针对人PrPc的单克隆抗体及其应用的制作方法[0002]结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，是全球位居第三的致死性肿瘤。在西方发达国家结直肠癌发病率仅次于肺癌居于第二位，在我国结直肠癌的发病率和死亡率也呈现出上升趋势，已由80年代的第六位上升至第四位。[0003]肿瘤的靶向治疗是近些年发展起来的治疗癌症的新方法，它很大程度上避免了传统癌症疗法如手术治疗、化疗和放疗所带来的肿瘤细胞扩散和严重毒副作用的产生。而针对肿瘤细胞表面抗原而进行的单克隆抗体治疗是肿瘤靶向治疗的主要方式，表现出了良好的肿瘤治疗效果。[0004]细胞型朊蛋白(cellular pr1n protein, PrPc),是一种广泛表达于真核生物细胞表面的糖蛋白，一共有253个氨基酸，在C末端有一个GPI结合位点，用于锚定在细胞外膜上，在181和197位有两个天门冬氨酸残基糖基化位点。在哺乳动物体内，PrPc主要表达于神经系统，在淋巴细胞、胃上皮细胞、肾脏心脏、和肌肉等非神经组织中也有表达。有报道表明，PrPc与肿瘤发生及抗药性有关，其在结直肠癌、前列腺癌、胃癌等多种癌症组织中高表达，本发明人的前期工作也表明CD44与PrPc共表达的细胞具有肿瘤干细胞的特性。此外，有报道表明PrPc对结直肠癌干细胞的肝转移也起到重要作用，因此，针对PrPc进行以单克隆抗体为基础的靶向性治疗研究，有望为癌症的治疗提供新的方案。
[0005]本发明首先涉及一种特异性结合人细胞型朊蛋白(cellular pr1nprotein, PrPc)的单克隆抗体Ab_5。[0006]所述的Ab-5抗体的轻链可变区(VL)氨基酸结构如SEQ ID N0.1所示，重链可变区(VH)的氨基酸结构如SEQ ID N0.2所示，恒定区为鼠源恒定区。[0007]SEQ ID N0.1.:
[0008]METDTLLLWVLLLWVPGSTCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK-NGLMLHQLYPSSHHPVLD
[0009]SEQ ID N0.2.:
[0010]MECSW VILFLLSGTGGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAKPGRTYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGGSRP
[0011]本发明还涉及所述的Ab-5抗体的编码核苷酸序列。所述的ab-5抗体的轻链编码序列优选为SEQ ID N0.3、所述的Ab-5抗体的重链编码序列优选为SEQ ID N0.4
[0012]SEQ ID N0.3:[0013]CACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTTCTAGACGC
[0014]SEQ ID N0.4:
[0015]CACCATGGAATGCAGCTGGGTCATCCTCTTTCTCTTGTCAGGAACTGGAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAACTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTACTACATGAAGTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGATACTTTCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAAACCTGGGCGGACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGGTTCTAGACCT
[0016]本发明还进一步涉及在所述Ab-5抗体的Fab片段基础上对抗体进行人源化改进或全人化改进的抗PrPc抗体。
[0017]本发明还涉及所述的ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因在制备检测PrPc蛋白的检测或诊断试剂中的应用。
[0018]本发明还涉及以所述的Ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因为主要成分的PrPc蛋白的检测试剂盒。 [0019]本发明还涉及所述的Ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因在制备药物中的应用，所述的药物为抗肿瘤药物或抑制肿瘤转移的药物，所述的肿瘤为优选实体瘤，最优选为结直肠癌、前列腺癌、胃癌及乳腺癌。
[0020]本发明还涉及以所述的Ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因为活性成分的抗肿瘤药物，所述的肿瘤为优选实体瘤，最优选为结直肠癌、前列腺癌、胃癌及乳腺癌。
[0021]本发明还涉及以所述的Ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因作为现有抗肿瘤药物增效辅助制剂的应用，所述的肿瘤为优选实体瘤，最优选为结直肠癌、前列腺癌、胃癌及乳腺癌，所述的抗肿瘤药物优选为cetuximab。
[0022]本发明还涉及以所述的Ab-5抗体、人源化改进型/全人化改进型Ab-5抗体及其活性片段、编码基因与现有抗肿瘤药物组成的抗肿瘤复方制剂，所述的肿瘤为优选实体瘤，最优选为结直肠癌、前列腺癌、胃癌及乳腺癌，所述的抗肿瘤药物优选为cetuximab。



[0023]图1:电泳及抗体Western Blot法检测His标签PrPc蛋白的凝胶图:A.电泳检测图谱，B.经抗体12F10做western blot实验鉴定。
[0024]图2:Ab_3、5、25及12F10与PrPc的抗原结合表位:A.细胞免疫荧光法检测各个抗体与9种PrPc的结合；B.免疫印迹法检测各个抗体与9种PrPc的结合；C.9种PrPc突变体的示意图；D.抗体结合区域定位示意图。[0025]图3:不同细胞系中PrPc的表达情况:A.P6C细胞；B.SW480细胞；C.HCTl 16细胞。
