一种用于治疗慢性呼吸系统疾病的药物及其制备方法 [0001][0003]牛蒡(Arctium lappa L.)系菊科牛蒡属植物,在日本和欧洲常作为蔬菜食用。而在我国为传统药用植物，其果实牛蒡子、叶和根入药。牛蒡子的主要活性成分为木质素类成分牛蒡苷及牛蒡苷元，其中牛蒡苷体内代谢后也转化为牛蒡苷元。中医理论认为牛蒡子味辛苦，性寒，归肺、胃经，具有疏散风热、宣肺祛痰、利咽透疹、解毒消肿等功效。常用于风热感冒、咳嗽多痰和麻疹等症。牛蒡苷具有抗炎和解热作用，可显著减轻二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，减少大鼠肉芽组织增生，以及明显降低大肠杆菌内毒素诱导的发热家兔的体温(Chan YS 等.Inflammopharmacology, 2011,19: 245-254; Lee S 等.J Inflamm,2011，8: 16)，因此常配伍用于清热解毒的中药中，例如桑菊银翘散(中国专利，申请号:201010101794.2)，精制银翘解毒片(中国专利，申请号=200910244827.6)。中国专利(申请号:200510019353.7 ； 200710014283.5 ；200810243539.4)分别报道了含有牛蒡苷或牛蒡苷元药物的制备方法，以及在抗炎、抗内毒素以及抗病毒等方面的用途。[0004]牛蒡子作为降血糖药物的记载已有悠久历史，《本草纲目》也将其列入治疗“消渴病”的中药。而其主要药效成分的降糖研究已有报道(徐朝晖等.中草药，2005，36(7): 1043-1045 ;贺学林等.浙江中医杂志，2003，2: 88-90)。中国专利(申请号:200510025834.9 ；200310105686.2 ；200410097292.1 ；200810208246.2)也分别报道了牛蒡苷提取物、牛蒡苷及其苷元在制备治疗糖尿病及其并发症药物中的应用。此外，中国专利(申请号:201210344701.8 ；201110102607.7 ；201110102614.7)分别公开了含白芍苷和牛蒡苷的药物组合物及口服给药可以协同治疗糖尿病，以及含有牛蒡苷元与罗格列酮或吡格列酮的药物组合用于治疗糖尿病及其并发症的报道。[0005]牛蒡在民间常用于治疗肿瘤，因此相关研究和报道也较多，牛蒡苷元对多种化学致癌物质诱导的乳腺癌、结肠直肠癌、皮肤癌、肺癌、肝癌等均有较好的疗效(张兴德等.中国现代中药.2012，14 (12): 12-17)。研究发现牛蒡苷元能有效地抑制癌细胞中热休克蛋白的表达，从而有助于在癌症的高温疗法中杀死癌细胞(Ishihara等.Cell StressChaperones, 2006, 11 (2): 154-161) 0Gu Y等和Awale S等分别发现牛蒡苷兀首先通过抑制细胞能量代谢诱导肿瘤细胞凋亡(Biochem Pharmacol, 2012, 84: 468-476; CancerRes, 2006,66: 1751-1757 )。中国专利(申请号:201010285373.X，201010235824.9，201180044842.1,201010249776.9,201010253767.7,201010232504.8,201010622434.7)分别公开了牛蒡苷元和多种抗癌药物的组合，包括DNA甲基化转移酶抑制剂、嘧啶核苷酸合成抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、喜树碱类药物、亚硝脲类烷化剂、钼类药物以及紫杉醇等，发现其可以有效地提高其他抗肿瘤药物的治疗效果。