专利名称：一种重组人血管内皮抑制素温度敏感型凝胶的制备方法随着国内生物技术和药学的发展，原位凝胶在一些难以用传统给药方式给药的不 稳定药物以及长效控释制剂、靶向定位制剂方面展示了优势。原位凝胶能够以液体状态自 由加载各种性质及分子量的药物。此外，多样化的胶凝机制为设计不同途径的药物传递系 统提供了丰富的选择，特别是可生物降解原位凝胶已经在长效植入系统和蛋白质及多肽类 给药系统等方面展示出了令人瞩目的潜力，对其深入、广泛的研究将为药物传递科学注入 新的活力。壳聚糖来源广泛、天然，具有很好的生物降解性、生物相容性。壳聚糖通过化学或 物理的方法形成能保持大量水分而又不溶解的水凝胶。这类水凝胶具有良好的亲水性和生 物相容性，且对温度、PH及电场具有一定的敏感性，已广泛应用于医用材料领域。研究发现一些内源性血管生成抑制因子如Angiostatin、Endostatin能够阻碍血 管在肿瘤组织中的生长，使肿瘤的生长和转移处于停滞(0，Relly, M. S.，et al. Cell. 79 315-328，1994 ；0，Relly, M. S.，et al. Cell. 88 :277-285,1997)。基于此原理，先声麦得 津开发了注射用重组人血管内皮抑制素(恩度，Endostar)，是首个血管内皮抑制素肺癌新 药。恩度自2006年上市以来，取得了良好的临床治疗效果。2007年共计有一万多人使用了 恩度，目前已完成了接近3000名病例的IV期临床验证，其安全性和有效性得到了临床的进 一步证实。恩度目前的给药方式是病人需要每天静脉滴注一次，疗程为14天，休息一周后， 再继续下一疗程，治疗费用高，患者依从性不佳。近期有研究发现动物体内小剂量持续给 予 Endostatin 的药效要优于间歇性给药(Minoru Kuroiwa, et al J. Pediatr. Surg. 38 1499-1505,2003 ；Oliver Kisker,et al. Cancer Res. 61 :7669-7674,2001) 因此，将其开 发成注射一次可以持续释药的长效制剂非常必要。制备注射用重组人血管内皮抑制素温度 敏感型壳聚糖凝胶，使药物在体内缓慢平稳的释放，延长药物在体内的半衰期，可以减少肿 瘤病人每个疗程的给药次数，从每天静脉滴注给药一次改为1-2周给药一次，提高了病人 顺应性，降低了用药的成本，具有良好的临床疗效和市场前景。同时为目前临床恩度注射液 的最佳给药方式的确定提供理论和实践的依据。
本发明的目的是提供一种可用作注射用重组人血管内皮抑制素温度敏感型壳聚 糖凝胶的制备方法。本发明所述温度敏感型壳聚糖凝胶是物理凝胶，主要是利用壳聚糖溶液的pH值 变化导致的疏水作用及壳聚糖与多元醇中羟基的氢键作用。当采用低温条件下将碱性物质(含多元醇或与多元醇混合)添加入壳聚糖，由于分子运动缓慢，多元醇与壳聚糖链间的氢 键作用使壳聚糖链分离，因此壳聚糖溶液保持溶液状态；升温后分子运动加剧，氢键作用被 破坏，壳聚糖分子链之间的疏水作用使其相互缠绕形成凝胶。该凝胶制备过程在低温及生 理温度条件下完成，不涉及高温处理及有机化学试剂，这对于稳定性差的大分子蛋白非常 适合，有助于保持生物活性。本发明所述温度敏感型壳聚糖凝胶包括壳聚糖和重组人血管内皮抑制素。本发明的温度敏感型壳聚糖凝胶的制备方法采用下列步骤(1)将壳聚糖酸性溶液与血管内皮抑制素混合；(2)搅拌的条件下加入生物相容 性的助剂；C3)停止搅拌，调节反应体系温度，静置得血管内皮抑制素的壳聚糖凝胶。壳聚糖酸性溶液优选壳聚糖盐酸溶液。盐酸溶液浓度优选为5 15mg/mL的，更 优选为10mg/mL。壳聚糖溶液浓度优选为10 30mg/mL。壳聚糖分子量范围优选为10000 500000道尔顿，更优选为10000 200000道尔顿。壳聚糖与血管内皮抑制素质量比优选为1 3 1 12。血管内皮抑制素是人或其他哺乳动物来源的，优选为人源的；更优选地为重组人 血管内皮抑制素，最优选地为重组人血管内皮抑制素Endostar。