专利名称：能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽及其运用的制作方法血管生成是在已经存在的血管上出芽形成新血管的过程，无血管期肿瘤的增殖和凋亡处于动态平衡，若没有足够的血管供氧和营养物质，肿瘤仅能生长至直径l_2mm大小； 而通过新生血管供应的营养物质有利于肿瘤持续生长和转移，即肿瘤的生长与转移依赖血管生成，以肿瘤血管生成为靶点的研究为当今热点与发展方向之一。理想的靶点应该仅在肿瘤组织高表达，而在其它任何组织不表达，但这样的靶点目前尚未发现，故人们寻找在肿瘤组织中高表达而在其它组织中低表达或不表达(即具有高的瘤/非瘤比值)的物质作为靶点。遵循此思路，以VEGF/VEGFR、整合素ανβ3、细胞外基质、内皮细胞、基质金属蛋白酶(MMP)、E-选择素和CD105等与血管生成密切相关的环节为靶点的研究取得了一定的进展，有的药物已进入临床应用。其中VEGF/VEGFR在肿瘤血管生成中起关键作用，与肿瘤的生长与转移密切相关，VEGFRl与VEGFR2高表达于肿瘤细胞及新生的血管内皮细胞，在其它细胞中极低表达或不表达(即具有高的瘤/非瘤比值)，阻断VEGF/VEGFR途径可明显地抑制肿瘤的血管生成，进而抑制肿瘤的生长与转移。即VEGF/ VEGFR是肿瘤血管生成的关键分子，以其为靶点开发的分子探针不仅因具有较好的靶向性用于显像，并且可以作为靶向药物(如多肽、抗体、抑制剂)抑制肿瘤的生长，为肿瘤诊治研究的一个重要靶点。VEGF125^136为VEGF-A外显子6编码的12肽QKRKRKKSRYKS，在体外能与VEGFR特异结合但不激活VEGFR，从而有可能竞争抑制VEGF的促血管生成作用QBiochem Biophys Res Commun. 2001;283:164-173) -,“Nuclear Medicine and Biology, 2009 (36) 535 - 543 三军医大学学报，2009，31(6):487-490”研究显示VEGF125_136能靶向浓聚于肿瘤组织，具有较高的瘤/非瘤比值，能较好地在体显示荷瘤裸鼠的肿瘤组织。多肽能够与其靶受体特异结合，二者间的亲和力是决定结合特异性、结合数量的关键因素之一，亲和力越高，特异性就越好，与靶组织结合的数量就越多。故筛选能与 VEGFR具有高亲和力，且对肿瘤细胞生长具有明显抑制作用的小分子多肽，为肿瘤的分子显像乃至分子靶向治疗的重要研究方向。申请号为200810069448. 2的中国发明公开了多肽 AHKRKRKKRHYK，其能拮抗VEGF与VEGFR的结合，但抑制肿瘤细胞增殖的能力较弱。
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供能与血管内皮生长因子受体高亲和力、特异结合的多肽，该多肽经亲本多肽VEGF125_136改造而得，所述多肽能竞争抑制125I-VEGF与 VEGFR的结合，亲和力强，且能明显抑制肿瘤细胞的增殖。为实现上述目的，本发明的技术方案为1、能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽，所述多肽相对于如SEQ ID NO: 18所示的亲本多肽VEGF125_136的氨基酸序列，在保持其U6-133号位置的氨基酸不变的条件下增加或将其它位置的氨基酸替换为碱性亲水氨基酸R、K和H中的任一个或多个，或/和加入强疏水片段I、L、V中的任一个或多个，所述多肽的序列长度为12-14。2、根据1所述的能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽，所述多肽相对于如 SEQ ID N0:18所示的亲本多肽VEGF125_U6的氨基酸序列，在保持其126-133号位置的氨基酸不变的条件下将125位替换为碱性亲水氨基酸R，去除135位氨基酸，并在134位与136位间加入强疏水氨基酸I、V和L。3、根据2所述的能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽，其特征在于所述多肽序列如SEQ ID NO: 19所示。4、根据1所述的能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽，其特征在于所述多肽相对于亲本多肽VEGF125_136如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列，在保持其U6-133号位置的氨基酸不变的条件下将134位替换为碱性亲水氨基酸K，将136位替换为碱性亲水氨基酸H，所述多肽序列如SEQ ID N0:20所示。