专利名称：含有椰子胚乳纤维的宠物食品产物的制作方法图1所示为含有干椰子肉压饼的两种饮食之间的粪便分值对比。图2所示为在犬类大肠模型中包含椰子胚乳纤维对空肠弯曲杆菌存活率的影响图；和图3所示为结肠活组织检查试样的平均廿烷类前列腺素E2产量。以下参照如下的非限制性实施例对本发明进行叙述实施例1本实施例对脱脂干燥椰子粉的制备和使用进行叙述。从当地市场购得椰子，并回收白椰肉或胚乳。将胚乳进行微细粉碎并用丙酮重复提取以除去脂肪和水。从而获得干燥脱脂椰子粉。实施例2
这一实施例对机械脱脂干椰子饼的制备进行叙述。
将从椰子中剥离的椰子胚乳进行粉碎。使用在油籽加工领域中所广泛公知的技术将粉碎过的所述物质加热至最高120℃，并通过液压机或压榨机来除去大多数油。如必要，对通过这种方法所获得的提取物进行干燥，以获得水分含量约为15％的产物。
实施例3
对作为食用纤维的椰子胚乳纤维进行评价。
原料
在这种活体外发酵体系中进行评价的原料特别适用于添加到干燥和罐装狗和猫食产品中。
表1.纤维源使用Englyst和AOAC方法(表2)对原料的总食用纤维进行分析。所述AOAC方法可见于AOAC international 1995，Total，Solubleand Insoluble dietary Fibre in Foods(食品中总的可溶和不可溶食用纤维).AOAC Official method 991 43，Official methodsof Analysis，16thEd。在本文的先前部分和在附录2中提到了Englyst方法。食用纤维分析表明，原料之间的总食用纤维量有显著差别。与Englyst分析相对比，通过AOAC分析一般得出较高的总食用纤维百分比。Englyst技术使用酶-化学方法来测量非淀粉多糖(NSP)-植物细胞壁的主要结构组分，其覆盖了更传统的食用纤维定义。AOAC技术使用酶与测重法相结合来测量纤维，其包含了木质素和一些抗性(resistant)淀粉，导致较高的总食用纤维量。
表2.通过AOAC和Englyst方法分析原料的总食用纤维(TDF)
由于干椰子肉压饼的食用纤维含量(Englyst)低于40％，进一步进行分析来确定这种纤维源的其余的最相近组分(表3)。非纤维组分的含量主要是蛋白质(20.8％)。干椰子肉压饼的蛋白质和游离糖组分可人工地提供给发酵方法的终端产物，因为它们可能不到达体内的大肠。但是，这些纤维源大量营养元素的消化取决于它们可接近小肠中的寄主肠淀粉酶和蛋白酶的能力。干椰子肉压饼的相近营养物呈较少量存在，因而纤维源以其“自然状态”计来考虑。
表3.原料的相近组分、游离糖和淀粉分析方法
采用的简单的手段来表征纤维在活体外的发酵。在以下文献中报导了类似的技术，所述文献是Br?bech Mortensen P.，Hove，H.，RyeClausen，M.和Holkug，K.(1991)在人的粪便批次培养物中发酵生成短链脂肪酸和乳酸盐(Fermentation to short-chain fatty acidsand lactate in human faecal batch cultures).Scand.J.Gastroenterol.26，1285-1294，Tigemeyer，E.C.，Bourquin，L.D.，Fahey，G.C.和Garleb，K.A.(1991)人的粪便细菌活体外发酵各种纤维的能力(Fermentability of various fibre sources byhuman faecal bacteria in vitro).Am.J.Clin.Nutri.53，1418-1428，Sunvold，G.D.