[0026]图4:抗体对不同细胞活力的影响:Α.处理时间24h ；B.处理时间48h。
[0027]图5:不同抗体与抗原的亲和及解离动力学曲线:A.Ab_3抗体；B.Ab_5抗体；C.Ab-25 抗体；D.12F10 抗体。
[0028]图6:Ab-5抗体在小鼠体内的代谢曲线:A.抗体浓度随注射浓度变化标准曲线；
B.抗体浓度随时间变化曲线。
[0029]图7:Ab-5抗体对荷瘤小鼠的治疗效果:A.活体肿瘤细胞荧光成像；B.原位肿瘤体积；C.不同脏器的解剖图及肿瘤荧光信号定位；D.肿瘤细胞转移指数。
[0030]图8:Ab-5抗体能有效抑制裸鼠皮下肿瘤的生长:A~B.治疗组与对照组P6C原位肿瘤体积；C.治疗组与对照组小鼠体重；D~E.治疗组与对照组SW480原位肿瘤体积；F.治疗组与对照组小鼠体重。.[0031]图9:Ab_5与cetuximab联合治疗能更好地抑制原位肿瘤的生长及肿瘤转移能力:A.单独或联合治疗的小鼠腹部肿瘤荧光与脏器荧光；B.单独或联合治疗的小鼠肿瘤体积；
C.单独或联合治疗的小鼠肿瘤转移；D.肿瘤细胞分型。
[0032]图10:转录因子Twistl在Ab-5处理的肿瘤细胞中表达量降低:A.多个肿瘤细胞系中转录因子Twistl的表 达水平；B.P6C细胞PrPc蛋白与Twistl表达量正相关；C.P6C细胞中Twistl及间叶细胞及上皮细胞状态因子随Ab-5抗体处理的变化；D.SW480细胞中Twistl及间叶细胞及上皮细胞状态因子随Ab-5抗体处理的变化。

[0033]以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。
[0034]细胞系及主要试剂:
[0035]本发明所使用的细胞系包括:P6C(该细胞系由本实验室自行自结肠癌病人肿瘤组织中分离得到)、SW480 (ATCC? CCL-228?)、HCTl 16 (ATCC* CCL-247?)、MCF7 (ATCC?HTB-22?)、MDA-MB-231 (ATCC*- HTB-26?)、HeLa, Human normal blood cell
[0036]本发明所使用的主要试剂及其来源为:
[0037]Actin 单克隆抗体(A-5441)、a-tubulin 单克隆抗体、Triton-XlOO、PAGE 凝胶配制试剂、Tetracycline、Pipes、Digitonin 购自 Sigma ；
[0038]Calreticulin 单克隆抗体购自 Abcam ；
[0039]Myc单克隆抗体、Cytochrome C单克隆抗体(65981A)、Tim23单克隆抗体(611222)、GM130 单克隆抗体(610822)、FITC、Cy5、Cy3 购自 BD PharMingen ；
[0040]Cnyc 单克隆抗体(SC-40)购自 SantaCruz ；
[0041]Western blotting 用醋酸纤维素膜、Sucrose、Hepes 购自 GibcolBRL
[0042]Coomassie Blue G250, R250、NP-40、Tween20> Proteinase K、DMSO 购自 Merck
[0043]West Pico Chemiluminescent substrate、Disuccinimidyl suberate (DSS)购自Pierce
[0044]X-OMAT BT Scientific Film 购自 Kodak
[0045]PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerases II购自 Stratagene[0046]限制性内切酶购自B1labs
[0047]dNTP、Pyrobest DNA Polymerases 购自 Takara
[0048]Lipofectemin2000>OPT1-MEM> MitotrackerRedCMXROS 购自 Invitrogen
[0049]FBS (Fetal bovine serum)购自 Hyclone
[0050]其他试剂若无特别说明，均为国产分析纯。
[0051]实施例1.His标签PrPc蛋白的表达与纯化
[0052]一、His标签PrPc原核表达质粒的构建
[0053]l.pET_30a(+)载体的酶切回收
[0054]酶切位点为BamH I和Xho I，双酶切
[0055]酶切产物经I %琼脂糖凝胶电泳,并回收。
[0056]2.PrPc 全长基因的获取，酶切回收
[0057]PCR引物序列:
[0058]SEQ ID N0.5:正义链:5，-GGATCCATGGCGAACCTTGGCTG-3，
[0059]SEQ ID N0.6:反义链:5’ -CTCGAGTCCCACTATCAGGAAGA-3，
[0060]PrPc cDNA 全长序列:SEQ ID N0.7:
[0061 ] ATGGCGAACCTTGGCTGCTGGATGCTGGTTCTCTTTGTGGCCACATGGAGTGACCTGGGCCTCTGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACACTGGGGGCAGCCGATACCCGGGGCAGGGCAGCCCTGGAGGCAACCGCTACCCACCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCCCATGGTGGTGGCTGGGGACAGCCTCATGGTGGTGGC TGGGGTCAAGGAGGTGGCACCCACAGTCAGTGGAACAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
[0062]PrPc 氨基酸序列:SEQ ID N0.8:
[0063]MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGffGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGffGQGGGTHSQffNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0064]利用上述引物经PCR扩增，产物经BamH I和Xho I双酶切胶回收，然后用T4DNA连接酶与酶切好的pET_30a(+)载体进行连接。
