专利名称：鸡传染性法氏囊病特异性转移因子的制备方法鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种主要侵害雏鸡的急性、高度接触性、免疫抑制性疾病。以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征。从而引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果。发病率高，几乎达100 %，死亡率低，一般为5 % 15 %，是目前养禽业最重要的疾病之一。雏鸡群突然大批发病，2 3天内可波及60% 70%的鸡，发病后3 4天死亡达到高峰，7 8天后死亡停止。病初精神沉郁，采食量减少，饮水增多，有些自啄肛门，排白色水样稀粪，重者脱水， 卧地不起，极度虚弱、最后死亡。耐过雏鸡贫血消瘦，生长缓慢。剖检可见法氏囊发生特征性病变，法氏囊呈黄色胶胨样水肿、质硬、粘膜上覆盖有奶油色纤维素性渗出物。有时法氏囊粘膜严重发炎，出血，坏死，萎缩。另外，病死鸡表现脱水，腿和胸部肌肉常有出血，颜色暗红。肾肿胀，肾小管和输尿管充满白色尿酸盐。脾脏及腺胃和肌胃交界处粘膜出血。一方面是由于该病病毒主要侵害鸡的免疫器官，使机体自身免疫机能下降，导致患病鸡对多种病原体的易感性增加，致使鸡只死亡率、淘汰率上升，影响增重。另一方面是由于免疫抑制使接种了多种有效疫苗的鸡只免疫应答反应下降或无免疫应答。然而，目前在治疗方面除了注射鸡传染性法氏囊病高免卵黄抗体(以下简称卵黄抗体)外，几乎没有更为有效地特异疗法。兽用细胞因子类产品具有作用剂量小、生物活性高、作用迅速、疗效确实等优点， 因此该类产品具有广阔的市场前景。但目前开发研制技术尚未成熟，此类产品开发与研制正处于初始阶段，能在兽医临床大量应用的则更少。鸡传染性法氏囊病转移因子溶液是一类细胞因子制剂，辅以少量增效剂、稳定剂等研制而成。本品生物活性高，具有广谱增强免疫力、提高疫苗免疫效果、缓解疾病临床症状等作用。现将本品对雏鸡细胞免疫增强作用临床情况汇报如下。
为了解决以上治疗鸡传染性法氏囊病的药物单一和药效不理想的问题，本发明提供了一种鸡传染性法氏囊病特异性转移因子(以下简称鸡特异性转移因子)的制备方法， 制备的鸡特异性转移因子结合卵黄抗体以提高临床疗效。在2003年山东省12个鸡场临床试验性治疗，取得了很好的效果。证明此方案能有效地控制鸡法氏囊病情并起到很好的治疗作用。本发明是通过以下措施实现的一种鸡传染性法氏囊病特异性转移因子的制备方法，包括以下步骤(1)对每羽份健康家禽采用传染性法氏囊病活疫苗B87毒株10个剂量进行免疫，每个剂量病毒含量不低于IOOOELD5ci，7天后，再用传染性法氏囊病活疫苗B38毒辣株20个剂量肌肉注射加强免疫，每个剂量病毒含量不低于2000ELD5(I，同时用传染性法氏囊病油乳剂灭活苗0. 5mL皮下注射免疫，病毒含量为107_2TCID5tlA). lmL，7天后，再使用相同剂量注射传染性法氏囊病活疫苗B38毒辣株加强一次免疫，当琼脂凝胶扩散试验方法检测血液中传染性法氏囊病抗体水平达到24以上后，剖杀动物采取新鲜脾脏、肾脏或法氏囊，组织粉碎、 勻浆后在零下20°C _30°C反复冻融8次以上，每次冻16h、融8h，一个循环共需Mh，4000rpm 离心，取上清，分子筛过滤，取相对分子质量小于5000道尔顿的组分；(2)得到的相对分子质量小于5000道尔顿的组分，浓缩至固含量为5mg/mL，每mL 中加入0. 2mg稳定剂EDTA-Na2和0. 3mg复合热保护剂，混勻后除菌，既得；所述复合热保护剂为甘露醇乳糖壳聚糖甘油甘氨酸山梨醇按重量比 2:3:2:3:1: 2混合得到。制得的鸡传染性法氏囊病特异性转移因子中多肽含量> 2. Omg/mL。鸡传染性法氏囊病特异性转移因子中还含有微量的核酸、氨基酸及维生素、微量元素。因多肽含量高，易于检测，是国家质控标准的成分。本品采用以鸡特异性转移因子为主要成分研制开发的新型生化类免疫增强剂。本品剂量小、生物活性高、能够有效提高畜禽的免疫力，同时能够提高疫苗的免疫水平、最大可能地消除免疫应激反应。而且本品为生化产品，无毒副作用、无残留，是一种高效无毒的绿色兽药。适用于防治家禽传染性法氏囊病；适用于畜禽免疫力低下，提高免疫力；适用于病毒病高发期，降低感染率及死亡率；适用于疫苗免疫效果不理想，能使疫苗免疫水平整齐、抗体高、有效抗体维持时间长；适用于应激反应，减少疫苗引起的呼吸道疾病等。