，Fahey，G.C.，Merchen，N.R.和Reinhart G.A.(1995)通过狗和猫的粪便接种体体外发酵所选纤维底物饮食组成对有机底物的消失和短链脂肪酸的产生的影响(In vitrofermentation of selected fibrous substrates by dog and catfaecal inoculumInfluence of diet composition on substrateorganic matter disappearance and short-chain fatty acidproduction).J.Anim.Sci.73，1110-1122和Edwards，C.A.，Gibson，G.，Champ，M.，Jensen，B-B.，Mathers，J.C.，Nagengast，F.，Rumney，C.和Quehl，A.(1996)通过人的粪便细菌对淀粉进行定量的体外方法(In vitro method for quantification of thefermentation of starch by human faecal bacteria).J.Sci.Food Agric.71，.209-217。包括在这里所使用的那一种在内的这些体系可用作体外试验来查看粪便发酵结果。然而，这些试验不是专一性的，而且尤其不能由于在任何一种动物粪便的微生物群落中的内在变化而绝对地来进行限定。
纤维试样制备(1天)
·以0.7％(w/v)的浓度呈干椰子肉压饼来提供纤维底物。称量0.231g(±0.05g)的干椰子肉压饼加入三个60ml的玻璃血清瓶(Jencons)中，并准确记录重量。添加30ml的发酵介质(表4)，用原棉塞封住瓶口，并覆盖金属箔。
制备无纤维源的六瓶作为对照。
·在含有跳蚤(flea)的锥形烧瓶中制备200ml pH为7.4的10mM磷酸钠缓冲液、和200ml的苛求厌氧的液体培养基(FAB)，用于粪便再悬浮。在高压灭菌器中对所述瓶进行杀菌(15分钟，121℃)。将所述瓶置于厌氧箱(Don Whitley)内以在高压灭菌后立即进行前减数(pre-reduce)。
表4.发酵介质组成猫和狗
·使用猫或狗粪便来作为体外发酵体系的细菌接种体源。在所述研究开始之前，给猫饲喂如下干燥全价饮食达至少3月时间。在所述研究开始之前，给狗饲喂配制用来成年维持的干燥饮食达至少2月时间。
·干燥产品配方
猫 狗
家禽35 30
谷物(稻米＆玉米)55 60
矿物质 5 5
脂肪5 5
总和100 100
·将猫豢养于小屋内3周的时间以便能够收集新鲜的粪便，随后中断一周。给猫独自饲喂维持体重所需量的饮食，并可在所有时间内自由饮用新鲜水。
·给狗独自饲喂维持体重所需的饮食，并可在所有时间内自由饮用新鲜水。
粪便接种(2天)
·收集新鲜粪便样品。在排便后60分钟内将20g湿粪便添加到前减数(pre-reduced)的磷酸缓冲液中。将烧瓶置于厌氧箱中的磁力搅拌器上以产生粪便再悬浮浆液(在搅拌器上约10分钟)。除去原棉塞，并将这种10％(w/v)的粪便浆液3ml等分于厌氧箱中的含有纤维源的各血清瓶中以及未添加纤维的三个对照瓶中。这样在各瓶中提供了约1％的粪便接种量。接种三个瓶以覆盖三个时间点的测量。用丁基橡胶帽替代原棉塞，并使用金属帽来密封各瓶。
·无纤维的三个对照瓶未接种并起介质对照作用。三个无纤维的瓶进行接种并用作介质和粪便对照。将所述瓶在37℃下于厌氧箱中培养。在接种粪便后的0、6和24小时进行时间点测量。
发酵终点测量(2和3天)
