于另一种生物致病性的试剂的那些生物，虽然生物自身并非直接对于其他生物是致病性的或传染性的。如本文使用的，术语“病原体”和语法等价物指通过直接感染其他生物或通过产生在另一种生物中引起疾病的试剂(例如产生致病性毒素的细菌等)，在另一种生物(例如动物和植物)中引起疾病状况(例如感染、病理学状况、疾病等)的生物(例如生物学试剂)包括微生物。“病原体”包括但不限于病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。术语“细菌”指所有原核生物，包括在原核生物界中的所有门内的那些。预期该术语包含视为细菌的所有微生物，包括枝原体属(i^co/^asma)、衣原体属QChlamydia、、職菌属Uciiflofflj^es)、链霉菌属QStr印tomyces、和立克次氏体属(Mckettsia所有形式的细菌包括在这个定义内，包括球菌、杆菌、螺旋体、原生质球、原生质体等。如本文使用的，术语“真菌”关于真核生物使用，例如霉菌和酵母，包括双态性真菌。如本文使用的，除非本文另有说明，术语“疾病”和“病理学状况”可互换使用，以描述自对于物种或组(例如人)的成员视为正常或平均的状况的偏离，并且其在对于那个物种或组的大多数个体并非有害的条件下对于受累个体是有害的。此种偏离可以表现为与受试者或任何其器官或组织的正常状态的任何损害相关的状态、病征和/或症状(例如腹泻、 恶心、发热、疼痛、水疱、疖、疹、免疫抑制、炎症等)，这中断或改变正常功能的实现。疾病或病理状况可以由微生物(例如病原体或其他传染物(例如病毒或细菌))引起或起因于与所述微生物的接触，可以响应环境因素(例如营养不良、工业危害和/或气候)，可以响应生物的先天不足(例如遗传异常)或这些及其他因素的组合。如本文使用的，术语“宿主”或“受试者”指待通过本发明的组合物和方法治疗(例如施用)的个体。受试者包括但不限于哺乳动物(例如鼠、猿猴、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物等)，且最优选包括人。在本发明的背景中，术语“受试者”一般指将被施用或已被施用本发明的一种或多种组合物(例如用于诱导免疫应答的组合物)的个体。如本文使用的，当关于微生物(例如病原体(例如病毒))使用时，术语“灭活”和语法等价物指微生物(例如病原体(例如病毒))的杀死、消除、中和和/或感染和/或引起宿主中的病理学应答和/或疾病的能力的减少。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含纳米乳剂(NE)灭活的呼吸道合胞病毒(RSV)的组合物。因此，如本文提及的，包含“NE灭活的RSV”、“NE杀死的RSV”、NE中和的RSV”、“NE_RSV”或语法等价物的组合物指这样的组合物，当施用于受试者时，其特征在于在宿主内RSV复制的不存在或显著减少的存在(例如在一段时间内(例如在数天、数周、数月或更久的时间段内)。如本文使用的，术语“融合(fusigenic)”意指能够与微生物试剂(例如细菌、细菌孢子或病毒衣壳)的膜融合的乳剂。融合乳剂的具体例子在本文中描述。如本文使用的，术语“溶原的”指能够破裂微生物试剂(例如病毒(例如病毒包膜) 或细菌或细菌孢子)的膜的乳剂(例如纳米乳剂)。在本发明的优选实施方案中，与单独的任一试剂相比较，溶原和融合试剂在相同组合物中的存在产生增强的灭活作用。使用这种改良的抗微生物组合物的方法和组合物(例如用于诱导免疫应答(例如用作疫苗)在本文中详细描述。如本文使用的，术语“乳剂，，包括典型水包油或油包水分散体或小滴，以及可以由于疏水性力形成的其他脂质结构，当水不能混合的油相与水相混合时，所述疏水性力驱动非极性残基(例如长烃链)远离水且驱动极性首基朝向水。这些其他脂质结构包括但不限于单层、少层(paucilamellar)和多层脂质小泡、微团和层状相。类似地，如本文使用的，术语 “纳米乳剂”指包含小脂质结构的水包油分散体。例如，在优选实施方案中，纳米乳剂包含具有约0.1 - 5微米(例如直径150 +/-25 nm)的平均粒子大小的小滴的油相，尽管预期了更小和更大的粒子大小。术语“乳剂”和“纳米乳剂”在本文中经常可互换使用，以指本发明的纳米乳剂。如本文使用的，当关于纳米乳剂和活微生物使用时，术语“接触”、“接触的”、“暴露”和“暴露的”指使一种或多种纳米乳剂与微生物(例如病原体)达到接触，从而使得纳米乳剂灭活微生物或致病性试剂，如果存在的话。本发明并不受用于微生物灭活的纳米乳剂的量或类型的限制。