本发明的目的之二在于提供上述多肽的新运用，该运用能竞争性抑制血管内皮生长因子与其受体结合，且能明显抑制肿瘤细胞增殖，为抑制肿瘤提供了新的手段。为实现上述目的，本发明的技术方案为5、1-4任一项所述的能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽在制备血管内皮生长因子拮抗剂及肿瘤细胞生长抑制剂中的运用。6、根据5所述的能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽在制备血管内皮生长因子拮抗剂及肿瘤细胞生长抑制剂中的运用，所述多肽在制备抗肿瘤药物中的运用。7、根据6所述的能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽在制备血管内皮生长因子拮抗剂及肿瘤细胞生长抑制剂中的运用，所述多肽在制备抗肺腺癌药物中的运用。8、根据6所述的能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽在制备血管内皮生长因子拮抗剂及肿瘤细胞生长抑制剂中的运用，所述多肽在制备抗乳腺癌药物中的运用。本发明提供的目的之三在于提供多肽的另一运用，该运用为肿瘤的诊断提供了新的分子探针。实现上述目的的方案为9、1-4任一项所述的具有血管内皮生长因子受体亲和力的多肽在制备肿瘤的分子显像剂中的运用。本发明的有益效果在于本发明借助生物信息学方法筛选，首先对VEGF125_136的 125、126、134、135及136位置进行突变，得到3. 2X IO6个突变组合，利用爬山法在VEGFR 胞外区的Igl_Ig3样区之间进行搜索，并将结合能从高到低对亲和力进行排序，得到17条多肽片段；同时结合表面基团相互作用分析法，在多肽中加入或替换碱性亲水氨基酸及增加末端疏水片段，最终得到的多肽，其与VEGF受体的亲和力明显高于VEGF125_136，最高者为 VEGF125^136 的 6 倍；其中，多肽 QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS 较 VEGF125_136 的亲和力分别高近6倍及2. 5倍，且能够明显抑制肿瘤细胞的增殖，多肽浓度为240 μ mol/L时，它们对A549 (肺腺癌细胞株)、MCF (人乳腺癌细胞株)增殖的抑制率分别高达40%-70%、50%，均明显高于 VEGF125^136的抑制能力(约为20%)。为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图 ι 为多肽 VEGF125_U6 对125I-VEGF165 与 A549 细胞结合的影响(IC50 = 464nmol/L)的分析图 2 为多肽 QKRKRKKSRKKH 对 125I_VEGF165 与 AM9 细胞结合的影响(IC50 = 80nmol/ L)的分析图3为多肽RKRKRKKSRYIVLS对125I_VEGF165与AM9细胞结合的影响(IC50 = 185nmol/L)的分析图4为VEGF125_136、多肽QKRKRKKSRKKH和多肽RKRKRKKSRYIVLS对肿瘤细胞株AM9及 MCF的抑制率分析图。

谷酰胺gin Q;甘氨酸gly G ；丝氨酸ser S ；丙氨酸ala A ；苏氨酸thr T ；缬氨酸 val V ；异亮氨酸ile I ；亮氨酸leu L ；酪氨酸tyr Y ；苯丙氨酸phe F ；组氨酸his H ；脯氨酸pro P ；天冬氨酸asp D ；甲硫氨酸met M ；谷氨酸glu E ；色氨酸trp W ；赖氨酸Iys K ；半胱氨酸cys C ；精氨酸arg R0
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例1能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽序列的筛选