[0006]此外，中国专利(申请号:200710019545.7 ；200710019604.0)还分别公开了含量在50%以上的牛蒡子总木脂素在制药领域中的用途，涉及在制备治疗或预防骨质疏松以及降脂减肥药物或保健品中的应用；牛蒡苷元在治疗血管生成性疾病以及动脉粥样硬化或心肌梗死药物中的用途(申请号:201110158477.9 ；201110172482.5)。此外还有关于含有牛蒡苷元和干扰素或全反式维甲酸的组合物，及其在制备治疗白血病方面的应用(申请号:201010285328.4 ；201010235814.5)。[0007]呼吸系统疾病是一种常见病与多发病，主要病变在气管、支气管、肺部及胸腔，病变轻者多咳嗽、胸痛、呼吸受阻，重者呼吸困难，导致缺氧甚至呼吸衰竭而致死。由于空气污染、吸烟、人口老龄化及其他因素，使国内外的慢性阻塞性肺病(C0PD)、支气管哮喘、肺癌、肺部弥散性间质纤维化以及肺部感染等疾病的发病率、死亡率有增无减。目前全球有关呼吸系统的药物约有300种，而排在前3位的治疗靶点分别是β2肾上腺素受体、糖皮质激素受体、组胺Hl受体，这类药物接近总数的一半(田苗等.现代药物与临床，2013,28(2): 114-118)。其中β2肾上腺素受体激动剂是缓解和控制哮喘症状最有效的药物，能松弛气道平滑肌，增加黏膜纤毛清除功能，减少血管渗出，调节肥大细胞和嗜酸粒细胞的介质释放，预防过敏性哮喘的发作。根据Pipeline数据库统计，已上市的β 2肾上腺素受体激动剂有45个，而且针对此靶点开发的新药数量也居首位，以吸入型长效β2受体激动剂(LABA)为主。
[0008]炎症是诱发慢性呼吸系统疾病的主要因素，糖皮质类固醇药物与β2肾上腺素受体激动剂的联合用药是目前临床主要推荐的药物组合。β2肾上腺素受体激动剂分非选择性和选择性两大类。前者包括麻黄碱(ephedrine)、肾上腺素(adrenaline)、异丙肾上腺素(Isoprenaline)等，后者又分短效和长效两种。短效β 2肾上腺素受体激动剂代表药物有沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutal ine )、氯丙那林(chlorprenal ine )、克仑特罗(clenbuterol)等。长效肾上腺素受体激动剂代表药物有沙美特罗(salmeterol)、福莫特罗(formoterol)、马布特罗(mabuterol)、班布特罗(bambuterol)等。中国专利公开的糖皮质类固醇药物的组合有很多，例如:氟替卡松、环索奈德、糠酸莫米松等(申请号:201110392037.X，201010191944.3,201010191949.6，)，但是糖皮质类固醇药物与 β2 肾上腺素受体激动剂的组合药物长期使用不仅仅存在由激素引起的副作用，而且由于糖皮质类固醇药物与β2肾上腺素受体激动剂间没有协同作用，使得其只具有明显的消炎药效。
[0009]有关β2肾上腺素受体激动剂与天然药物组合，用于治疗哮喘、支气管炎和慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病的药物组合较少，中国专利公开的有与银杏叶提取物以及甘草酸、甘草次酸的组合(申请号:200510008614.5，200610014889.4)，这些组合药物依然是以β 2肾上腺素受体信号通路来提供平喘效果，在平喘机制上没有体现创新。
[0010]


[0011]本发明的目的就是针对上述现有药物存在的单一药效的缺陷，提供了一种牛蒡苷或其体内代 谢的活性产物牛蒡苷元与临床平喘常用药物β2肾上腺素受体激动剂类药物联用的药物，该药物在具有明显消炎效果同时，还能产生牛蒡苷元与β2肾上腺素受体激动剂类药物的协同作用，从而提高β 2肾上腺素受体激动剂类药物的平喘效果，同时本发明提供了制备复合药物口服片剂和胶囊的方法。
[0012]本发明提供的用于治疗慢性呼吸系统疾病的药物包括以下组分:
牛蒡苷0.l-100mg/kg, β 2肾上腺素受体激动剂类药物0.001-10mg/kg，其余为非活性组分，包括稀释剂、抗氧化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂和矫味剂中的至少两种组分。
[0013]其中β 2肾上腺素受体激动剂类药物包括以下组分中的一种或其组合:沙丁胺醇和麻黄碱。其盐可以是:氯化物、溴化物、硫酸盐、磷酸盐、羟萘酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、4-甲氧基苯甲酸盐、2-或4-羟基苯甲酸盐、4-氯苯甲酸盐、对甲苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、抗坏血酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、戊二酸盐、丙三羧酸盐、羟基萘甲酸盐或油酸盐或其溶剂化物。
[0014]其中稀释剂包括有乳糖、葡聚糖、阿拉伯胶、甘露糖醇、葡萄糖、淀粉、糊精和微晶纤维素，抗氧化剂包括有维生素C、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠，润滑剂包括有硬脂酸镁和滑石粉，粘合剂包括有水、淀粉浆、PVP和明胶，崩解剂包括有干淀粉、羧甲基淀粉钠和海藻酸钠，矫味剂包括有甜菊糖甙、低聚麦芽糖、乳糖和食用香精。
[0015]当β2肾上腺素受体激动剂类药物仅选用麻黄碱时，麻黄碱的有效剂量为0.01-10mg/kg，牛蒡苷和麻黄碱的重量比为(0.1-10):1，当β 2肾上腺素受体激动剂类药物仅选用沙丁胺醇时，沙丁胺醇的有效剂量为0.001-lmg/kg，牛蒡苷和沙丁胺醇的重量比为(l-100):lo在这样的配比下，本发明提供的药物组合在抑制豚鼠气管平滑肌收缩方面效果极其显著，与单独给药的牛蒡苷、麻黄碱或者沙丁胺醇相比，在缓解乙酰胆碱诱导的平滑肌收缩方面均具有协同作用。
[0016]这是由于，气道平滑肌收缩在细胞内基本是个通过调节钙离子浓度而实现收缩调节的生化过程。乙酰胆碱、组胺等信号刺激平滑肌细胞，使胞内游离钙离子水平增加，最终导致了平滑肌细胞的收缩。β2肾上腺素受体激动剂类药物通过肾上腺素受体介导平滑肌细胞内环磷酸腺苷(cAMP)的产生并激活蛋白激酶A (PKA)，催化肌球蛋白轻链激酶(MLCK)磷酸化失活，导致平滑肌舒张，因此胞内钙离子浓度过高不利于平滑肌舒张。本发明提供的含有牛蒡苷和β 2肾上腺素受体激动剂类药物的药物组合物中，牛蒡苷及其活性成分牛蒡苷元可通过抑制质膜上4，5- 二磷酸磷脂酰肌醇(ΡΙΡ2)水解成1，4，5-三磷酸肌醇(ΙΡ3)和二酰基甘油(DAG)的过程，有效地拮抗细胞内钙水平的升高，提升了 β2肾上腺素受体激动剂的平滑肌舒张效果。(附图1)同时该药物组合可以避免目前β2肾上腺素受体激动剂与糖皮质激素组合长期使用后由激素引起的副作用的风险。
[0017]本发明提供的用于治疗慢性呼吸系统疾病药物的胶囊和复方片剂的制备步骤如下:
(1)按上述比例称取32肾上腺素受体激动剂类药物和牛蒡苷(或牛蒡苷元)粉末与剩余添加量的稀释剂、润滑剂、抗氧化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂和矫味剂中的至少两种组分混合，用流能磨对药物进行充分微粉化处理后，将载药粉末灌装至胶囊，即得复方胶囊组合物；
(2)按上述比例称取β2肾上腺素受体激动剂类药物和牛蒡苷类药物中加入剩余添加量的稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂以及矫味剂中的至少两种组分，混合，制粒，干燥后整粒压片；薄膜片用成膜材料如纤维素类、聚乙二醇类按常规包衣；制片后分装入密闭瓶或铝塑板中，即得复方片剂组合物。
[0018]本发明的优点和积极效果