[0065]3.连接产物的转化及克隆扩大培养
[0066]取ToplO感受态细胞，于冰浴中融化；取I~5 μ L的连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min ；(注意:DNA溶液体积不可超过使感受态细胞悬液10%。)；42°C热休克30s，期间不要晃动；迅速转移至冰浴2min以上；每管加入1000 μ L不含抗生素的LB液体培养基，37°C 150rpm震荡培养lh，以使细菌复苏，并表达质粒的抗性基因；4000rpm离心2min，弃上清，沉淀用100 μ L LB重悬，均匀涂布于含卡那霉素的LB固体平板上，放置通风橱中，至液体被吸收；37°C倒置过夜培养；挑选克隆至添加有卡那霉素的I~5mL LB液体培养基中进行扩大培养，等细菌摇起后，送菌液测序(也可小提后送质粒测序)。
[0067]测序结果正确:SEQ ID N0.9:
[0068]TCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCACGCTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCGAACCTTGGCTGCTGGATGCTGGTTCTCTTTGTGGCCACATGGAGTGACCTGGGCCTCTGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACACTGGGGGCAGCCGATACCCGGGGCAGGGCAGCCCTGGAGGCAACCGCTACCCACCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCCCATGGTGGTGGCTGGGGACAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGTCAAGGAGGTGGCACCCACAGTCAGTGGAACAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCAACAAGCA
[0069]PrPc基因序列及HIS标签的序列信息由下划线标注。
[0070]4.蛋白在Rosetta细菌之中的大量表达
[0071]His标签PrPc表达质粒转化Rosetta细菌；挑取含重组质粒的菌体单克隆至5mLLB (含卡那霉素SOy g/mL)中37°C 220rpm，过夜培养；按I: 100比例将过夜菌，加入到含500mL LB培养基的2000mL培养瓶中，37°C 220rpm,培养至0D600为0.4-1.0 (最好0.6)，降温至16-20°C;取菌液2~5mL，至无菌摇菌管，作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.1~0.4mM作为实验组，两组继续在16-20°C震荡培养16h ;分别取菌体lmL，离心12000g, 30s收获沉淀，用100 μ L2X蛋白loading buffer重悬,混匀，煮样1min,剩余大量菌液5000rpm离心1min,去上清,冻于_80°C待用；离心12000g, 5min,取上清作为样品，可做SDS-PAGE等分析，并用WB和R-250法鉴定目的蛋白是否表达。
[0072]5.原核表达His标签蛋白的纯化
[0073]取4中所收获的菌体超声破碎，变性条件下用镍柱法提取蛋白；收集的蛋白可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定蛋白的浓度，再取有蛋白的部分电泳检测纯度；
[0074]在Rosetta细菌之中大量表达之后，我们发现蛋白几乎只存在于沉淀中，所以采用变性条件，进行蛋白的纯化，采用的洗脱液PH为6.0。经SDS-Page电泳，凝胶用考马斯亮蓝R-250染色鉴定蛋白纯度，目标蛋白约34kD，其他位置几乎没有杂带，纯化效果良好，经抗体12F10做western blot实验鉴定蛋白的特异性，结果只有一条带,特异性良好(见图1)。
[0075]实施例2.小鼠抗人PrPc抗体的获得
[0076]1.免疫动物
[0077]将His-PrPc纯化蛋白，皮下初次免疫3只SPF级Balb/c雌性小鼠，编号为:1，2，3 ;免疫量为60 μ g蛋白/只。两周后,皮下第一次加强免疫,免疫量为30 μ g蛋白/只。再两周后，第二次加强免疫，免疫量为30μ g蛋白/只。又两周后，皮下第三次加强免疫，免疫量为30 μ g蛋白/只。再隔一周后，眼眶取血，测多抗血清效价。
[0078]2.效价检测
[0079]步骤:2 μ g/mL, 4oC包被过夜；I % BSA, 37oC封闭2h ;多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。
[0080]3.细胞融合实验
[0081]取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。
[0082]4.挑克隆
[0083]挑5X93个细胞单克隆，培养于5块96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100 μ L/ 孔 )；
[0084]5.单克隆细胞第一次筛选
[0085]用免疫原包板，对挑选的克隆米用ELISA方法,做第一次筛选。
[0086]6.单克隆细胞第二次筛选
[0087]ELISA抗原包 被抗原为免疫原及带his-tag的其它蛋白；
[0088]实验步骤及过程与第一次筛选一致，得到20株阳性杂交瘤细胞株。
[0089]7.单克隆细胞亚类鉴定
[0090]将二筛完的20株阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到16株阳性抗体(15株IgG，I 株 IgA)。
[0091]8.冻存