亲本多肽VEGF125_136，其氨基酸序列为“QKRKRKKSRYKS”，是来自VEGF中的一段多肽序列，其能够与VEGF受体相互作用，从而抑制VEGF与VEGFR的结合。本实施例借助生物信息学方法对上述多肽序列进行改造，筛选获得与VEGFR的亲和力更高的多肽，最好该多肽能够抑制肿瘤细胞的增殖能力。本实施例利用分子对接方法和表面基团相互作用分析方法来筛选可能更有亲和力的多肽序列。一、分子对接方法改造多肽 1技术平台
方法分子对接(molecular docking)是依据配体与受体作用的“锁-钥原理”(lock and key principle)，模拟小分子配体与受体生物大分子相互作用。具体步骤是将VEGF 受体结合区(膜外IG1-IG3)作为受体，以多肽作为小分子配体，将多肽序列的结构作看做柔性结构；将VEGFR胞外区IG1-IG3结构看做刚性结构，使用分子对接软件计算二者之间的结合情况，评估二者之间结合能量，依据结合能量的高低来判别二者之间亲和力的大小。当结合能量越低，二者之间亲和力越大。软件=Autodock-Vina 1. 1，该软件支持多核、高性能计算，计算精度、速度以及使用的便利性要优于AutoDock。Autodock在小分子配体筛选研究中应用广泛，计算速度快。硬件第三军医大学生物信息中心高性能计算系统来进行计算，该系统是基于 Rocks Cluster Linux 5. 3构建的并行计算集群，拥有208个计算核心，峰值浮点运算能力接近2万亿次。2改造方案与计算结果
对亲本多肽 VEGF125_136 (参见 SEQ ID NO: 18),即 QKRKRKKSRYKS 序列的第 1、2、10、11、12 位置的氨基酸进行突变，以增强其与VEGFR的结合能力。上述5个突变位置，所有的突变组
合数目为20x20x20x20x20=32xl0e。采用一种简单的方法——爬山法进行搜索， 从而找到结合能低的多肽序列。由于“QKRKRKKSRYKS”与VEGFR的相互作用位置在细胞外Igl_Ig3样区之间，在对接计算时，假定改造后的多肽分子与VEGFR的相互作用位置也在这个区间。(1)优化过程及结果 Autodock vina 参数
Autodock vina将受体表面分成若干个格点，配体的构象在格点中进行优化，在搜索过程中，我们采用的参数如下
(2)亲本多肽QKRKRKKSRYKS与VEGFR的相互作用情况
利用autodock vina对原始的多肽序列与VEGFR的相互作用情况进行了分子对接计算，由于autodock vina采用遗传算法来寻找最优的亲和力(affinity)得分，最终得到的是次优解，因而，为了得到尽可能低的得分(亲和力得分越低，说明结合得越好)，共计算五次，并选择最低的分值作为该相互作用的亲和力得分。 5次计算得到的相互作用得分如下表，可以看出最高的亲和力得分为-5. O (能量越低表示亲和力越高)。(3)利用爬山法对多肽进行改造的计算结果
首先，对亲本多肽“QKRKRKKSRYKS“的第1、2、10、11、12位置的氨基酸分别进行突变，分别获得不同的亲和力得分。分析结果可知，将12位的氨基酸“S”突变为“K”，即“QKRKRKKSRYKK”的亲和力得分为-5. 5 ；其次是把位置2的氨基酸K突变为F，S卩“QFRKRKKSRYKS”的亲和力得分为-5. 4。本实施例将在多肽“QKRKRKKSRYKK”和多肽“QFRKRKKSRYKS”这两个位置突变的基础上进行的改造。当把亲本多肽“QKRKRKKSRYKS”位置12的氨基酸S突变为K，接着对多肽的第1、 2、10、11位置的氨基酸分别进行突变获得的亲和力得分。分析结果可知，当位置11的氨基酸突变为P时，相互作用的结合能力得到了最好的改善，为-6. O。当亲本多肽“QKRKRKKSRYKS”位置2的氨基酸K突变为F，接着对多肽的第1、10、 11、12位置的氨基酸分别进行突变，获得的亲和力得分，可以看出，当位置11的氨基酸突变为P时，相互作用的结合能力得到了最好的改善，为-5. 9。3 结果计算亲和力结果优于亲本多肽“QKRKRKKSRYKS”，其能量值越低，亲和力越好，一共包含 17条多肽及其能量值具体如下
