专利名称：衣霉素在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用的制作方法脑中风又称脑卒中或脑血管意外，是一组以脑部缺血或出血性损伤症状为主要临 床表现的疾病，主要分为出血性脑中风(脑出血及蛛网膜下腔出血)和缺血性脑中风(脑梗 塞及脑血栓形成)二大类，其中以缺血性脑中风最为常见。该疾病发病急，病死率高，是世 界上最主要的致死性疾病之一。据统计，我国每年新发完全性脑中风12(Γ150万人，死亡 80-100万人，存活者中约75%致残，5年复发率高达41 % ；而美国每年亦有50万人发病，其 中15万人死亡。脑中风的死亡率和年龄呈正相关，目前我国已进入老年化社会，其发病率 及对国人的影响将有进一步增加的趋势，因此研究与开发治疗脑中风尤其是缺血性脑中风 的有效药物是医药界的一个重点课题。目前对缺血性脑中风尚缺乏有效治疗措施，临床上常见的治疗方法有药物治疗、 导管插入、颈动脉内膜切除等，其中药物治疗是最常见的治疗方法，作用方式包括溶栓、扩 血管或抗血小板聚集等。上述治疗药物的共同特点是针对性强、作用环节明确、但疗效单 一，难以克服缺血性脑中风引起神经细胞损伤的多种病理学效应，且有不同程度的毒副作 用。如溶栓药物很难通过血脑屏障进入受损脑组织发挥作用，因而疗效不肯定，且有引起再 灌注损伤及出血的副作用；扩血管药物可使正常脑部位血管扩张，造成病变区血液流向正 常脑组织，产生所谓“窃血”现象。因此寻找具有新的作用机理，且疗效明确、毒副作用小的 有效药物是一项亟待探索的工作。衣霉素(tunicamycin，TM)是放线菌 Sti^ptomyces Iysosuperficus 产生的核苷 酸抗生素，其化学结构如图1所示，广泛用于研究不同生物系统内蛋白糖基化合成过程。衣 霉素在医药领域的用途及作用机理如下衣霉素可以抑制具有被膜(envelope，含糖蛋白)的病毒繁殖，作用机理是抑制合 成糖蛋白糖链必需的拟脂(多萜醇，dolichol)的中间产物生成(见作者Leavitt R, Schlesinger S, Kornfeld S.撰写白勺论文〈〈Tunicamycin inhibits glycosylation and multiplication of Sindbis and vesicular stomatitis viruses)), J Virol 杂志，1977 年，21卷，第1期，第375-385页)。衣霉素还可以抑制合成细菌细胞壁的肽聚糖或胞壁酸 必需的拟脂(细菌萜醇，多聚萜醇)的中间产物形成，所以显示对革兰氏阳性菌的抗菌 性。最近，利用对这种抑制拟脂中间产物形成的作用，衣霉素广泛用于探索糖类复合物的 合成及其功能。比如衣霉素可以抑制高尔基体中N-乙酰葡糖胺酶功能，进而抑制蛋白糖 基化途径，使糖链加工受阻，形成脱糖蛋白，阻碍内质网内新生蛋白质糖基化修饰，诱导未 折叠蛋白反应和内质网应激(ER stress)，因此衣霉素是目前常用的内质网应激诱导剂(见 ## Urano F, Wang X, Bertolotti A, Zhang Y, Chung P, Harding HP, Ron D. M 写的论文((Coupling of stress in the ER to activation of JNK protein kinasesby transmembrane protein kinase IREl)), Science 杂志，2000 年 287 卷，第 5453 期， 第664-666页)。