(i)SCFA测量(0、6、24小时)
·将4ml等份的发酵液添加到15ml的含有1.25ml 20％(w/v)偏磷酸的塑料皮质(cortex)管中。将所述管翻转并在室温下保持30分钟以在用气相色谱法进行分析之前贮存于-80℃以前使酸能够沉淀。这会检测到SCFA；乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、己酸、异己酸和庚酸。
·使试样彻底混合并使之沉降。用移液管将1ml的0.01M混合标准(在蒸馏水中的0.01M的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸、和己酸)或发酵提取物滴加到磨玻璃口(ground glassneck)的玻璃试管中，并添加约0.4g的NaCl(HPLC级)和0.3ml的12M H2SO4。添加1.5ml的叔丁基甲基醚(TBME、HPLC级，纯度99.8％)，并将所述混合物摇动1分钟。使含水和溶剂的层进行15分钟的分层，从而部分除去顶部醚层(约0.5ml，使用橡皮头移液管)并置于具有外膜密封(parafilm seal)的2ml的螺帽瓶中。将这些提取物注入气相色谱仪中，通过与VFA标准溶液对比来测量SCFA浓度。
(ii)气体测量(6，24小时)
·从厌氧箱中取出6和24小时时间点的瓶。提起“撕下”的金属密封以使得可测量瓶内的气体压力。以在各次测量前调到零处的压力计来测量压力的改变(以mBar计)。
(iii)pH测量(0、6、24小时)
·使用相对于公知标准校正过的pH计(Orino，ISE 710A)对发酵液的pH进行测量。
结果
细菌发酵终点
在存在1％粪便接种物的条件下，在接种6和24小时后，以体外发酵液所产生的SCFA、产生的气体和pH来测量脱脂干椰子肉压饼对细菌活性的潜在影响。对14只猫测量的结果进行分析并列于表6中。由狗(n＝6)得出的结果总结于表7中。
不含外部底物的对照试样产生显著数量的SCFA和气体。从添加有底物的试样中减去由对照试样的基底产量从而得出由椰子胚乳纤维源所引起的产量。正值表示有高于基底值的附加的产量，负值表示对产量有抑制，或相对于对照有消耗。pH负值表示pH降低(结果示于表6和7中)。
(a)总SCFA
所产生的SCFA总量随时间增加(表6和7)。通过对猫和狗进行观察，脱脂干椰子肉压饼导致在6小时后总的SCFA明显增加(p＜0.05)，高于不含纤维源情况下所产生的值。24小时情形类似。
通过对组分SCFA进行表征来对产生的总SCFA更详细地进行研究。在活体内，乙酸、丙酸和丁酸是主要的终点碳水化合物发酵物，且占结肠中总SCFA的90％。对猫和狗在6和24小时后观察到乙酸和丙酸的明显(p＜0.05)增加(例外的是对猫(n＝14)在24后的乙酸值)。
(i)丁酸盐
丁酸盐因其可对结肠细胞(colonocytes)施加的营养作用以及其有益的代谢作用而特别有意义。猫在6和24小时后在存在脱脂干椰子肉压饼的情况下产生的丁酸盐明显增加(p＜0.05)，高于对照产量(表6)。在猫的情形中，在24小时后，观察到由脱脂干椰子肉压饼导致的丁酸盐产量增加80％。这种接近两倍的丁酸盐水平在活体内可具有生物显著性。对于狗在24小时后，观察到增加，但不显著(表7)。
(b)气体
气体是第二种主要的终点发酵产物。气体的主要组分是CO2、H2和CH4，其主要来自碳水化合物发酵。气体的产生通过随时间的压力增加(mBar)来测量。
在猫和狗的研究中，在24小时后脱脂干椰子肉压饼纤维底物产生显著的气体增加(p＜0.05)，高于在不存在纤维的情况下产生的气体的量(表6)。表6.在用1％(w/v)猫粪便匀浆接种6和24小时后在不存在和存在干椰子肉压饼的情况下SCFA、气体和氨的产量。所述数值是n＝14的平均值。