QFRKRKKSRYPK,-6.2；SEQIDNO:1QKRKRKKSRYPK-6.0；SEQIDNO2QFRKRKKSRYPS-5.9；SEQIDNO3QKRKRKKSRYKY-5.8；SEQIDNO4QFRKRKKSRffKS-5.6；SEQIDNO5QKRKRKKSRYKK-5.5；SEQIDNO6QFRKRKKSRYKS-5.4；SEQIDNO7KFRKRKKSRYKS-5.4；SEQIDNO8FFRKRKKSRYKS-5.3；SEQIDNO9QFRKRKKSRYKH-5.3；SEQIDNO10HFRKRKKSRYKS-5.3；SEQIDNO11QFRKRKKSRYLS-5.3；SEQIDNO12QFRKRKKSRYKF-5.2；SEQIDNO13QFRKRKKSRYKP-5.2；SEQIDNO14QFRKRKKSRYKQ-5.2；SEQIDNO15DKRKRKKSRYKS-5.2；SEQIDNO16QKRKRKKSRYffS-5.2□ SEQIENO:17ο二、表面基团相互作用分析
1、基于表面极性基团相互作用和疏水作用特点改造多肽
离子键和疏水作用可能是VEGF和受体之间的主要作用方式。本实施例使用Cn3D软件来观察VEGF与VEGFR相互结合的细节。使用VMD1. 8. 3软件确定受体胞外IG1-IG3区域的表面极性基团、酸性基团、碱性基团、非极性基团的分布
亲本多肽序列为含有大量强亲水氨基酸，表面含有大量碱性基团，因此容易和受体 VEGFR胞外的酸性基团区域发生相互作用。此外，从非极性基团的分布和空间结构可以看出，多个酸性基团周围都存在疏水凹洞。因此，通过两个途径中任一种改造一是在亲本多肽序列中加入更多的碱性亲水氨基酸，增强多肽与VEGFR表面酸性基团之间的作用力；二是在保持或增强亲本多肽碱性基团的基础上在多肽序列末端增加疏水片段，增强其与原来作用区域周围可能的疏水单元之间的相互作用。对于每一条改造的多肽，使用多肽与蛋白质相互作用位点和作用效果预测软件 PEPSITE来预测其与VEGFR胞外第1个到第3个IG样区之间的相互作用。2改造基团
2.1增强原多肽碱性基团数量的改造结果
改造方法是保持亲本多肽VEGF125_136的U6-133号位置的氨基酸不变的条件下，在该片段的前面或者后面逐步增加碱性亲水氨基酸R、K、H，或者将原多肽125，126，134，135，136 位置替换为碱性亲水氨基酸，允许最长12个氨基酸残基，使用PERSITE预测其作用结果。2.2在多肽末端增加疏水基团的改造结果改造方法是保留亲本多肽核心片段“RKRKKSR”7个氨基酸不变，在最长允许长度为14 个氨基酸残基的基础上增加一定数量的碱性氨基酸，然后在前末端或者后末端加入强疏水片段(氨基酸I、L、V、F)，使用PEPSITE预测作用位置和作用效果。
三、初步改造结果
综合分子对接分析和表面基团相互作用分析两种改造方案的计算结果，将两种方案中得分较高的部分多肽序列汇总，得到下列20条多肽序列以通过生物学实验进一步筛选、验证其与VEGFR的亲和力及对肿瘤细胞增殖的抑制能力。
QFRKRKKSRYPK ； SEQIDN0:1QKRKRKKSRYPK；SEQIDNO2QFRKRKKSRYPS；SEQIDNO3QKRKRKKSRYKY；SEQIDNO4QFRKRKKSRffKS；SEQIDNO5QKRKRKKSRYKK；SEQIDNO6QFRKRKKSRYKS；SEQIDNO7FFRKRKKSRYKS；SEQIDNO9QFRKRKKSRYKH；SEQIDNO10QFRKRKKSRYLS；SEQIDNO12QFRKRKKSRYKF；SEQIDNO13
RKRKRKKSRYIVLS ；SEQ ID NO:19 QKRKRKKSRKKH ；SEQ ID NO:20 QKRKRKKSRYLS ；SEQ ID NO:21 QHKRKRKKSRIVL ；SEQ ID NO:22 KFRKRKKSRYIV ；SEQ ID NO:23 IVFKRKRKKSRYLS ； SEQ ID N0:24 RKRKRKKSRKKH ；SEQ ID N0:25 KKRKRKKSRKRK ；SEQ ID N0:26 QKRKRKKSRYRK。 SEQ ID NO:27。本实施例公开的多肽序列中，其中部分多肽(如SEQ ID N0:19和如SEQ ID N0:20 所示的多肽)相对于亲本多肽VEGF125_U6 (如SEQ ID N0:18所示的氨基酸序列)，在保持 VEGF125^136的U6-133号位置的氨基酸不变的条件下增加或替换为碱性亲水氨基酸R、K、H 中的任一个或多个，或/和加入强疏水片段I、L、V中的任一个或多个，所述多肽的序列长度为 12-14。
实施例2 20条多肽亲和力的测定
采用体外受体竞争结合实验，以IC50值来反应亲和力的大小，IC50越小，说明亲和力越高。一实验步骤