在本发明中有用的多种纳米乳剂在本文中和其他地方描述(例如美国专利申请 20020045667 和 20040043041,以及美国专利号 6，015，832,6, 506，803,6, 635，676 和6，559，189中描述的纳米乳剂，所述文件各自为了所有目的整体引入本文作为参考)。在本发明中预期了纳米乳剂(例如足以灭活微生物(例如病毒灭活))和微生物(例如足以提供抗原组合物(例如能够诱导免疫应答的组合物))的比和量，包括但不限于本文描述的那些。术语“表面活性剂”指具有有力地偏好通过水溶剂化的极性首基和通过水并非良好溶剂化的疏水尾的任何分子。术语“阳离子型表面活性剂”指具有阳离子首基的表面活性剂。术语“阴离子型表面活性剂”指具有阴离子首基的表面活性剂。术语“亲水-亲油平衡指数”和“HLB指数”指用于关联表面活性剂分子的化学结构与其表面活性的指数。HLB指数可以通过多种经验公式进行计算，如例如由引入本文作为参考的 Meyers 描述的(参见例如，Meyers，Sar/aciafli Science and Technology, VCH Publishers Inc.，New York，第幻1_对5页(1992))。如适当时在本文中使用的，表面活性剂的 HLB 指数是在 McCutcheon 的第 1 卷 Emulsifiers and Detergents North American Edition, 1996 (引入本文作为参考)中对那种表面活性剂指定的HLB指数。HLB指数对于商业表面活性剂范围为0 -约70或更多。具有在水中的高可溶性和增溶性质的亲水表面活性剂在标度的高末端，而其为水在油中的良好增溶剂的在水中具有低可溶性的表面活性剂在标度的低末端。如本文使用的，术语“相互作用增强剂”指作用于增强乳剂与微生物(例如与细菌 (例如革兰氏阴性细菌)的细胞壁或病毒包膜的相互作用的化合物。预期的相互作用增强剂包括但不限于螯合试剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)、亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸 (EGTA)等)和某些生物学试剂(例如牛血清清蛋白(abulmin) (BSA)等)。术语“缓冲剂”或“缓冲试剂”指当添加到溶液中时，促使溶液抵抗pH中的改变的材料。术语“还原剂”和“电子供体”指对第二种材料贡献电子以还原一种或多种第二种材料的原子的氧化状态的材料。术语“单价盐”指其中金属(例如Na、K或Li)在溶液中具有净1+电荷的任何盐(即比电子多一个质子)。术语“二价盐”指其中金属(例如Mg、Ca或Sr)在溶液中具有净2+电荷的任何盐。术语“螯合剂”或“螯合试剂”指具有可用于与金属离子键合的含非孤对电子的超过一种原子的任何材料。术语“溶液”指水性或非水性混合物。
如本文使用的，术语“用于诱导免疫应答的组合物”、“免疫原性组合物，，或语法等价物指这样的组合物，一旦施用于受试者(例如1次、2次、3次或更多(例如通过数周、数月或数年分开))，其在受试者中刺激、生成和/或引发免疫应答(例如导致针对能够引起疾病的微生物(例如病原体)的总体或部分免疫)。在本发明的优选实施方案中，组合物包含纳米乳剂和免疫原。在进一步优选的实施方案中，包含纳米乳剂和免疫原的组合物包含一种或多种其他化合物或试剂，包括但不限于治疗剂、生理学可耐受的液体、凝胶、载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、水杨酸盐、类固醇、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗体、细胞因子、抗生素、粘合剂、填充剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂和/或缓冲剂。免疫应答可以是先天性(例如非特异性)免疫应答或习得性(例如获得性)免疫应答(例如减少受试者中的感染性、发病或发病开始的那种(例如通过暴露于致病性微生物引起的)或预防受试者中的感染性、发病或发病开始的那种(例如通过暴露于致病性微生物引起的))。因此，在一些优选实施方案中，包含纳米乳剂和免疫原的组合物作为疫苗施用于受试者(例如以预防或减弱疾病(例如通过给受试者提供针对疾病的总体或部分免疫或疾病病征、症状或状况的总体或部分减弱(例如抑制)。如本文使用的，术语“佐剂”指可以刺激免疫应答(例如粘膜免疫应答)的任何物质。