在各测量点内有不同上标的数值(在任意栏中)有差别p＜0.05。
#SCFA总量是乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸、庚酸的总产量。
SE＝标准误差表7.在用1％(w/v)狗粪便匀浆接种6和24小时后在不存在和存在干椰子肉压饼的情况下SCFA、气体和氨的产量。所述数值是n＝6的平均值。
在各测量点内有不同上标的数值(在任意栏中)有差别p＜0.05。
总量#SCFA是乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸、庚酸的总产量。
结论
·发酵过程在很大程度上是由可利用底物的数量和种类驱动的。这一体系提供了极好的理解纤维底物可发酵性的方法，并对在大肠内微生物群落的作用提供了更好的了解。
·已有人提出，理想的纤维源应是产生高数量SCFA(特别是丁酸盐)的缓慢发酵物(fermenter)。这种缓慢发酵纤维会确保具有残余发酵能力的的纤维可达到栖生在结肠末端的细菌。从而可使用这类纤维源来沿大肠的全部长度上“饲喂”细菌。椰子胚乳纤维达到了这类纤维源的标准。
·猫和狗之间干椰子肉压饼的总体发酵就总SCFA和气体产量而言看起来是相似的。
·总体结果表明，椰子胚乳纤维的使用改进或维持了(良好)粪便质量并改进或维持了(良好)胃肠道健康。
·对猫观察到的丁酸盐的明显增加，是归因于健康肠环境的重要因素。在猫中，与其它纤维源相对比，作为纤维源的脱脂干椰子肉压饼意外地好，其产生的丁酸盐量明显增加，高于基底值。在狗中观察到脱脂椰子胚乳纤维有类似的结果，但不显著。
实施例4
介绍
该试验的目的是评价含脱脂干椰子肉压饼的两种配方的粪便质量性能。
所使用的基础宠物食品是呈胶状物产物的罐装块状物。各种饮食的配方组分是
配方1总量高于100％，是由于烘箱损失(烘箱产率90％)。所有罐均在125℃下加工61分钟。
方法
对代表若干不同品种的一组为10只的成年狗，在历经两周的试验中测量粪便质量。
所使用的狗是
小猎兔犬(Beagle) 1
小猎兔犬 2小猎兔犬 3小猎兔犬 4小猎兔犬 5英国施普林格长毛垂耳狗(English Springer Spaniel)6
7金毛猎犬(Golden Retriever)8梗狗(Cairn Terrier) 9袖珍髯狗(Miniature Schnauzer) 10给所述狗每天提供如下数量的饮食(g/天，以维持饲喂量计)
在各试验周开始前，给所述狗饲喂配方如下的标准宠物食品2天。这种例行的作法确保对粪便筛选研究有共同基线。
饮食配方
鱼和家禽35％
谷物(玉米、小麦)20％
肉汁45％
使用17类粪便评分等级对粪便质量进行主观测量，由此所有通便分级(以四分之一等级)为1至5(参见附录1)。使用在试验阶段中收集的所有粪便评分对各只狗计算平均粪便评分。通过对各只狗的平均值进行平均来计算对所述饮食的总平均粪便评分值。使用双向-ANOVA来进行统计分析(以饮食作为固定因子，狗作为变化因子)。
结果
接受性
在两周试验中所有狗吃掉了100％的所提供的食物。
粪便质量
当按照平均粪便评分值来分类时，对两种饮食来说，总的粪便质量均是极好的。
无论是在95％或90％的置信水平下，在两种饮食之间平均粪便评分值均无显著性差异(ANOVA，p＝-.77)。
图1表示了所述饮食的平均粪便评分值和95％LSD(最小方差)间隔(interval)的对比。
所述饮食的营养含量(％原状态)