本发明提供的以β2肾上腺素受体激动剂类药物和牛蒡苷为主要活性成分的药物组合物，在具有有效消炎效果的同时，可有效地拮抗细胞内钙水平的升高，从而更好地发挥β2肾上腺素受体激动剂的平滑肌舒张效果。该组合的作用机理不同于现有的β2肾上腺素受体激动剂与糖皮质激素、非留体抗炎药抗炎药物，以及毒蕈碱性受体拮抗剂的组合，具有明显的创新性。



[0019]图1是牛蒡苷(牛蒡苷元)协同β 2受体激动剂舒张气道平滑肌的原理图。
[0020]图2是实施例3中按本发明所提供的配比所得药物舒张豚鼠离体气道平滑肌的增效实验；其中，图2Α为沙丁胺醇、麻黄碱和牛蒡苷以及牛蒡苷联合沙丁胺醇、麻黄碱抑制乙酰胆碱(ACh)引起的豚鼠气管平滑肌的收缩效果；图28为加入β受体阻断剂普萘洛尔后，上述各组药物组合对豚鼠气管平滑肌收缩的抑制效果；
图3是实施例4中按本发明所提供的配比所得药物提升β 2AR-HEK 293胞内cAMP水平实验；
图4是实施例4中按本发明所提供的配比所得药物降低β 2AR-HEK 293胞内Ca2+水平实验；
图5是实施例5 中按本发明所提供的配比所得药物抗炎效果的考察；其中，图5A为人支气管上皮细胞(BEAS-2B)培养上清中IL-6的含量变化；图5B为BEAS-2B细胞培养上清中IL-8的含量变化；图5C为BEAS-2B细胞内NF- κ B表达水平的变化。
[0021]

[0022]实施例1
药物中各组分添加量如下:
硫酸沙丁胺醇2 g
牛蒡苷元50 g
淀粉150 g
淀粉浆(10%)20 g
硬脂酸镁2 g
将上述添加量的药物组分造粒的工艺为:先将硫酸沙丁胺醇、牛蒡苷元、淀粉、硬脂酸镁，过100目筛；而后称取上述配比的硫酸沙丁胺醇、牛蒡苷元和淀粉搅拌混合均匀，加入淀粉浆，按常规湿法制粒，干燥后整粒，加入硬脂酸镁混合均匀，压片，即可，制得片剂1000片，每片含硫酸沙丁胺醇2 mg，牛蒡苷元50 mg。
[0023]实施例2
药物中各组分添加量如下:
盐酸麻黄碱20 g
牛蒡苷80 g微晶纤维素130 g
鹿糖55 g
硬脂酸镁15 g
浓度为65%乙醇20g
将上述添加量的药物组分制胶囊的工艺为:先将盐酸麻黄碱、牛蒡苷、微晶纤维素、蔗糖，过100目筛；而后称取上述配比的的盐酸麻黄碱、牛蒡苷、微晶纤维素、蔗糖，加入混合机中混合均匀，加入浓度65%乙醇制软材；软材过20目筛制粒，50-60° C鼓风干燥；20目筛整粒，加入硬脂酸镁，混合均匀灌装至胶囊，即可，灌装1000粒胶囊，每粒0.3克，每粒含盐酸麻黄碱20 mg,牛蒡苷80 mg ο
[0024]实施例3、豚鼠离体平滑肌的协同平喘实验
取Hartley豚鼠，体重约220_280g，雌雄各半(购自于北京军事医学科学院实验动物中心，动物饲养于23-26 ° C且12 h自动循环熄灯的标准动物房中，自由饮水和饮食)。麻醉后剥离气管，将气管剪成条段(4 mmX8 mm)，并固定于Krebs-Henseleit缓冲液中(124mmol /T, NaCl, 5 mmol/L KCl, 1.3 mmol/L MgSO4, 2.5 mmol/L CaCl2, 25 mmol/L NaHCO3,0.6mmol/L NaH2PO4,10 mmol/L 葡萄糖)，37。C，保持通入 5% C02_95% O2 混合气体，加载 Ig负荷，每隔30 min更换新鲜的Krebs-Henseleit缓冲液。待平滑肌稳定后，累积加入10倍梯度稀释的乙酰胆碱(Ach) ΙΟ,-Κ^πιοΙ/Ι，记录各浓度的收缩效应值，以最大收缩值为100%作为空白对照。经Krebs-Henseleit缓冲液反复冲洗，待肌张力恢复至基线后，再分别加入10_8 mol/L沙丁胺醇、10_5 mol/L麻黄碱及10_5 mol/L牛蒡子苷等待测药物，预孵育IOmin后，再次累积加入系列稀释的乙酰胆碱，记录各浓度收缩效应值，并计算平滑肌收缩曲线，分别用EC50来表示收缩效果，结果见图2。