一些佐剂可以引起免疫系统的细胞活化(例如佐剂可以引起免疫细胞产生且分泌细胞因子)。可以引起免疫系统的细胞活化的佐剂的例子包括但不限于由皂树(Q. saponaria) 的树皮纯化的皂苷，例如QS21 (由HPLC分级分离在第21个峰中洗脱的糖脂；Aquila Biopharmaceuticals, Inc.，Worcester, Mass.)；聚二(羧基苯氧基)磷腈(PCPP 聚合物； Virus Research hstitute，USA)；脂多糖例如单磷酰脂质 A (MPL ;Ribi ImmunoChem Research, Inc.，Hamilton, Mont.)、胞壁酰二肽(MDP ；Ribi)和苏氨酰胞壁酰二肽(t_MDP ； Ribi)的衍生物；0M-174(与脂质A相关的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，瑞士);和利什曼虫属(Leishmania)延伸因子(纯化的利什曼虫属蛋白质；Corixa Corporation, Seattle, Wash.)。传统佐剂是本领域众所周知的，并且包括例如磷酸铝或氢氧化物盐(“明矾”)。在一些实施方案中，本发明的组合物(例如包含纳米乳剂灭活的RSV)与一种或多种佐剂(例如以使免疫应答偏向Thl或Th2型应答)一起施用。如本文使用的，术语“有效诱导免疫应答的量”(例如用于诱导免疫应答的组合物) 指在受试者中刺激、生成和/或引发免疫应答所需的剂量水平(例如当施用于受试者时)。有效量可以在一次或多次施用(例如经由相同或不同途径)、应用或剂量中施用，并且不预期限制于具体制剂或施用途径。如本文使用的，术语“在这样的条件下，从而使得所述受试者生成免疫应答”指免疫应答(例如先天性或获得性)的任何定性或定量诱导、生成和/或刺激。如本文使用的，术语“免疫应答”指通过受试者的免疫系统的应答。例如，免疫应答包括但不限于Toll受体活化、淋巴因子(例如细胞因子(例如Thl或Th2型细胞因子)或趋化因子)表达和/或分泌、巨噬细胞活化、树突细胞活化、T细胞活化(例如⑶4+或⑶8+ T 细胞)、NK细胞活化和/或B细胞活化(例如抗体生成和/或分泌)中的可检测改变(例如增加)。免疫应答的另外例子包括免疫原(例如抗原(例如免疫原性多肽))与MHC分子的结合和诱导细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)应答，诱导针对免疫原性多肽由其衍生的抗原的B细胞应答(例如抗体产生)和/或T辅助淋巴细胞应答、和/或迟发型超敏反应(DTH)应答，免
11疫系统的细胞(例如T细胞、B细胞(例如任何发育阶段(例如浆细胞)的扩增(例如细胞群体的生长)，和抗原通过抗原呈递细胞的增加的加工和呈递。免疫应答可以针对受试者的免疫系统识别为外来的免疫原(例如来自微生物(例如病原体)的非自身抗原)，或识别为外来的自身抗原)。因此，应当理解，如本文使用的，“免疫应答”指任何类型的免疫应答，包括但不限于先天性免疫应答(例如Toll受体信号级联放大的活化)、细胞介导的免疫应答(例如由免疫系统的T细胞(例如抗原特异性T细胞)和非特异性细胞介导的应答)和体液免疫应答 (例如由B细胞介导的应答(例如经由抗体生成和分泌到血浆、淋巴和/或组织液内)。术语 “免疫应答”意欲包括受试者的免疫系统响应抗原和/或免疫原(例如对于免疫原(例如病原体)的起始应答以及作为适应性免疫应答的结果的获得性(例如记忆)应答)的能力的所有方面。如本文使用的，术语“免疫”指在暴露于能够引起疾病的微生物(例如病原体)时， 免于疾病的保护(例如预防或减弱(例如抑制)疾病的病征、症状或状况)。免疫可以是先天性的(例如在不存在先前暴露于抗原的情况下存在的非适应性(例如非获得性)免疫应答)， 和/或获得性的(例如在先前暴露于抗原后由B和T细胞介导的免疫应答(例如其显示出对于抗原增加的特异性和反应性))。如本文使用的，术语“免疫原，，指在受试者中能够弓I发免疫应答的试剂(例如微生物(例如细菌、病毒或真菌)和/或其部分或组分(例如蛋白质抗原))。在优选实施方案中， 当与本发明的纳米乳剂组合施用时，免疫原引发针对免疫原(例如微生物(例如病原体或病原体产物))的免疫。如本文使用的，术语“病原体产物”指衍生自病原体的任何组分或产物，包括但不限于多肽、肽、蛋白质、核酸、膜级分和多糖。