研究者已将衣霉素应用于胃癌、前列腺癌、乳腺癌细胞，观察到衣霉素诱 导癌细胞发生凋亡，有可能为癌症的治疗提供新的途径，但是这些研究尚未在临床获得应 用(见作者 Shiraishi T, Yoshida T, Nakata S, Horinaka M, Wakada M, Mizutani Y, Miki T, Sakai T. IH写白勺论文〈〈Tunicamycin enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis in human prostate cancer cells)) Cancer Res 杂志，2005 年，65 卷，第 14 期，第 6364-6370 页；见作者 Jiang CC, Chen LH, Gillespie S, Kiejda ΚΑ, Mhaidat N, Wang YF, Thorne R, Zhang XD, Hersey P. IH写白勺论文((Tunicamycin sensitizes human melanoma cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis by up—regulation of TRAIL-R2 via the unfolded protein response》Cancer Res 杂志，2007 年，67 卷，第 12 期，第 5880-5888 页)。总之，在现有技术中没有涉及衣霉素在制备治疗缺血性脑中风药物中应用的报导。
本发明的目的在于提供衣霉素的新用途，即在制药中的新应用。为达到上述目的，本发明涉及衣霉素在制备治疗人类缺血性脑中风药物中的应用。过去的一些研究发现，衣霉素诱导内质网应激，可能引发内质网依赖细胞凋 亡途径，导致细胞凋亡，引起神经细胞损伤(见作者Lin TY, Wang SM, Fu丽，Chen YH, Yin HS.撰写的论文《Toxicity of tunicamycin to cultured brain neurons: ultrastructure of the degenerating neurons)), J Cell Biochem 杂志，1999 年 74 卷， 第 4 期，第 638-647 页；以及作者 Reimertz C, K5gel D, Rami A, Chittenden Τ, Prehn JH.撰写的论文〈〈Gene expression during ER stress-induced apoptosis in neurons: induction of the BH3-only protein Bbc3/PUMA and activation of the mitochondrial apoptosis pathway)), J Cell Biol 杂志 2003 年，162 卷，第 4 期，第 587-597 页)。但是，本 发明人研究发现内质网应激是双刃剑，过度的内质网应激引发细胞凋亡，但适宜的内质网 应激则上调热休克蛋白(HSR)，诱导自噬，产生细胞保护作用。实验证明应用小剂量的衣霉 素侧脑室给药时，可以减少局灶性脑缺血大鼠的脑梗塞面积，产生脑保护作用。经理论研究 其作用机理是由于小剂量的衣霉素诱导适宜的内质网应激，激活自噬，从而诱导药理性预 适应(Pharmacology preconditioning)，对缺血性脑中风产生治疗作用。由此可见，采用小 剂量的衣霉素可显著减小脑梗塞面积，对缺血性脑中风具有一定的防治作用。使用方法及用量对于治疗人类缺血性脑中风来说，衣霉素的给药方式可以是 静脉注射或静脉滴注，剂量为30-30(^g/kg/d (是指每天，每千克人体重量的给药剂量为 30-300微克)。总之，衣霉素能显著的减少缺血造成的神经元损伤，在动物实验中减少脑梗 塞面积40%以上，是一般抗中风药物所达不到的效果，而且当衣霉素的给药剂量较小时，对 人体来说相对安全。为此，本研究结果可望在将来为临床治疗缺血性脑中风提供一种新的 药物。附图1为本发明衣霉素的化学结构附图2为永久局灶性大脑中动脉栓塞脑缺血(pMCAO)大鼠注射衣霉素后经红四氮唑 (TTC)染色的脑切片对比附图3为图2的脑梗塞面积定量分析对比图。附图4为PC12细胞缺糖缺氧(OGD)模型应用衣霉素后经MTT法测定活细胞数的 对比图。