血管内皮抑制素优选溶解在缓冲液中；所述缓冲液优选为醋酸盐缓冲液、磷酸盐 缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种，最优选地为醋酸盐缓冲液。缓冲液pH 值优选为2 9，更优选为4 7。壳聚糖酸性溶液与血管内皮抑制素混合的反应体系温度优选为0 10摄氏度。生物相容性的助剂可以直接加入，也可以以溶液形式或混悬液形式加入；优选地 为以溶液形式或混悬液形式加入。生物相容性的助剂优选地为甘油磷酸盐、碳酸氢钠、甘油或海藻酸钠中的一种或 多种。更加优选地为选自浓度为100 600mg/mL的甘油磷酸盐溶液，浓度为5 50mg/mL 的海藻酸钠溶液，浓度为50 200mg/mL的碳酸氢钠/甘油混悬液中的一种。本发明中碳酸氢钠/甘油混悬液是指将碳酸氢钠混悬于甘油中。生物相容性的助剂与血管内皮抑制素的质量比优选为1 1.5 1 32。加入生物相容性的助剂后，继续搅拌，时间优选为IOmin 12h，更优选为20min 4h。加入生物相容性的助剂的反应体系温度优选为0 10摄氏度。停止搅拌后调节反应体系温度，温度优选地为30 45摄氏度，更优选为36 38 摄氏度。静置时间优选为IOmin 12h，更优选地为30min 他。当溶液转变为无流动性 的半固体或固体，即得载血管内皮抑制素的壳聚糖凝胶。本发明中可以采用磁力搅拌、螺旋桨搅拌，优选搅拌转速在100 600转/分。生物相容性的助剂是指对生物安全，不影响生物功能的，并能赋予产品某种特有 的应用性能所添加的辅助物质。本发明中生物相容性的助剂可以为一种单一的物质，也可 以为几种物质组成的混合物。本发明的优点有1.本发明中壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性，是蛋白质类药物的良 好载体；2.与微球等给药系统相比，本发明中的工艺路线简单可行，成本低廉；制备条件 温和，可以避免制备过程中使用有机溶剂，对蛋白活性影响很小，载药能力大。3.本发明得到的壳聚糖凝胶可调控活性成分的释放时间，使在体内的释放时间在 7天 观天，甚至更长。可以减少肿瘤病人每个疗程的给药次数，从每天静脉滴注给药一次 改为1-2周给药一次，提高病人的顺应性，降低用药的成本，具有良好的临床疗效和市场前旦ο
图1实施例一中凝胶扫描电镜图。图2实施例二中凝胶累积释放曲线图。图3实施例三中凝胶电泳(SDS-PAGE)图，其中1，2，3为释放10天的样品，4，5，6 为释放20天的样品，7为对照。

称取分子量为20000道尔顿的壳聚糖400mg，溶于25mL 的盐酸溶液中，得到 16mg/mL的壳聚糖溶液。取5mL上述溶液置冰水浴中磁力搅拌(温度为0摄氏度)，加入含 600mg的Endostar缓冲溶液，磁力搅拌使其混合均勻。称取海藻酸钠lOOmg，溶于IOmL水 中，得到lOmg/mL的海藻酸钠溶液，冷藏放置30min，然后取5mL缓慢加入至含有Endostar 的壳聚糖溶液中，继续在冰水浴中磁力搅拌池。停止搅拌，将温度调节至40摄氏度，静置 6h，即得载重组人血管内皮抑制素的壳聚糖凝胶。将形成的凝胶置于37°C恒温水浴震荡器中，加入25mL磷酸盐缓冲液PBS 7. 4。分 别于释放10天、20天后取出释放液，进行SDS-PAGE电泳实验，电泳结果见图3，结果说明释 放后的重组人血管内皮抑制素分子量未发生变化，即蛋白未发生降解。


本发明涉及一种注射用重组人血管内皮抑制素温度敏感型壳聚糖凝胶的制备方法，该壳聚糖凝胶包括壳聚糖和重组人血管内皮抑制素。温度敏感型壳聚糖凝胶制备方法采用物理凝胶法，即先将壳聚糖加入盐酸溶液中，搅拌至完全溶解，置于水浴中；将注射用重组人血管内皮抑制素缓冲液溶于壳聚糖盐酸溶液中；控制水浴温度，不断搅拌的条件下加入生物相容性的助剂；停止搅拌，调节水浴温度，静置。当溶液转变为无流动性的半固体或固体，即得载重组人血管内皮抑制素的壳聚糖凝胶。