[0092]冻存液配制，FBS:IMDM:DMS0(体积比)=7:2:1;
[0093]每一株冻存三管，过3天后再冻存三管，冻存方法为冻存盒冻存法，_80°C过夜后，移于液氮柜中保存。
[0094]对其中抗体分泌能力较强的细胞株进行RNA提取反转录及抗体可变区PCR扩增与测序，我们获得了 ant1-PrPc mAb_3、ant1-PrPc mAb_5、ant1-PrPc mAb_25,其中 ant1-PrPcmAb-5的可变区cDNA序列如下:
[0095]PrPc Ab_5VH:SEQ ID N0.4
[0096]1-CACCATGGAATGCAGCTGGGTCATCCTCTTTCTCTTGTCAGGAACTGGAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAACTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACTACTACATGAAGTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGATACTTTCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTTGACAAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAAACCTGGGCGGACTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGGTTCTAGACCT-463
[0097]PrPc Ab_5VL:SEQ ID N0.3
[0098]1-CACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGAC AGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGG
ACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTTCTAGACGC-447
[0099]相对应的氨基酸序列如下:
[0100]PrPc Ab-5VH: SEQ ID N0.2
[0101]MECSWVILFLLSGTGGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMKWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAKPGRTYWGQGTLVTVSAAKTTAPSVYPLAPVCGGSRP
[0102]PrPc Ab-L5VL:SEQ ID N0.1
[0103]METDTLLLWVLLLWVPGSTCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK-NGLMLHQLYPSSHHPVLD
[0104]实施例3.Ab_3、5、25，12F10与PrPc抗原结合表位的确定
[0105]1.截短型PrPc表达质粒构建
[0106]Wt本实验室原来已构建好(将PrPc野生型基因全序列克隆到质粒P⑶NA4.0TO/MYC.HIS.B中构建获得)，不同的截短型表达质粒，利用上述突变引物以wt质粒为模板，经pyrobest高保真酶PCR反应，PCR产物经I %琼脂糖电泳鉴定之后，用DpnI消化，以便将原始含有甲基化的双链DNA模板除去，然后转化细菌(大肠杆菌感受态ToplO)，并测序验证，若结果正确，即可得到截短型PrPc表达质粒。测序成功后，按实验需要，可进行扩大培养，大量提取质粒，备用。
[0107]所用质粒:pCDNA4.0TO/myc.HIS.B,酶切位点:Kpn I and Xho I
[0108]WT 引物:
[0109]SEQ ID N0.10:WtPrPc F: 5 ’ -GG GGTACC ATGGCGAACCTTGGCTGC-3，
[0110]SEQ ID N0.11:WtPrPc R: 5 ’ -CCG CTCGAG CC TCCCACTATCAGGAAGATGA-3，
[0111]wt相对分子量~34k (8k tag)
[0112]2.依据PrF功能区及氨基酸序列信息设计突变体类型，设计的突变体的序列结构及截短突变引物如下:
[0113](I) PrPc-1: N-signal peptide (1-50)
[0114]Base:SEQ ID N0.12:
[0115]ATGGCGAACCTTGGCTGCTGGATGCTGGTTCTCTTTGTGGCCACATGGAGTGACCTGGGCCTCTGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGGAGGATGGAACACTGGGGGCAGCCGATACCCGGGGCAGGGCAGCCCTGGAGGCAACCGCTACCCA
[0116]AA:SEQ ID N0.13:
[0117]MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYP
[0118]截短突变引物:
[0119]SEQ ID N0.14=PrPc-1F:5，-GGCAACCGCTACCCAGGACGAGCTCAGATCTCCCGGGCGC-3，
[0120]SEQ ID N0.15:mPrPc-lR: 5’ -CTAGACTCGAGCTCCTGGGTAGCGGTTGCCTCCAGGGCTG-3’
[0121](2) PrPc-2:five octapeptide repeats - C terminal (51-253)
[0122]Base:SEQ ID N0.16:
[0123]CCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGGCAGCCCCATGGTGGTGGCTGGGGACAGCCTCATGGTGGTGGCTGGGGTCAAGGAGGTGGCACCCACAGTCAG
TGGAACAAGCCGAGTAAGCCAAAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGG
GGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGT
TACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAAC
AACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTC
ACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAG
GCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATC
TTCCTGATAGTGGGA
[0124]AA: SEQ ID N0.17:
[0125]PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGffGQPHGGGffGQPHGGGffGQGGGTHSQffNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0126]截短突变引物: [0127]SEQ ID N0.18:PrPc-2F: 5，-AAGCTTGGTACCATGCCTCAGGGCGGTGGTGGCTGGGGGC-3，
[0128]SEQ ID N0.19:PrPc-2R: 5，-ACCACCGCCCTGAGGCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3，
[0129](3) PrPc-3:hydrophobic domain - C terminal (106-253)
[0130]Base: SEQ ID N0.20:
[0131 ] AAAACCAACATGAAGCACATGGCTGGTGCTGCAGCAGCTGGGGCAGTGGTGGGGGGCCTTGGCGGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACC AGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
[0132]AA:SEQ ID N0.21:
[0133]KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRP11HFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0134]截短突变引物:
[0135]SEQ ID N0.22:PrPc-3F: 5，-AAGCTTGGTACCATGAAAACCAACATGAAGCACATGGCTG-3，
[0136]SEQ ID N0.23:PrPc_3R: 5’ -CTTCATGTTGGTTTTCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3’
[0137](4) PrPc-4: β 1- C terminal (127-253)
[0138]Base: SEQ ID N0.24:
[0139]GGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGAGCAGGCCCATCATACATTTCGGCAGTGACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
[0140]AA: SEQ ID N0.25:[0141]GYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0142]截短突变引物:
[0143]SEQ ID N0.26:PrPc-4F: 5，-AAGCTTGGTACCATG GGCTACATGCTGGGAAGTGCCATGA-3，
[0144]SEQ ID N0.27:PrPc-4R: 5，-TCCCAGCATGTAGCC CATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3，
[0145](5)PrPc-5: a 1- C terminal(144-253)
[0146]Base:SEQ ID N0.28:
[0147]GACTATGAGGACCGTTACTATCGTGAAAACATGCACCGTTACCCCAACCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCAT GGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
[0148]AA: SEQ ID N0.29:
[0149]DYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0150]截短突变引物: [0151]SEQ ID N0.30:PrPc-5F: 5，-AAGCTTGGTACCATGGACTATGAGGACCGTTACTATCGTG-3，
[0152]SEQ ID N0.31:PrPc-5R: 5，-ACGGTCCTCATAGTCCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3，
[0153](6) PrPc-6: β 2 - C terminal (162-253)
[0154]Base:SEQ ID N0.32:
[0155]CAAGTGTACTACAGGCCCATGGATGAGTACAGCAACCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
[0156]AA: SEQ ID N0.33:
[0157]QVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0158]截短突变引物:
[0159]SEQ ID N0.34:PrPc-6F: 5，-AAGCTTGGTACCATGCAAGTGTACTACAGGCCCATGGATG-3，