衣霉素是放线菌Sti^ptomyces lysosuperficus产生的核苷酸抗生素，英文名称为 Tunicamycin，化学结构如图1所示，图中n=8，9，10，11表示亚甲基的数量为8、9、10或 11，CAS号11089-65-9 (又称CAS登录号，是某种物质的唯一的数字识别号码)，分子式 C3tlH46N4O16，衣霉素可购自美国Sigma公司，货号为T7765。本发明涉及衣霉素在制备治疗人类缺血性脑中风药物中的应用。药物的形式可以 是静脉注射剂或静脉滴注剂，也可以是口服的片剂、胶囊胶或散剂，还可以是肌肉注射剂， 皮下注射剂、脑室注射剂或鞘内注射剂等。使用时全身的用药剂量控制在30-30(^g/kg/d (是指每天，每千克人体重量的给药剂量为30-300微克)，局部的用药剂量控制在0. 2-2微 克/人/天(局部是指脑室注射或鞘内注射)。另外在临床应用中衣霉素还可以和治疗缺 血性脑中风有效的药物如雷帕霉素，氯化锂，前列腺素E1，前列腺素Al等联合用药，因为氯 化锂和雷帕霉素对缺血性脑中风有治疗作用，而且作用机理与诱导自噬有关；而前列腺素 E1，前列腺素Al既有扩血管作用，也可以诱导热休克蛋白，在作用机理方面和衣霉素有协 同作用。疗程可以根据病人的实际情况来制定。衣霉素在给药剂量较小时对缺血性脑中风产生治疗作用，经理论研究其作用机理 如下
1.自噬
自噬是真核细胞广泛存在的降解/再循环系统，自噬是一把双刃剑一方面过度的自 噬可诱导自噬性细胞死亡，并与凋亡信号存在交互作用；另一方面自噬作为自体修复的重 要过程，适度激活可能在受损细胞帮助清除受损的细胞器和异常蛋白、防止蛋白聚集，从而 对细胞损伤起保护作用。目前一些研究表明自噬对脑缺血损伤具有保护作用。Carloni S 等人发现新生儿缺氧缺血(HI)后，在海马和大脑皮层，与自噬相关的蛋白——Beclinl的表 达在短时间内明显升高(代表自噬上调)，而自噬抑制剂显著降低Beclinl的表达，并加快细 胞坏死，相反，自噬诱导剂雷帕霉素能够增加Beclinl表达，减少细胞坏死，并降低脑损伤。 提示自噬通路的激活在脑损伤早期阶段是一个潜在的保护机制。我们实验室的研究结果 也发现应用自噬诱导剂雷帕霉素在永久性脑缺血前M小时给药，可以显著减少脑梗塞面 积，减轻行为功能障碍和脑水肿，提示自噬激活对神经元具有保护作用。2.内质网应激内质网(endoplasmic reticulum, ER)是真核细胞的重要细胞器，基本生理功能包括 钙离子(Ca2+)浓度调节和生物大分子的合成加工等。内质网应激(ER stress)是由于葡萄 糖/营养素缺乏、蛋白质糖基化抑制、二硫键形成障碍、蛋白质转运异常、钙离子(Ca2+)耗 竭等原因，使细胞内质网生理功能紊乱的一种病理过程，其结果是内质网腔内蛋白不能正 确折叠而被大量滞留，导致未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)，从而激 发内质网与高尔基体、细胞核之间信号传递，抑制蛋白质合成并启动内质网应激相关蛋白 表达，直接影响应激细胞的转归，如修复、损伤或凋亡。已知内质网应激是自噬的潜在诱 导因素，内质网内存在蛋白降解系统(ERAD)以清除未折叠/错误折叠蛋白质，蛋白降解系 统(ERAD)既可由泛素-蛋白酶体(ERAD I )介导，也与自噬相关(ERAD II )。而最近研究 也发现，在酵母细胞中，内质网应激能够刺激前自噬体结构的装配、形成和转运到囊泡的过 程，提示内质网应激可以诱导自噬。3.本发明作用机理
小剂量的衣霉素诱导适宜的内质网应激，激活自噬，从而诱导药理性预适应 (Pharmacology preconditioning),对缺血性脑中风产生治疗作用。下面分别提供动物实验、细胞实验以及毒副作用的有关情况 一.动物实验
1.实验方法