1、125I-VEGF165 的准备(购自 perkinelmer 公司)=125I-VEGF165 的总化学量为 4. 88pmol (0. 185 μ g)，分子量为38000，放射性活度为25uCi，放射性浓度约为50uCi/ml，化学浓度约为 0.37yg/ml (9. 76pmol/ml)。2、多肽的准备
合成顺序从C端到N端，步骤如下
1)称取η当量树脂放入反应器，加入DCM (二氯甲烷)溶胀30min，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸2η当量，加2η当量的DIEA( 二异丙基乙胺)，适量的DMF(二甲基甲酰胺)，DCM (适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，氮气鼓泡反应60min。然后加入约 5n当量甲醇，反应30min，抽掉反应液，用DMF，meOH洗净。2)往反应器中加入序列中第二个氨基酸(2η当量)，2η当量HBTU (1 一羟基，苯并，三氯唑四甲基六氟磷酸盐)及DIEA，氮气鼓泡反应30min，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除Fmoc (9-芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测。3)依步骤2的方式依次加入序列中不同的氨基酸。4)将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以IOml/克的比例)的切割液(95%TFA，2%乙二硫醇，洲三异丙基硅烷，1% 水)，震荡2 h。(目的是将多肽从树脂载体上裂解下来和去除各个保护基团)
5)滤掉树脂，得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物。6)提纯用高效液相色谱将粗品提纯至95%的纯度。7)纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末，所述白色粉末为实施例1 “三、初步改造结果”的20条多肽。3、竞争结合实验。1)A549细胞以3. 3 X IO4/孔的密度接种于M孔板，每孔培养基lml，置于37 °C， 5%C02孵箱中培养M h，弃培养液，并用PBS洗涤后加入无血清培养基。2)每个培养孔中分别加入VEGF125_136及实施例1所述的20条新筛选得到的多肽， 化学量分别为0，1.3 nmol/L，6. 5 nmol/L，32. 5 nmol/L ,65 nmol/L，650 nmol/L，6500 nmol/L (双复孔)；
3) 4°C静置 30 min。4)加入 125I-VEGF165 每孔中加入标记物 20 μ 1 (50nCi，0. 37 ng)，4°C孵育 2 h。5)倒置显微镜观察，弃上清，预冷的PBS (含0. 1%BSA)洗3次，每次^il,胰酶消化后收集细胞，并用PBS洗涤2次，每次Iml。6) γ免疫计数器测细胞的放射性计数cpm。7) SPSS 软件计算 IC50。(二)结果
实施例1中“三、初步改造结果”的20条多肽均能竞争抑制125I-VEGF与VEGFR的结合 (见表 1)，其中多肽 QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS 的 IC50 值分别为 80 nmol/L (详见图 2),185 nmol/L (详见图3)，明显低于亲本多肽VEGF125_136的464nmol/L(详见图1)。即多肽 QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS 与 VEGFR 的亲和力较 VEGF125_136 提高了近 6 倍及 2. 5 倍。


本发明涉及蛋白质领域，特别涉及能与血管内皮生长因子受体特异结合的多肽，所述多肽相对于如SEQIDNO:18所示的亲本多肽VEGF125-136的氨基酸序列，在保持其126-133号位置的氨基酸不变的条件下增加或将其它位置的氨基酸替换为碱性亲水氨基酸R、K、H中的任一个或多个，或/和加入强疏水片段I、L、V中的任一个或多个，所述多肽的序列长度为12-14，它们较VEGF125-136的亲和力分别高近6倍及2.5倍，且能够明显抑制肿瘤细胞的增殖；所述多肽可以运用于制备血管内皮生长因子拮抗剂及肿瘤细胞生长抑制剂。