[0160]SEQ ID N0.35:PrPc-6R:5，-CCTGTAGTACACTTGCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3，
[0161 ] (7)PrPc-7: a 2 - C terminal(173-253)
[0162]Base:SEQ ID N0.36:
[0163]CAGAACAACTTTGTGCACGACTGCGTCAATATCACAATCAAGCAGCACACGGTCACCACAACCACCAAGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
[0164]AA: SEQ ID N0.37:
[0165]QNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG[0166]截短突变引物:
[0167]SEQ ID N0.38:PrPc-7F: 5，-AAGCTTGGTACCATGCAGAACAACTTTGTGCACGACTGCG-3，
[0168]SEQ ID N0.39:PrPc-7R: 5，-CACAAAGTTGTTCTGCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3，
[0169](8)PrPc-8: a 3 - C terminal(195-253)
[0170]Base: SEQ ID N0.40:
[0171]GGGGAGAACTTCACCGAGACCGACGTTAAGATGATGGAGCGCGTGGTTGAGCAGATGTGTATCACCCAGTACGAGAGGGAATCTCAGGCCTATTACCAGAGAGGATCGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
[0172]AA: SEQ ID N0.41:
[0173]GENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0174]截短突变引物:
[0175]SEQ ID N0.42:PrPc-8F: 5，-AAGCTTGGTACCATGGGGGAGAACTTCACCGAGACCGACG-3 ’
[0176]SEQ ID N0.43:PrPc-8R:5，-GGTGAAGTTCTCCCCCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3，
[0177](9) PrPc- 9: C-ancre peptide (231-253)
[0178]Base: SEQ ID N0.44:
[0179]AGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCACCTGTGATCCTCCTGATCTCTTTCCTCATCTTCCTGATAGTGGGA
[0180]AA: SEQ ID N0.45:
[0181]SMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
[0182]截短突变引物:
[0183]SEQ ID N0.46:
[0184]PrPc-9F:5，-AAGCTTGGTACCATGAGCATGGTCCTCTTCTCCTCTCCAC-3，
[0185]SEQ ID N0.47:
[0186]PrPc-9R:5，-GAAGAGGACCATGCTCATGGTACCAAGCTTAACTAGCCAG-3，
[0187]如上所述，我们构建了 9种PrPc突变体(图2C)，利用脂质体法转染Hela细胞，经细胞免疫荧光法及免疫印迹法验证了各Ab-3、5、25及商业化抗体12F10抗体与PrPc蛋白突变体之间的相互作用关系，并根据实验结果，得出各抗体与PrPc蛋白相互作用的表位。两种抗体与PrPc抗原结合表位位置相同，与PrPc突变体的结合都止于突变体四(图2A和B)，而不与突变体五及以后的突变体结合，说明它们的结合位点位于β I α I区域(图2D)，此区域AA位点是从127到161位，共35个氨基酸，其序列结构为:
[0188]SEQ ID N0.48:GYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQV。
[0189]实施例4.PrPc抗体对PrPc阳性结直肠癌细胞系有明显抑制迁移的能力
[0190]用已验证过的PrPc抗体Ab-3作为一抗鉴定不同结直肠癌细胞系(P6C、SW480与HCTl 16)及乳腺癌细胞系(MCF7)(前述细胞的培养基为含10% FBS的HDMEM)PrPc的表达情况，经流式细胞仪分析而知这几种细胞系，均有不同程度的表达率，P6C、SW480与HCT116分别为53.6%、24.6%及66.8% (图3)，因此这三种细胞系可以用于PrPc抗体与肿瘤治疗关系的研究中，而MCF7可作为阴性对照。
[0191]利用细胞迁移transwell技术测定PrPc阳性细胞经抗体处理后迁移能力的变化。Transwell计数法具体步骤为:消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗2遍,用无血清培养基重悬。调整细胞密度至IX 106，取细胞悬液100 μ I(IXlOs)加入不同浓度PrPe抗体,混匀后加入24孔板配套的8μπι孔径Transwell小室中；下层用含10% FBS及不同浓度PrPe抗体的培养基，600 μ L/孔，常规培养24h后，固定细胞，R-250染色，显微镜下观察，拍照，并计数，统计穿过小孔的细胞数。
[0192]所用抗体浓度为10μ g/mL，处理时间为24小时，结果发现，跟IgG对照组比较，在光学显微镜下可以看到，所有加PrPc抗体的实验组，细胞迁移能力都受到了明显的抑制。在同一视野下计数穿过transwell小室隔膜的细胞数平均数,统计抗体对于细胞迁移的抑制率，其中，对于细胞迁移抑制效果最佳的Ab-5抗体的抑制率结果见表1。
[0193]表1.Ab-5抗体对于PrPc阳性结直肠癌细胞的迁移抑制影响
[0194]