用法与用量混饮、口月L点眼或喷雾。每IOmL用于1000羽家禽；家畜1000公斤。有效期4°C保存2年，-20°C冷冻保存5年。常温保存6个月。本发明的有益效果1、比化药类产品例如盐酸左旋咪唑活性高、作用迅速、剂量少、无残留；2、比中药类作用迅速、使用方便、便于运输。3、小分子物质，使用途径多，饮水、口服、点眼、滴鼻、注射等均可。日龄组别T细胞百分率(％)B细胞百分率(％)A56.167 士 4.309aA43.833 士 4.336cCB53.468 士 7.043aA47.532 士 7.112cC14C34.167 士 0.983bB65.833 士 1.386bBD35.123 士 0.967bB64.877 士 0.667cCE32.333 士 3.327cC67.667 士 4.266aAA65.333 士 6.593aA34.667 士 6.487dCB61.512±6.285bA41.488 士 6.112cC21C38.543 士 4.037cB61.457 士 5.667bBD39.586 士 4.037cB60.414 士 3.936bBE36.127 士 2.608dC64.873 士 3.448aA注本结果为重复试验时测得，试验重复为6采取的是随机区组试验的新复极检验。数字后标注字母表示显著性检验结果凡有相同字母者，差异不显著；大写字母表示 0. 01显著水平；小写字母表示0. 05显著水平。4结论与讨论4. 1本试验结果显示，两个试验组与对照组T淋巴细胞百分率差异显著(P < 0. 05)，证明鸡传染性法氏囊病特异性转移因子溶液对T细胞值具有明显的提高作用。鸡传染性法氏囊病转移因子溶液中含有生物活性的小肽，当其进入机体内能够提高免疫系统的功能，而T淋巴细胞作为免疫细胞的一种，也得到一定程度的提高，因此试验组T细胞百分率较对照组高，且差异显著。4. 2注射组和口服组T细胞比例相差不显著，证明注射和口服鸡传染性法氏囊病特异性转移因子溶液的效果相同。由于该溶液含有小肽，通过注射途径其被机体吸收的速度较快作用于机体，因此注射组会促进T细胞比例升高。小肽分子量较小(低于10000道尔顿)，能够不被胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、DNA酶和RNA酶等分解，因此当其进入体内时会能够快速被肠道吸收，进入血液循环，从而作用于免疫系统，所以口服组T细胞比例也会升高。注射与口服途径吸收利用有效成分的速度均较快，因此在临床上表现为两者促进免疫的效果相当，差异不显著，因此该免疫增强剂使用较为方便。4. 3鸡传染性法氏囊病特异性转移因子溶液具有较高生物活性，其作用机理与化学类免疫增强剂(例如盐酸左旋咪唑等)存在较大差异。鸡传染性法氏囊病转移因子溶液为动物机体内正常存在的物质，正常状态下其浓度较低，当浓度提高后，其生物活性表现相当显著，能够在较短时间内提高机体免疫应答反应的强度及速度，因此生物活性优势较传统化学类免疫增强剂很显著，是很具有发展前途的生物免疫增强剂。二、鸡传染性法氏囊病特异性转移因子对鸡传染性法氏囊病的治疗实验1材料与方法1. 1 材料1. 1. 1鸡传染性法氏囊病特异性转移因子，本研究室制备，冷冻保存。1. 1.2鸡转移因子，本研究室制备，冷冻保存。1. 1. 3鸡传染性法氏囊病卵黄抗体，购于市场，冷冻保存。1. 1. 4供试鸡的选择供试鸡分别选择自然发病第二天鸡群的商品鸡病鸡，随机选择病鸡、死鸡，解剖和实验诊断均符合法氏囊病病理变化特征的鸡群为供试鸡。分为3组， 每组均为500只，饲养管理环境条件相似。1. 2 方法1. 2. 1将鸡传染性法氏囊病特异性转移因子及鸡转移因子取出，按照5mg/mL浓度稀释，无菌分装，4°C保存备用。1. 2. 2将卵黄抗体取出，化冻后，4°C保存备用，所用卵黄抗体为北京方信动物药业有限公司销售的鸡专用卵黄抗体注射液。1. 2. 2法氏囊病诊断根据临床症状和病理剖检变化，并结合实验室诊断，可确认此病为鸡传染性法氏囊病。1. 2. 3治疗试验试验分3组，第1组为卵黄抗体与鸡传染性法氏囊病特异性转移因子体积比1 1混合，第2组为卵黄抗体+鸡转移因子组体积比1 1混合，第3组为卵黄抗体组。前2组均将两种组分混勻后，放置室温后均采用胸肌注射2mL/只。第3组将卵黄抗体放置室温后采用胸肌注射2mL/只。注射后，各组均采用相同的措施，对症下药。