如本文使用的，术语“增强的免疫”指相对于尚未施用组合物(例如用于诱导本发明的免疫应答的组合物)的受试者中的适应性和/或获得性免疫水平，在组合物(例如用于诱导本发明的免疫应答的组合物)施用后，在受试者中针对给定免疫原(例如微生物(例如病原体))的适应性和/或获得性免疫水平中的增加。如本文使用的，术语“纯化的”或“待纯化”指从样品或组合物中去除污染物或不需要的化合物。如本文使用的，术语“基本上纯化的”指从样品或组合物中去除约70 - 90 %、最高到100%污染物或不需要的化合物。如本文使用的，术语“施用，，指对受试者给予本发明的组合物(例如用于诱导免疫应答的组合物(例如包含纳米乳剂和免疫原的组合物))的动作。对于人体的示例性施用途径包括但不限于通过眼(眼的)、口(经口)、皮肤(经皮)、鼻(鼻的)、肺(吸入的)、口腔粘膜(口腔含化)、耳、直肠、通过注射(例如静脉内、皮下、腹膜内等)、局部等。如本文使用的，术语“共施用”指至少2种试剂(例如包含纳米乳剂和免疫原的组合物和一种或多种其他试剂-例如佐剂)或治疗对于受试者的施用。在一些实施方案中， 2种或更多试剂或治疗的共施用是并发的。在其他实施方案中，第一种试剂/治疗在第二种试剂/治疗之前施用。在一些实施方案中，共施用可以经由相同或不同施用途径。本领域技术人员理解使用的各种试剂或治疗的制剂和/或施用途径可以改变。对于共施用的合适剂量可以由本领域技术人员容易地决定。在一些实施方案中，当试剂或治疗共施用时，各自的试剂或治疗以低于对于其单独施用合适的剂量施用。因此，共施用在其中试剂或治疗的共施用降低一种或多种潜在有害的(例如毒性)试剂的必需剂量的实施方案中，和/或当 2种或更多试剂的共施用导致经由其他试剂的共施用受试者对试剂之一的有利作用的致敏时是尤其希望的。在其他实施方案中，共施用是优选的，以同时或接近同时(例如，当受试者不太可能可用于第二种、第三种或更多组合物的后续施用用于诱导免疫应答时)引发受试者中针对2种或更多不同免疫原(例如微生物(例如病原体))的免疫应答。如本文使用的，术语“局部地”指本发明的组合物(例如包含纳米乳剂和免疫原的组合物)应用于皮肤和/或粘膜细胞和组织(例如肺泡、口腔、舌、咀嚼、阴道或鼻粘膜，以及给中空器官或体腔做衬里的其他组织和细胞)的表面。在一些实施方案中，本发明的组合物以局部乳剂、可注射组合物、可摄食溶液等的形式施用。当途径是局部的时，形式可以是例如喷雾剂(例如鼻喷雾剂)、乳膏或其他粘性溶液(例如包含在聚乙二醇中的纳米乳剂和免疫原的组合物)。如本文使用的，术语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指当施用于受试者时， 基本上不产生不利反应(例如毒性、变应性或免疫反应)的组合物。如本文使用的，术语“药学可接受的载体”指任何标准药学载体，包括但不限于磷酸缓冲盐水溶液、水和各种类型的润湿剂(例如月桂基硫酸钠)、任何和所有溶剂、分散介质、包衣、月桂基硫酸钠、等渗和吸收延迟剂、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)、 聚乙二醇等。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和佐剂的例子已得到描述且是本领域已知的(参见例如，引入本文作为参考的Martin，Remington’ s Pharmaceutical Sciences，第 15 片反，Mack Publ. Co. , Easton, Pa. (1975))。如本文使用的，术语“药学可接受的盐”指在靶受试者中生理学耐受的本发明的组合物的任何盐(例如通过与酸或碱反应获得的)。本发明的组合物的“盐”可以衍生自无机或有机酸和碱。酸的例子包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、 磷酸、羟基乙酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、 甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸例如草酸虽然本身不是药学可接受的，但可以用于制备在获得本发明的组合物及其药学可接受的酸加成盐中作为中间体有用的盐。碱的例子包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、 氨和式NW4+的化合物，其中W是CV4烷基等。