讨论
当按照平均分数粪便来分级时，对两种饮食来说，总的粪便质量均是极好的。
无论是在95％或90％的置信水平下，在两种饮食之间平均粪便分数均无显著差异(ANOVA，p＝0.77)。
实施例5介绍
该试验的目的是评价含有干椰子肉压饼的干燥配方的粪便质量性能。
所使用的基础宠物食物是挤出的单组分干燥产物。配方组分如下
方法
对代表许多不同品种的一组为14只的成年狗，在一周的试验中测量粪便质量。
所使用于试验的狗是
1只拉布拉多猎狗(Labrador Retriever)
3只柯利牧羊犬(Border Collies)
2只德国牧羊犬
1只约克郡梗狗(Yorkshire Terrier)
2只苏赛克斯长毛垂耳狗(Sussex Spaniels)
5只杂交种
给所述狗饲喂以维持所需要的能量。
使用9类粪便评分等级对粪便质量进行主观测量，由此所有通便均分级(以二分之一等级)为1至5(参见附录1)。使用在试验阶段中收集的所有粪便评分值对各只狗计算平均粪便分值。通过对各只狗的平均值进行平均来计算所述饮食的总平均粪便评分值。
结果
接受性
在一周试验中所有狗吃掉了100％的所提供的食物。
粪便质量
当按照平均粪便分数来分类时，对所述产物来说，总的粪便质量均是极好的。
平均粪便评分值为2.5。
结论
在干燥产物中使用脱脂干椰子肉压饼给出理想的粪便质量。
实施例6
研究椰子胚乳纤维对犬肠中弯曲杆菌存活的影响。
简述
·弯曲杆菌是引起狗临床和非临床感染的最主要的胃肠病原体之一。
·已开发出犬大肠的活体外模型来测试新型纤维对犬的细菌病原体存活的影响。
·在这种模型中加入椰子胚乳纤维导致从体系中消除了存活的空肠弯曲杆菌细胞。
方法
1.由原种培养来繁殖空肠弯曲杆菌，并在37℃微需氧的(microaerobic)条件下(5％O2，10％CO2和85％N2)来进行培养。液体培养基以20ml体积在50ml锥形瓶中进行培养，所述锥形瓶在轨道振动器(orbital shaker)进行摇动。在进行实验之前将在MuellerHinton(MH)肉汤(Oxoid)中培养过夜的培养基调整到A600 1.0。
2.将200ml MH肉汤、1ml的调整过的空肠弯曲杆菌培养物、和2g新鲜粪便装入烧瓶。为对烧瓶进行测试，添加0.7％(w/v)的干椰子肉压饼并旋转以进行混合。对照瓶不进行任何添加。
3.在实验起始(0小时)和结束(24小时)时对烧瓶进行采样，并通过对来自烧瓶试样的连续稀释和在弯曲杆菌选择性琼脂(LabM)上的平板稀释来确定空肠弯曲杆菌的活菌计数。所述板以微需氧的条件培养48小时，之后确定存活菌数量。
4.在实验结束时，使用Multistix(Bayer)来确定各烧瓶中的混合物的pH。
5.每次使用来自不同狗粪便试样进行六次实验。在研究过程中所有的狗均饲喂市售高级(premium)(全价和平衡)干燥食物。
结果
在24小时微需氧培养后，由添加了椰子胚乳纤维的烧瓶不能得到存活的空肠弯曲杆菌细胞。相对照的是，由不含椰子胚乳纤维的烧瓶得到的空肠弯曲杆菌细胞约为每ml 108个细胞。在下表中示出了6次独立实验的结果，且在随后的图表中列出了数据
添加和不添加椰子胚乳纤维的条件下，从犬大肠模型所得到的存活空肠弯曲杆菌细胞数(log10)。
<----空肠弯曲杆菌的log10结肠形成单位--->
图2表示了在犬大肠模型中加入椰子胚乳纤维对空肠弯曲杆菌存活的影响。字母表示统计显著性差异。
对各只狗在体系中添加椰子胚乳纤维和从中省略的情况下培养24小时后记录的pH值。
在培养阶段结束时，测量在各瓶中的溶液的pH，发现当从体系中省去椰子胚乳纤维时，pH为7.5(SD为0)。当在该模型中包含椰子胚乳纤维时，发现pH为6.42(SD为0.26)。