取健康、雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠，体重^0_300g，清洁级。该大鼠由苏州大 学医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号XCYK(苏)2002-2009,实验动物使用 许可证号SYXK(苏)2002-0037。将大鼠随机分成三组，分别为模型组(pMCAO)、第一治疗 组和第二治疗组。模型组进行永久性局灶性脑缺血模型(pMCAO)。第一治疗组大鼠按衣霉 素12pmol/每只剂量侧脑室给药(pmol表示皮摩尔)，第二治疗组大鼠按衣霉素1. 2pmol/ 每只剂量侧脑室给药。第一治疗组和第二治疗组大鼠给药5min后行局灶性脑缺血模型 (pMCAO)，缺血M小时后断头取脑进行脑梗塞面积测定(TTC)染色，观察脑梗塞面积，并且 与模型组(pMCAO)进行对比，从而得到结果。2.大鼠侧脑室注药
将三组大鼠分别用4%浓度的水合氯醛，以350mg/kg剂量腹腔注射麻醉，然后固定在 立体定位仪上，前囟高于后囟，按前囟后1. 5mm，侧开1. 5mm，深度4. Omm的坐标，用5μ 1微 量进样器注射。其中，第一治疗组大鼠按衣霉素12pmol/每只剂量给药，第二治疗组大鼠按 衣霉素1.2pmol/每只剂量给药，模型组(pMCAO)大鼠按第一治疗组剂量给予生理盐水。为 检查侧脑室注射部位的准确性，另取一批大鼠，同法注入5μ 1蓝墨水，切开侧脑室检查注 射部位，注射准确率为100%。3.永久局灶性大脑中动脉栓塞脑缺血模型(pMCAO)的建立
对三组大鼠采用线栓法分别建立永久局灶性大脑中动脉栓塞脑缺血模型(PMCA0)。建 模方法如下
将大鼠背位固定，颈正中切口，分离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动 脉。颈总动脉近心端结扎，远心端用动脉夹阻断血流，在此之间剪一小口，将一端加热成圆 珠状、直径<0. 3mm的尼龙线(4-0)插入，去动脉夹，将尼龙线缓缓推入至前脑动脉(自颈内 外动脉分叉处算起约20mm)，再向回拉2mm至大脑前动脉起始端(长约17mm)，结扎固定尼龙线，缝合皮肤。手术过程中大鼠体温保持37°C。4.脑梗塞面积测定
大鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，用大鼠脑模冠状切4刀分为5片脑片，每片 厚1. 5mm。脑片用红四氮唑染色，染色液成分为1. 5ml 4%浓度的红四氮唑、0. Iml Imol/ L浓度的磷酸二氢钾(KH2PO4)、3. 4ml生理盐水，共5 ml，在37°C避光条件下染色30min，正 常组织呈红色，梗塞组织为白色。最后用Sigma Pro5. O软件计算脑梗塞面积所占百分比。5.数据统计与分析
数据均以均数士标准差(Mean士SD)表示，统计分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0. 05为统计学差异有显著性。6.和结论
图2为永久局灶性大脑中动脉栓塞脑缺血(pMCAO)大鼠注射衣霉素后经红四氮唑 (TTC)染色的脑切片对比图。图中pMCAO表示行永久局灶性大脑中动脉栓塞脑缺血(pMCAO) 的模型组大鼠的脑切片；1. 2pmol表示注射衣霉素1. 2pmol 5分钟后行永久局灶性大脑中 动脉栓塞脑缺血(pMCAO)的第二治疗组大鼠的脑切片；12pmol表示注射衣霉素12pmol 5分 钟后行永久局灶性大脑中动脉栓塞脑缺血(pMCAO)的第一治疗组大鼠的脑切片。脑切片中 正常组织呈红色，梗塞组织为白色。结果使用衣霉素12pmol的第一治疗组大鼠和使用衣霉素1. 2pmol的第二治疗组 大鼠与模型组大鼠相比较，能显著减小永久局灶性大脑中动脉栓塞脑缺血大鼠的脑梗塞面 积。图3为图2的脑梗塞面积定量分析对比图。其中数据以均数士标准差(Mean士SD) 表示，统计分析采用单因素方差分析(one-way AN0VA)，P<0. 05为统计学差异有显著性，η = 6，“*”表示与模型组相比Ρ<0. 05, “#”表示与模型组相比Ρ<0. 01。结论衣霉素可显著减小脑梗塞面积，对缺血性脑中风具有一定的防治作用。二.细胞实验