盐的例子包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、 十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐(flucoh印tanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(palmoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其他例子包括与合适阳离子例如Na+、NH4+和NW4+ (其中W是Ch烷基)等化合的本发明的化合物的阴离子。对于治疗用途，预期本发明的化合物的盐为药学可接受的。然而， 并非药学可接受的酸和碱的盐也可以例如在药学可接受的化合物的制备或纯化中有用。对于治疗用途，预期本发明的组合物的盐为药学可接受的。然而，并非药学可接受的酸和碱的盐也可以例如在药学可接受的组合物的制备或纯化中有用。
如本文使用的，术语“处于疾病的危险中，，指倾向于经历特定疾病的受试者。这种素因可以是遗传的(例如经历疾病例如遗传病的特定遗传倾向)，或由于其他因素(例如年龄、环境条件、暴露于环境中存在的有害化合物等)。因此，不预期本发明限制于任何具体危险(例如受试者可以仅仅通过暴露于其他人和与其他人相互作用而“处于疾病的危险中”)， 也不预期本发明限制于任何具体疾病。如本文使用的，“鼻应用，，意指通过鼻应用到鼻或窦通道或两者内。应用可以例如通过应用于鼻和窦通道的滴剂、喷雾剂、雾、包衣或其混合物来完成。如本文使用的，术语“试剂盒”指用于递送材料的任何递送系统。在免疫原性试剂 (例如包含纳米乳剂和免疫原的组合物)的背景中，此种递送系统包括允许免疫原性试剂和 /或支持材料(例如关于使用材料的书面说明书等)从一个位置到另一个的贮存、转运或递送的系统。例如，试剂盒包括含有相关免疫原性试剂(例如纳米乳剂)和/或支持材料的一个或多个外壳(例如盒)。如本文使用的，术语“分割的(fragmented)试剂盒”指包含2个或更多分开容器的递送系统，所述容器各自含有总试剂盒组分的亚部分。容器可以一起或分开地递送给预期接受者。例如，第一个容器可以含有用于特定用途的包含纳米乳剂和免疫原的组合物，而第二个容器含有第二种试剂(例如抗生素或喷雾剂施用器)。实际上，包含各自含有总试剂盒组分的亚部分的2个或更多分开容器的任何递送系统包括在术语“分割的试剂盒”内。相比之下，“组合试剂盒”指含有在单一容器中(例如在容纳所需组分中的每一种的单个盒中)对于特定用途所需的免疫原性试剂的所有组分的递送系统。术语“试剂盒” 包括分割的和组合试剂盒。发明详述
呼吸道合胞病毒(RSV)感染2岁前的几乎所有婴儿并且是全世界儿童中的细支气管炎的主因。由CDC估计在美国每年最高达125，000例儿科住院治疗是由于RSV，每年费用超过$300，000，000 (I)0尽管RSV特异性适应性免疫应答的生成，但RSV不赋予保护性免疫并且一生自始至终的复发性感染是常见的(2，3)。虽然RSV在其气道小且容易堵塞的非常幼小的婴儿中是尤其有害的，但RSV也广泛变得公认为是移植接受者、具有慢性阻塞性肺病(COPD)的患者、老年人、以及具有慢性肺病尤其是哮喘的其他患者中的重要病原体。近期数据暗示来自1990-2000的关于所有年龄组合的死亡率已是约30/100，000，其中在美国每年平均死亡率超过17，000 (4，5)。这些数目可能是严重低估的，因为它仍未在成年人中以一致方式彻底检查。因此，RSV不仅在年轻和年老的人中引起严重恶化的肺病，还与显著量的死亡率直接相关。尽管抗RSV抗体是可获得的且看起来减轻严重疾病，但它们仅在预防地(propholactically)给予时执行，并且存在很少其他选项用于对抗易感患者群体中的 RSV 感染(6-10)。在二十世纪六十年代晚期，用明矾沉淀的福尔马林灭活的RSV疫苗制剂给儿童接种疫苗的尝试失败，且在用活RSV再感染时引起严重恶化的疾病。临床表现看起来是增强的Th2疾病、粘液产生和嗜曙红细胞增多的结果，这在未接种疫苗的儿童中未观察到。这些相同症状可以在严重感染的婴儿亚群中出现。几项流行病学研究将严重RSV应答与甚至在感染已消除后数年的反应过度气道疾病的以后发展联系起来(3)。Sigurs等人发现与健康对照相比较，由于RSV细支气管炎住院治疗的婴儿在1、3和7岁时处于发展哮喘和喘鸣发作的更高危险中(11-13)。RSV也已与哮喘恶化相关且可以引起病的延长发作(14)。一项有趣研究暗示因果联系，这是因为用 RSV免疫球蛋白治疗具有严重RSV疾病的婴儿显著减少其发展儿童期哮喘和肺功能障碍的以后危险(15)。