结论
在犬大肠模型中包含椰子胚乳纤维导致消除了存活的空肠弯曲杆菌细胞。在所述体系不添加椰子胚乳纤维的情况下，在实验期间空肠弯曲杆菌细胞的存活性没有表现出损失。由于对弯曲杆菌来说，6.5至7.5的pH范围是最佳的，观察到的两种条件下的pH的差别不太可能是导致观察到的存活率差别的原因。相反，可能的是，存在于粪便中的非致病、糖分解细菌使椰子胚乳纤维发生代谢。空肠弯曲杆菌不能够发酵碳水化合物，因而存在的椰子胚乳纤维给非致病、糖分解细菌提供了益处。
实施例7
在这项研究中，对在饲喂含有椰子胚乳纤维源的饮食和标准(无纤维)饮食后结肠的炎性状况进行了对比。
方法
该试验涉及代表若干品种的7只狗。在饲喂和测量阶段使狗单独居住。该试验交叉进行。给狗饲喂维持体重所需量的单独饮食(125×BW0.75)，在4周的所有时间均可自由饮用水，其中进行一周的冲洗(washout)。试验饮食是全价营养湿形物，其由烘箱成形的罐装于水中的肉块状物组成。椰子胚乳纤维的含量为7.2(w/w)。所有其它配方组分均按比例减少以添加呈干椰子肉压饼形态的椰子胚乳纤维。冲洗饮食(washout diet)是全价和平衡饮食。
活组织检查试样培养
从中部结肠(mid-colon)取三个活组织检查试样，转移至组织培养介质(RPMI+gentomycin)中并称重。将活组织检查试样在新鲜介质中洗涤30分钟，并转移至新鲜的含有1ml介质的24孔的多孔板中，在37℃及5％的CO2下培养24小时。然后在13000rpm下将活组织检查试样离心(spun down)5分钟，并将上清液转移至新鲜的eppendorf管中，在-20℃下冷冻至直到需用时。将0.5ml 1％的triton裂解缓冲剂(20mM Tris Ph7.5，20mM NaCl2，1％triton×100)添加到活组织检查试样中，并放置最少1小时。然后将所述试样进行简短的匀浆，使用Sigma Microprotein-PRTM试剂盒来测量总蛋白质含量。发现活组织检查试样总蛋白质与活组织检查试样湿重明显相关，并用来使廿烷类产量相对于活组织检查试样尺寸标准化。
廿烷类产量的测量
通过酶免疫测定法(EIA)来测量由中部结肠活组织检查试样所产生的PGE2的量。将1份上清液试样稀释于10份新鲜介质中。由R&D体系获得PGE2EIA试验，并如提供的规程表(protocol sheets)所述进行。简言之，将100μl试样和PGE2标样添加到96孔的微量培养板中，所述培养板预先涂覆山羊抗鼠/兔(anti-mouse/rabbit)多克隆抗体。添加50μl结合到碱性磷酸酯酶上的PGE2和50μl对PGE2的鼠多克隆抗体。所述板在室温下在设置在500±50rpm的水平轨道平板振动器上培养2小时。在培养后对所述板进行洗涤，并添加200μlpNPP底物。在经一小时的培养后，添加50μl的终止溶液(磷酸三钠)，使用设置在450nm波长下的微量培养板读数器立即测定各孔的光密度。从标准曲线来计算每mg活组织检查试样蛋白质的廿烷类浓度。
结果
结肠活组织检查试样的廿烷类产量。
当给狗饲喂含有椰子胚乳纤维的饮食时，活组织检查试样产生的PGE2明显少于给狗饲喂标准饮食的值(P＝0.08)。结果列于下表和图3中，其中示出了结肠活组织检查试样的平均PGE2产量。
附录1-粪便质量
·使用17点打分等级来评价所有通便情况，由此将粪便以四分之一等级的增量在级别1至级别5之间打分。
·如粪便判断为不满或接近半个等级，则将其打分为四分之一等级。二分之一等级在以下划分。