2 结果从试验结果可以看出，各试验组对传染性法氏囊病(IBD)有很好的治疗作用，在用药的第二天就能显效，第三天内就控制了病情，病鸡停止死亡，其中卵黄抗体+鸡传染性法氏囊病特异性转移因子组存活率达98. 4%，卵黄抗体+鸡转移因子组存活率达76. 0%， 卵黄抗体组存活率为74. 2%，差异显著(P < 0. 05)，见表2。表2对传染性法氏囊病的治疗效果 3临床扩大治疗效果根据试验结果，采用卵黄抗体+鸡特异性转移因子方案对临床暴发的鸡法氏囊病进行扩大试验，据统计治疗20153只，治疗康复19646只，治愈率达97%以上。用药后第二天就可以控制死亡，第三天就可以好转，第四天后能渐渐恢复食欲，一周后基本可以康复。4分析与讨论4. 1鸡传染性法氏囊病是一种免疫抑制性、高度接触性传染病，多年来一直困扰着养鸡业，给养鸡业带来致命性危害。雏鸡主要依靠法氏囊产生抗体，当法氏囊受到侵害时，机体产生免疫抗体的能力减退或消失，而导致免疫抑制，使幼鸡群对疫苗接种的免疫应答反应下降，患病鸡容易并发感染其它病毒病或细菌病，如鸡新城疫、马立克氏病、大肠杆菌病、沙门氏菌病和球虫病等，给养鸡业造成巨大的经济损失。所以，平时一定要加强对该病的预防和控制。4. 2根据本病致病的原因是因为损害肾脏和法氏囊，所以首要问题是要从缓解肾脏衰弱，化解、排除有形物质，疏通尿路，控制死亡着手。因为鸡传染性法氏囊病特异性转移因子对病理组织不但具有再生与修复作用，还能提高机体全方位的免疫力，所以使用该制剂后具有迅速控制病鸡死亡，病程短、恢复快等特点，充分显示出生化产品防治动物疾病的优势。4. 3鸡传染性法氏囊病特异性转移因子具有增强机体免疫作用，对法氏囊病的症状具有选择性和针对性的作用。药理学研究证明，鸡传染性法氏囊病特异性转移因子是一种免疫活性物质，能提高免疫原性能，具有增强机体网状内皮系统的吞噬功能，此外，还能提高免疫器官的重量，提高白细胞总数及淋巴细胞数，增强抗体形成能力。因此，在生产实际中有很好的推广应用价值。贮存稳定性实验产品的稳定性是保证用药安全有效的基本条件，尤其是多肽氨基酸类产品，在水中有效含量下降较快，因此稳定性试验是该课题研究的一个重要课题。影响制剂稳定性的因素，除其处方、工艺等因素外，还有温度、光、湿度等因素。因此，对该产品进行了影响因素试验、加速试验、室温长期留样考察试验。1. 1样品选择符合鸡传染性法氏囊病特异性转移因子溶液质量标准的三批样品作为稳定性的样品；对照品鸡传染性法氏囊病特异性转移因子所使用的为甘露醇乳糖 甘氨酸重量配比为2:3:1的热保护剂。1. 2贮存时间及条件1)影响因素试验A.高温高湿试验将上述样品与对照品分别置于市售包装中置温度40士2°C，相对湿度75%条件下3个月，每一个月检测一次。B.光照试验将上述样品与对照品分别放置于光照箱内，设置光照度 4500士500Lx，温度为25°C条件下10天，分别于第1天、3天、5天、10天取样检测一次。2)长期实验将上述样品与对照品分别置于市售包装中置温度25士2°C，相对湿度60%条件下8个月，分别于0、2、4、6、7、8个月取样检验一次。1. 3测定指标及方法检验项目外观；FoIin酚法测定多肽含量。1. 4、试验结果1)影响因素试验结果表3在高温高湿实验条件下贮存结果统计表
保存时间(月)样品批号外观多肽含量测定(mg/mL)01淡黄色液体，无异味2.212淡黄色液体，无异味2.223淡黄色液体，无异味2.24比较例淡黄色液体，无异味2.2211淡黄色液体，无异味2.122淡黄色液体，无异味2.133淡黄色液体，无异味2.11比较例淡黄色液体，无异味1.9221淡黄色液体，无异味2.022淡黄色液体，无异味2.033淡黄色液体，无异味2.00比较例淡黄色液体，无异味1.7331淡黄色液体，无异味1.982淡黄色液体，无异味1.973淡黄色液体，无异味1.96比较例淡黄色液体，无异味1.55表4在光照实验条件下贮存结果统计表


本发明涉及免疫调节剂技术领域一种鸡传染性法氏囊病特异性转移因子的制备方法对每羽份健康家禽采用传染性法氏囊病活疫苗B87毒株、B38毒辣株、传染性法氏囊病油乳剂灭活苗免疫，抗体水平达到24以上后，剖杀动物采取新鲜脾脏、肾脏或法氏囊，组织粉碎、匀浆、反复冻融8次以上，离心取上清，过滤得相对分子质量小于5000道尔顿的组分，加入稳定剂EDTA-Na2和复合热保护剂，除菌；复合热保护剂为甘露醇乳糖壳聚糖甘油甘氨酸山梨醇按重量比2:3:2:3:1:2混合得到。比化药类产品活性高、作用迅速、剂量少、无残留；比中药类作用迅速、使用方便、便于运输；小分子物质，使用途径多。