可以使儿童和成人倾向于慢性疾病的RSV疾病的一个临床相关特征是由于改变的免疫应答，不能获得保护性免疫。更近期的研究已暗示具有受损的肺功能的患者群体(尤其是患者)也处于由于RSV感染的严重并发症的危险中，所述严重并发症几乎与和流感感染相关的那些一样流行(16-20)。这些并发症可以通过即使在急性疾病已消除后RSV 也具有在肺中持续长时间段的能力的可能性混合。这已假定与较不有效地清除病毒的改变的免疫环境的发展相关。因此，可以用于儿童和成人中的有效疫苗具有用于跨越群体广泛应用的潜力，且可以提供免于慢性肺病的起始和恶化的显著保护。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于特异性免疫应答刺激的方法和组合物。特别地，本发明提供了免疫原性纳米乳剂组合物和使用其诱导针对副粘病毒科的致病性病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的免疫应答(例如免疫(例如保护性免疫))的方法。本发明的组合物和方法尤其在临床(例如治疗和预防医学(例如接种疫苗))和研究应用中有用。示例性免疫原性组合物(例如疫苗组合物)和施用组合物的方法在下文更详细地描述。在一些实施方案中，本发明提供了用于诱导免疫应答的组合物，其包含纳米乳剂和一种或多种免疫原(例如灭活的病原体或病原体产物(例如灭活的病毒(例如灭活的呼吸道合胞病毒)))。本发明并不限于任何具体纳米乳剂。实际上，多种纳米乳剂在本发明中有用，包括但不限于在本文中描述的那些和在其他地方描述的那些(例如美国专利申请 20020045667 和 20040043041,以及美国专利号 6，015，832,6, 506，803,6, 635，676 和 6，559，189中描述的纳米乳剂，所述文件各自为了所有目的整体引入本文作为参考)。本发明的免疫原(例如病原体或病原体产物(例如灭活的病原体或病原体产物(例如灭活的病毒(例如灭活的呼吸道合胞病毒))))和纳米乳剂可以以任何合适量组合，且利用多种递送法递送给受试者。可以利用任何合适的药物制剂，包括但不限于本文公开的那些。合适的制剂可以使用任何合适的方法就免疫原性进行测试。例如，在一些实施方案中， 免疫原性通过定量抗体滴度和特异性T细胞应答进行研究。本发明的纳米乳剂组合物还可以在传染病状态的动物模型中进行测试。用于免疫原性的合适动物模型、病原体和测定包括但不限于下文描述的那些。在一些实施方案中，本发明提供了在本发明的开发过程中鉴定且表征的包含纳米乳剂(NE)灭活的副粘病毒科的病毒(例如RSV)的组合物的粘膜施用(例如粘膜接种疫苗) 后，在受试者中免疫(例如针对副粘病毒科的病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的免疫)的发展。如实施例1-2中所述，将NE与RSV混合，从而导致这样的制剂(例如NE杀死的RSV组合物)，其在室温稳定(例如在一些实施方案中，达超过2周、更优选超过3周、甚至更优选超过4周、且最优选超过5周)，且可以用于在受试者中诱导针对RSV的免疫应答(例如可以单独或作为佐剂使用用于诱导抗RSV免疫应答)。包含NE和RSV (例如NE杀死的RSV)的组合物对受试者的粘膜施用导致高滴度抗体应答和特异性Thl细胞免疫(参见例如，实施例1-4)。进一步地，使动物被保护免于用RSV的后续攻击(参见例如，实施例4)。此外，与明矾沉淀的福尔马林灭活的RSV疫苗制剂 (例如上文描述的)形成鲜明对比，本发明的NE灭活的RSV导致强Thl免疫(例如如通过增强的IFN- γ和IL-17表达证明的(参见例如，实施例4)应答，且不增强和/或升高与Th2 型应答相关的Th2细胞因子(例如IL-4、IL-5或IL-13)的表达。在施用后4周，施用即使单剂的包含NE杀死的RSV的组合物的小鼠也发展抗RSV IgG的血清浓度，其在施用后8周时继续增加并且在加强施用后显著升高(参见例如，实施例2-4)。因此，在一些实施方案中， 本发明提供了包含NE杀死的RSV的组合物的单次施用(例如粘膜施用)足以在受试者中诱导保护性免疫应答(例如保护性免疫(例如粘膜和全身免疫))。在一些实施方案中，对受试者的后续施用(例如初次施用后的一次或多次加强施用)提供针对受试者中的RSV的增强的免疫应答的诱导。因此，本发明证实包含NE杀死的RSV的组合物对受试者的施用提供针对 RSV感染的保护性免疫。细胞和体液免疫都可能在针对RSV的保护中起作用，并且两者由NE制剂诱导(参见例如，实施例1-4)。