[0025]如图2A中所示，沙丁胺醇和麻黄碱均可以明显抑制乙酰胆碱(ACh)引起的豚鼠气管平滑肌的收缩，牛蒡苷也同样具有抑制乙酰胆碱气管平滑肌收缩的效果，以空白组乙酰胆碱刺激平滑肌收缩曲线的最大收缩为100%计算，沙丁胺醇的最大收缩为46.4 %，麻黄碱为18.8 %，牛蒡子苷为16.6 %，而当将上述计量的沙丁胺醇和牛蒡子苷，以及麻黄碱和牛蒡苷联合使用时，抗平滑肌收缩的效果显著提高，最大收缩值可以分别恢复到84.2 %和54.1%。
[0026]此外，如图2B所示，当在上述试验中对应加入β受体阻断剂10_8 mol/L普萘洛尔后，可以有效阻断沙丁胺醇和麻黄碱的舒张效果(/7〈0.01)，但对牛蒡苷的作用效果不大(/7>0.05)。同样，沙丁胺醇和牛蒡苷联合使用的收缩降低为19.7% ;麻黄碱和牛蒡苷的收缩降低为17.3 %，与单独使用牛蒡子苷元效果16.9%相当。结果提示我们，沙丁胺醇和麻黄碱与牛蒡苷存在着不同的平喘机制，牛蒡苷可以增强β2肾上腺素受体激动剂的效果，从而表现出显著的协同平喘效果。
[0027]实施例4、细胞水平的协同增效的机理研究
取表达β 2肾上腺素受体的人肾胚细胞株(β 2AR-HEK293)于96孔板中，用DMEM完全培养基(含有10% FBS和1%双抗)，在37 ° C，5 % CO2的CO2培养箱中培养，待细胞融合至50-70%时用于后续实验。检测β 2AR-HEK293胞内cAMP水平和游离Ca2+水平分别采用Promega公司的试剂盒，按照说明书进行。具体如下:1)检测β 2AR_HEK293胞内cAMP水平:用Lipofectamine 2000转染试剂将荧光素酶报告基因质粒pGL4.29和内参报告基因质粒Renilla pRL-TK共转染入细胞内。每孔加入pGL4.29 100 ng和Renilla 16 ng,转染24 h后可用于胞内cAMP的荧光分析。2)检测β 2AR-HEK293胞内Ca2+浓度的变化:用Lipofectamine 2000转染试剂将荧光素酶报告基因质粒pGL4.30和内参报告基因质粒Renilla pRL-TK共转染入细胞内。每孔加入pGL4.30 100 ng和Renilla 10 ng，转染24h 后，加入 ionomycin (ICT3 mol/L)和 PMA (12-myristate 13-acetate, I mg/mL)孵育 6小时造模后用于Ca2+浓度分析。
[0028]在上述转染了荧光素酶报告基因pGL4.29和pGL4.30质粒的细胞中，分别加入10_8mol/L沙丁胺醇，10_5 mol/L麻黄碱，10_5 mol/L牛蒡苷元，以及上述计量的沙丁胺醇与牛蒡苷兀，或麻黄碱与牛蒡苷兀的混合药物，将培养板置于5% CO2培养箱中继续培养3 h,弃去细胞培养液，用PBS清洗2次，加入细胞裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液并加入荧光底物，米用Turner Biosystems公司的Modulus Iuminometer突光分析仪,对胞内cAMP水平以及胞内Ca2+浓度进行检测。结果数值以标准平均误差(SEM)表示，组间比较采用单因素方差分析，单独两两对比采用?检验，以0.05为显著性水平，即/7 < 0.05被认为有显著性差异，结果见图3和图4。[0029]如图3所示，β 2肾上腺素受体激动剂的沙丁胺醇和麻黄碱均可以胞内的cAMP水平升高，且这种效果可以被02肾上腺素受体选择性的拮抗剂ICI 118551 (10_5mol/L)所阻断。而牛蒡苷元单独使用不能引起胞内cAMP水平的变化。但与沙丁胺醇和麻黄碱协同使用后，均可以使@2肾上腺素受体激动剂的活性明显升高&〈0.01)。且这种效果也可以被ICI 118551所阻断，证明牛蒡苷协同β2肾上腺素受体激动剂的舒张作用必须依赖于β2肾上腺素受体才能发挥其效果。糖皮质激素激素的地塞米松则本身不具备升高胞内cAMP水平的作用，与β2肾上腺素受体激动剂联合使用也不会产生协同平喘作用。