·使用9点打分等级来评价所有通便情况，由此将粪便以二分之一等级的增量在级别1至级别5之间打分。二分之一等级划分如下
级别5-水性腹泻
级别4.5-有一些稠性区域的腹泻
级别4-大部分，既使不是全部，失去其形态，稠度不良，粘性
级别3.5-很湿，但仍具有一些确定的形态
级别3-湿、开始失去其形态，当提起时留下明确的痕迹
级别2.5-有良好的形态，表面略湿，留有痕迹，接触时粘附
级别2-有良好的形态，不留痕迹，“可踢动(kickable)”
级别1.5-硬且干燥
级别1-硬、干燥且易碎，“似子弹”
·以下是表明“理想”和“不可接受”粪便质量范围的打分等级的实例
不可接受(或不良粪便质量)(U)＝低于1.5和大于3.5(不包括端值)
理想(I)＝介于1.5和2.5之间(包括端值)
·计算由各只狗所产生的平均粪便分数，然后通过对各只狗的平均粪便分数进行平均来确定对于试验整体的总平均值。
附录2
Englyst和Cummings(Supra)的Englyst方法。
实验
装置
在如前所述的50-60ml螺旋帽玻璃离心管中进行分级(fractionation)步骤。用装有火焰电离检测器的Pye Unicam Series204色谱仪来进行气液色谱分析。使用装填有涂覆了3％SP2330的Supelcoport(100-200目)的2.1m×2mm i.d.玻璃柱。柱温为215℃(等温)，进样器和检测器温度为250℃。载气(氮)流量为20ml分-1
试剂
所有分析均使用高纯经过检验的试剂。酶制品如下猪胰α-淀粉酶，E.C.3.2.1.1(Sigma，Cat.No.A4268)；支链淀粉酶，E.C.3.2.1.41(Boehringer，Cat.No.108944)。
方法
在所述方法中的步骤顺序列于图1中。
试样预处理
尽可能在不进行任何预处理的条件下来对食品进行分析。如获得代表性试样有困难，则可将低水分含量的食品进行2-3分钟的球磨处理，而具有高水分含量的则进行均化，或冷冻干燥和球磨处理。
试样质量(Mass)
准确称量50至1000mg的试样，含有不超过150mg淀粉和50mg的NSP，加入到50-60ml的螺旋帽离心管中并添加搅拌磁子。
脂肪提取和干燥
含干物质90至100％和含少于203％脂肪的试样可直接进行分析。另外，添加40ml丙酮，使用磁力搅拌器混合30分钟，离心并通过抽吸在不干扰残余物的情况下除去尽可能多的上清液。将所述管置于在磁力搅拌器热板上的65℃水浴中，并混合残余物数分钟直到其看起来是干燥的。可盖住烧杯，并通过水泵来除去丙酮蒸气。
淀粉的分散
添加2ml的DMSO，给所述管盖帽并在沸水浴中加热1小时，从开始再沸腾时计时，连续搅拌。然后，在不经冷却的条件下，在50℃下，添加8ml pH为5.2的0.1M乙酸钠缓冲液，并立即进行涡流混合。
非淀粉多糖(NSP)的分析方法
淀粉的酶水解
冷却所述管至45℃，立即添加0.1ml的每ml pH为5.2的乙酸盐缓冲液含有5000单位α-淀粉酶和5单位支链淀粉酶的酶溶液。在450C下培养所述试样16-18小时，优选如前所述连续混合。
在酶处理之后，添加40ml的绝对乙醇，良好混合，并在室温下放置1小时。离心10分钟或者直到得到澄清的上清液。在不干扰残余物的情况下，通过抽吸除去尽可能多的上清液，并将其舍弃。通过混合形成悬浮液来用50ml85％的乙醇洗涤残余物两次，离心直到清彻，并如前述除去上清液。向洗涤过的残余物中添加40ml的丙酮，搅拌5分钟，然后离心。通过抽吸除去上清液，并如在“脂肪提取和干燥”部分所述对残余物进行干燥。
酶消化残余物的酸水解