1. PC12细胞缺糖缺氧(OGD)实验
PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤神经细胞株)用含10%小牛血清的DMEM液培养， 接种于96孔培养板中，在37°C、95 %02和5%0)2条件下培养至细胞铺满单层。实验分为四 组第一组为正常对照组，持续通以95 %02和5 %C02的混合气；第二组为缺糖缺氧(OGD) 模型组神经细胞移去正常培养液，换入不含葡萄糖的HBSS溶液(140 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 12 mM MgSO4，5 mM NaHCO3 , 1. 7 mM CaCl2 , 0. 4 mM KH2PO4，10 mM H印es)，放入 专用的缺氧罐，通以95 %队和5 %C02的混合气，缺糖缺氧Μι;第三和第四组为治疗组，其 中，第三治疗组PC12细胞用衣霉素0. 12μΜ (0. 12微摩尔/升)预处理24h后，细胞再经上 述OGD模型他。第四治疗组PC12细胞用衣霉素0. 24μΜ预处理24h后，细胞再经上述OGD 模型乩。2. MTT法测定活细胞数
MTT 全称为 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide,中 文化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝。将上述四组细胞分别加入终浓度为0. 5mg/ml的MTT反应4h，吸去上清液(注意避 免吸走甲瓒结晶)，每孔加入10%酸化SDS (十二烷基硫酸钠)，待孔内颗粒完全溶解后，以酸化SDS溶液调零，用酶联免疫检测仪测定570nm处的光密度值。3.数据统计与分析
数据均以均数士标准差(Mean士SD)表示，统计分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0. 05为统计学差异有显著性。4.实验结果和结论
图4为PC12细胞缺糖缺氧(OGD)模型应用衣霉素后经MTT法测定活细胞数的对比图。 从图中可以看出，PC12细胞用衣霉素0. 12mM和0. 24mM预处理Mh后，进行0⑶模型他，以 MTT检测细胞存活率。数据以均数士标准差(Mean士SD)表示，统计分析采用单因素方差分 析(one-way ANOVA)，P<0. 05为统计学差异有显著性，η = 10，“#”与con组相比Ρ<0. 01， “#，，与OGD模型组相比Ρ<0· 05。结果在PC12细胞OGD模型，衣霉素0. 24mM能够增加PC12细胞缺糖缺氧的存活率。三.毒副作用
衣霉素具有一定毒性，其应用在大鼠口服的半数致死量(LD50)为6. 25mg/kg，但是在 本发明动物实验和细胞实验中所用剂量非常小，其中，动物实验1. 2-12pmol (即1 一 IOng) 侧脑室注射约相当于30 - 300mg/kg全身给药，约为LD50的1/200-1/20。如果衣霉素采 用局部给药(是指脑室注射或鞘内注射)，1 - IOng/鼠相当于3. 3-33 ng/kg，约为LD50的 1/200000-1/2000000。因此，可以认为衣霉素治疗缺血性脑中风的剂量符合药物临床应用 的规范，相对安全。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。


本发明涉及医药技术领域，目的在于提供衣霉素的新用途，即其在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。动物试验中，注射衣霉素后，大鼠的脑梗塞面积减少40%以上。本发明的作用机理是小剂量的衣霉素诱导适宜的内质网应激，激活自噬，从而诱导药理性预适应，显著减少脑缺血造成的神经元损伤，且毒副作用小。