[0030]如图4所示，沙丁胺醇和麻黄碱均对胞内的Ca2+水平影响不大，而牛蒡苷元却可以显著降低胞内游离Ca2+浓度，与阳性对照药物钙通道拮抗剂尼莫地平(10_5 mol/L)显示了类似的效果&〈0.01)。当牛蒡苷元(10_5 mol/L)与上述计量的沙丁胺醇(10_8 mol/L)和麻黄碱(10_5mol/L)联合使用后，同样可以降低胞内钙的水平&〈0.01)。证明牛蒡苷元不同于β 2肾上腺素受体激动剂的作用机制，其作用机制是通过减低胞内游离Ca2+浓度，更好地抑制平滑肌的收缩效应，从而达到平喘效果的。
[0031]实施例5、人肺上皮细胞BEAS-2B水平的抗炎实验
人支气管上皮细胞(BEAS-2B)购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)。BEAS-2B细胞用DMEM/F12完全培养基培养(含有10% FBS和1%双抗)，在5 % CO2的CO2培养箱中培养，待细胞融合至50-70%时，用于以下实验。实验设置空白对照组、模型组、阳性药地塞米松组(10_6 mol/L)、沙丁胺醇组(10_8 mol/L)、牛蒡苷组(10_5 mol/L)、牛蒡苷元组(10_5 mol/L)、以及牛蒡苷元(10_5 mol/L)和沙丁胺醇(10_8 mol/L)联合用药组，共七组(/? = 5)，孵育4小时后，加入10 ng/mL TNF-α造模12 h，收集细胞上清液、细胞裂解液用ELISA法(上海信然生物有限公司)检测IL-6和IL-8的含量变化，采用荧光素酶活性检测法用于NF- κ B的检测。结果如图5A，B所示，TNF- α刺激BEAS-2B后，IL-6和IL-8的表达明显增高，地塞米松具有明显的抗炎作用(/7 < 0.01)，而沙丁胺醇不具有抗炎活性。牛蒡苷、牛蒡苷元以及牛蒡苷与安与沙丁胺醇联合组能够显著降低上述炎症因子的表达 b〈 0.05 或/7〈 0.01)。[0032]向培养好的BEAS-2B细胞中，用转染试剂PEI将NF-κ B荧光素酶报告基因质粒PGL4.32和内参荧光素酶报告基因质粒Renilla共转染入细胞内，分别加入pGL4.32 100ng/孔和Renilla 10 ng /孔，转染试剂PEI(1 mg/ml)与pGL4.32的比例为8:1，转染24h后可用于后续实验。上述同样计量的药物预孵育4 h后，加入TNF-a (10 ng/mL)刺激BEAS-2B 6 h，收集细胞后裂解，用双荧光素酶报告基因系统检测NF-κ B的含量变化。弃去细胞培养液后，用PBS清洗2次，加入细胞裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液并加入荧光底物，米用Turner Biosystems公司的Modulus Iuminometer突光分析仪，对胞内NF-κ B水平进行检测。结果数值以标准平均误差(SEM)表示，组间比较采用单因素方差分析，单独两两对比采用?检验，以0.05为显著性水平，即/7 < 0.05被认为有显著性差异。
[0033]结果如图5C所示，TNF- α刺激BEAS-2B后可显著激活NF- κ B的表达，与模型相比地塞米松能明显地抑制NF-κ B的激活ip < 0.01)，同样牛蒡苷、牛蒡苷元也具有同样的抑制效果(P〈 0.05或/7〈 0.01)。结果提示，沙丁胺醇不具有抗炎活性，因此也不能增强牛蒡苷元通过抑制NF- κ B 的激活进而能有效地抑制炎症因子表达的效果。