RSV特异性抗体滴度被视为对于人受试者和接种疫苗的动物模型中的保护性免疫估计是重要的。在本发明的实施方案的开发过程中生成的数据证明NE有效杀死RSV且生成适合于用于在受试者中诱导针对RSV的免疫应答的非传染性免疫接种组合物(例如用于用作疫苗)。在施用于受试者后，免疫原性组合物诱导特异性抗RSV血清抗体滴度，且起始重要的抗病毒细胞免疫应答(例如诱导增加的抗病毒细胞因子生产和RSV特异性CD8+细胞毒性T 细胞的发展)。本发明的免疫原性组合物还提供了在活RSV攻击时改善的病毒清除。因此， 在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供了生成合适的先天性免疫应答的能力(例如起因于暴露于以可识别形式维持于NE中的抗原，其模拟通过主动感染提供的抗原)，从而提供更合适的疫苗策略(例如与福尔马林杀死的RSV相比较)。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物(例如NE杀死的RSV)对受试者的施用 (例如粘膜施用)提供了体液(例如特异性抗体的发展)和细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞)免疫应答(例如针对RSV)的诱导。在一些优选实施方案中，本发明的组合物(例如NE杀死的 RSV)用作疫苗。抗体的生成
包含纳米乳剂(NE)灭活的副粘病毒科的病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的免疫原性组合物可以用于免疫接种动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人，以产生多克隆抗体。若需要，则肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)抗原可以与载体蛋白质缀合，所述载体蛋白质例如牛血清清蛋白、甲状腺球蛋白、匙孔皇戚血蓝蛋白或本文描述的其他载体。 取决于宿主物种，各种佐剂可以用于增加免疫应答。此种佐剂包括但不限于弗氏佐剂、矿物凝胶(例如氢氧化铝)和表面活性物质(例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、本文描述的纳米乳剂、匙孔 血蓝蛋白和二硝基苯酚)。在人中使用的佐剂中，BCG (卡介苗)和短小棒 ^fM (Corynebacterium parvum)是；fc其有用白勺。与肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)抗原特异性结合的单克隆抗体可以使用任何技术进行制备，所述技术提供通过在培养中的连续细胞系的抗体分子产生。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术、和EBV杂交瘤技术(参见例如，Kohler等人，Nature 256,495 497，1985 ;Kozbor等人，J. Immunol. Methods 81,3142,1985 ；Cote 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 80，2026 2030，1983 ;Cole 等人，Mol. Cell. Biol. 62， 109 120,1984)。此外，可以使用为了产生“嵌合抗体”开发的技术，小鼠抗体基因与人抗体基因的剪接，以获得具有合适抗原特异性和生物学活性的分子(参见例如，Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 81，68516855，1984 ;Neuberger 等人，Nature 312,604 608,1984 ； Takeda等人，Nature 314,452 454，1985)。单克隆及其他抗体也可以是“人源化的”，以阻止当它在治疗上使用时，患者产生针对抗体的免疫应答。此种抗体可以与待直接用于治疗中的人抗体在序列中足够类似，或可能需要少数关键残基的改变。通过经由个别残基的位点定向诱变或通过嫁接整个互补性决定区替换与人序列中的那些不同的残基，在啮齿类动物抗体和人序列之间的序列差异可以降到最低。可替代地，人源化抗体可以使用重组法产生，如下文描述的。与特定抗原特异性结合的抗体可以含有部分或全部人源化的抗原结合部位，如美国专利号5，565，332中公开的。