使用涡流搅拌器，将干燥过的残余物分散在1ml的12M硫酸中。在35℃下放置1小时以溶解纤维素，然后快速添加11ml的水并进行混合。
将所述溶液在沸水浴中加热自再沸腾起始2小时，连续搅拌。通过将所述管置于水中来将其冷却至室温，添加2ml的内标物(每ml饱和苯甲酸溶液2mg阿洛糖)并混合管中的内容物。使用1ml水解物来制备乙酸多羟糖醇，保存其余物来用于测定糖醛酸。
糖醛酸
所使用的方法是Scott方法的变体。将0.3ml水解物(如必要，进行稀释，使得其每ml含有25至100μg糖醛酸)与0.3ml的氯化钠-硼酸溶液混合物(通过向100ml水中添加2g氯化钠和3g硼酸来制备)进行混合。添加5ml浓硫酸，并进行涡流混合，然后将所述管置于70℃下的加热块(heating block)中。将所述管和内容物放置40分钟，然后通过放入水中来将其冷却至室温。当冷却时，添加0.2ml的3，5-二甲基苯酚溶液(0.1g的(CH3)2-C6H3OH在100ml冰醋酸中)，并立即混合。在10至15分钟后，在分光光度计中读取在400和450nm下相对于水作参照试样的吸光率。对各试样从450nm的读数中减去在400nm下的读数，并用所得差绘制葡萄糖醛酸标准曲线(范围为25-125μf ml-1)。从该图线中读取试样浓度。
乙酸多羟糖醇酯的制备
向1ml的水解物中添加0.2ml的12M氨溶液和5μl辛-2-醇。测试该溶液为碱性，然后添加0.1ml的新制备的在每ml 3M氨溶液中的100mg四氢硼酸钠(III)(氢硼化钠)的溶液。混合，并将所述混合物在40℃下放置1小时，添加0.1ml的冰醋酸。接着，向0.2ml的该酸化溶液中添加0.3ml的N-甲基咪唑和2ml的乙酸酐，并进行混合。将其在20℃(室温)下放置10分钟，添加5ml的水，混合，冷却时添加1ml的二氯甲烷，在涡流搅拌器上剧烈搅拌内容物，并离心数分钟以将所述混合物分为两相。通过抽吸除去大部分顶层相，并舍弃，然后将低层相转移至小的管瓶中，密封并将其在-20℃下贮存。使用1-2μl用于进样到色谱仪中。
乙酸多羟糖醇酯的另一种制备方法
当使用二氯甲烷作为乙酸多羟糖醇酯的溶剂时，在无自动GLC进样器的一些实验室中观察到，对于获得可再现的结果来说，进样技术是关键的。如用乙酸乙酯来替代二氯甲烷作为乙酸多羟糖醇酯的溶剂，则可获得更稳定的方法。所述步骤如下
向1ml的水解物中添加0.2ml的12M氨溶液和和5μl辛-2-醇。测试该溶液为碱性，然后添加0.1ml的新制备的在每ml 3M氨溶液中的100mg四氢硼酸钠(III)的溶液。混合，并将所述混合物在40℃下放置1小时，添加0.1ml的冰醋酸。接着，向0.5ml的该酸化溶液中添加0.5ml的N-甲基咪唑和5ml的乙酸酐，并进行混合。将其在20℃(室温)下放置10分钟，然后添加0.6ml的乙醇并混合。在5分钟后添加5ml的水，置于室温水浴中，添加5ml的7.5M KOH，并在数分钟后再添加5ml的7.5M KOH。通过翻转来进行混合，并放置以分成两相。将顶层相转移至小的管瓶中，并将在+5℃下贮存。使用1-2μl用于进样到色谱仪中。
其它实施方案
应理解，虽然已结合其详细说明对本发明进行了叙述，但前述的说明是说明性的而非限制本发明的范围。在以下给出的权利要求书的范围内，还存在本发明的其它方面、优点、和改变。


本发明涉及椰子胚乳纤维在宠物食品产物中作为食用纤维组分的用途,椰子胚乳纤维在宠物食品产物制备中的用途,包含椰子胚乳纤维的宠物食品产物,这类宠物食品产物的制备方法以及包括用这类宠物食品产物饲喂宠物动物的方法。本发明还涉及椰子胚乳纤维用于减少和防止宠物大肠肠炎和用于减少和防止致病菌感染的用途。