可替代地，对于单链抗体产生描述的技术可以使用本领域已知的方法进行修改， 以产生与特定抗原特异性结合的单链抗体。具有相关特异性但具有不同独特型组成的抗体可以通过链改组由随机组合免疫球蛋白文库生成(参见例如，Burton，Natl. Acad. Sci. 88,11120 23,1991)。单链抗体还可以使用DNA扩增法例如PCR进行构建，其中使用杂交瘤cDNA作为模板(参见例如,Thirion等人，1996，Eur. J. Cancer Prev. 5，507_11)。单链抗体可以是单或双特异性的，并且可以是二价或四价的。四价、双特异性单链抗体的构建例如在Coloma & Morrison, 1997,Nat. Biotechnol. 15，159-63中教导。二价、双特异性单链抗体的构建例如在 Mallender & Voss，1994，J. Biol. Chem. 269，199-206 中教导。编码单链抗体的核苷酸序列可以使用手动或自动化核苷酸合成进行构建，使用标准重组DNA法克隆到表达构建体内，并且引入细胞内以表达编码序列，如下文描述的。可替代地，单链抗体可以使用例如丝状噬菌体技术直接产生(参见例如，Verhaar等人，1995， Int. J. Cancer 61,497-501 ;Nicholls 等人，1993，J. Immunol. Meth. 165，81_91)。如文献中公开的，通过在淋巴细胞群体中诱导体内产生或通过筛选高度特异性结合试剂的免疫球蛋白文库或实验对象组，也可以产生与特定抗原特异性结合的抗体(参见例如，Orlandi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 86,3833 3837，1989 ;Winter 等人，Nature 349,293 299，1991)。嵌合抗体可以如WO 93/03151中公开的进行构建。还可以制备衍生自免疫球蛋白且是多价和多特异性的结合蛋白，例如WO 94/13804中描述的“双抗体”。抗体可以通过本领域众所周知的方法进行纯化。例如，抗体可以通过经过相关抗原与之结合的柱进行亲和纯化。结合的抗体随后可以使用具有高盐浓度的缓冲剂从柱中洗脱。纳米乳剂
本发明的纳米乳剂疫苗组合物并不限于任何具体纳米乳剂。任何数目的合适纳米乳剂组合物都可以用于本发明的疫苗组合物中，包括但不限于Hamouda等人，J. Infect Dis.， 180:1939 (1999);Hamouda 和 Baker，J. Appl. Microbiol. ,89:397 (2000);和 Donovan 等人，Antivir. Chem. Chemother.，11:41 (2000)中公开的那些，以及表1和2以及图4和 9中显示的那些。本发明的优选纳米乳剂是在杀死或灭活病原体中有效且对于动物无毒的那些。因此，优选乳剂制剂利用无毒溶剂，例如乙醇，且在更低浓度的乳剂时达到更有效的杀死。在优选实施方案中，在本发明的方法中利用的纳米乳剂是稳定的，并且即使在长贮存时间段(例如一年或多年)后也不分解。另外，优选乳剂即使暴露于高温和冷冻后也维持稳定性。如果它们待在极端条件中(例如在战场上)应用，那么这是尤其有用的。在一些实施方案中，利用表1中描述的纳米乳剂之一。在一些优选实施方案中，乳剂包含(i )水相；(ii )油相；和至少一种另外化合物。 在本发明的一些实施方案中，这些另外化合物混合到组合物的水或油相内。在其他实施方案中，这些另外化合物混合到先前乳化的油和水相的组合物内。在这些实施方案的某些中， 一种或多种另外化合物紧接在其使用前混合到现有乳剂组合物内。在其他实施方案中，一种或多种另外化合物在组合物立即使用前混合到现有乳剂组合物内。适合于在本发明的组合物中使用的另外化合物包括但不限于一种或多种有机物和更具体而言基于有机磷酸酯的溶剂、表面活性剂和去污剂、含季铵化合物、阳离子含卤素化合物、萌发增强剂、相互作用增强剂和药学可接受的化合物。预期用于本发明的组合物中的各种化合物的一些示例性实施方案在下文呈现。


本发明提供了用于免疫应答刺激的方法和组合物。具体而言，本发明提供了免疫原性纳米乳剂组合物和使用其诱导针对副粘病毒科的致病性病毒(例如副粘病毒亚科病毒(例如副粘病毒属、腮腺炎病毒属和/或麻疹病毒属)和/或肺炎病毒亚科病毒(例如呼吸道合胞病毒)))的免疫应答(例如免疫(例如保护性免疫))的方法。本发明的组合物和方法尤其在临床(例如治疗和预防医学(例如接种疫苗))和研究应用中有用。