专利名称：人工韧带的制作方法交叉韧带损伤后愈合能力极差，目前临床重建交叉韧带使用的材料包括自体移植物、异体移植物和人工合成材料。自体和异体移植物重建交叉韧带依然是目前的主流选择， 常见的自体骨-髌腱-骨移植具有较高的强度，在附丽位点能够获得骨骨或腱骨愈合。但对自体供区会继发膝前疼痛、髌腱炎、髌下脂肪垫挛缩、相应部位髌骨骨折、绳肌缺失等并发症。异体移植材料存在来源少、免疫排斥反应、生物长入延迟甚至传播疾病的危险。因此， 长期以来，组织工程人工韧带的研究从未停止。理想的人工韧带必须满足以下要求(1)良好的生物相容性，无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥反应；(2)可控的生物降解与吸收性，降解与吸收速率应与细胞或组织生长速率相适应；(3)一定的机械强度，在植入人体后即可发挥人工韧带的即时抗张功能，提供正常韧带的功能，满足人正常生理活动的需要。目前，已通过欧洲CE认证和中国SFDA认证，并应用于临床的比较成熟的人工韧带只有LARS人工韧带，其于1994年开始应用于临床。通常临床应用的LARS人工韧带是由聚酯纤维编织而成，但聚酯纤维不可降解，不是理想的组织工程材料。
有鉴于此，本发明提供了一种人工韧带，该人工韧带具有优良的生物相容性和力学性能，植入人体后有利于韧带的重建，能提供正常韧带的功能，满足人正常生理活动的需要。本发明的人工韧带，该人工韧带由I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维编织而成。进一步，所述I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维中含有109Γ50% (重量)的I型胶原蛋白和509Γ80% (重量)的聚乙烯醇；进一步，所述I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维由原液制备、湿法纺丝、凝固和热拉伸定型的工艺步骤制备得到；进一步，所述I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维的纤度为广15dtex，断裂强度为广10cN/dtex，断裂伸长率为10% 40%，初始模量为30 100 cN/dtex ；
进一步，所述人工韧带包括股骨部分、关节内部分和胫骨部分，所述关节内部分由纵向排列的I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维组成，所述股骨部分和胫骨部分由I型胶原蛋白 /聚乙烯醇共聚纤维3D经纬编织而成。本发明的有益效果在于1型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维力学性能优良，且细胞相容性好，无细胞毒性，细胞在其上生长良好，并附着生长，I型胶原蛋白和聚乙烯醇在体内都可以完全生物降解；本发明的人工韧带采用I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维编织而成，其力学性能与人体韧带相近，能提供正常韧带的功能，满足人正常生理活动的需要，且生物相容性好，植入人体后允许再生新韧带长入，移植物可降解，其降解产物对人体无害并能排除体外，有利于韧带的重建。


为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图1为倒置显微镜下50%1型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维组细胞生长情况； 图2为倒置显微镜下100%1型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维组细胞生长情况； 图3为倒置显微镜下空白对照组细胞生长情况； 图4为倒置显微镜下阳性对照组细胞生长情况； 图5为倒置显微镜下6板孔内细胞生长情况；
图6为倒置显微镜下细胞在I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维上生长情况； 图7为SEM观察细胞在I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维上生长情况。

将一定比例的聚乙烯醇和水，98°C下搅拌溶解池，溶液呈无色透明状；同时，将一定比例的I型胶原蛋白和水于68 7(TC下搅拌溶解。将分别溶解好的I型胶原蛋白水溶液和聚乙烯醇水溶液按一定比例混合，并加入一定量的连接剂四硼酸钠于78、2°C下进行处理， 随后在75°C下脱泡，最终得到纺丝原液。脱泡后的纺丝原液，在7(T8(TC下保温，并经调压罐调压，即送入纺丝机经喷丝孔成丝，丝束进入凝固浴凝固并牵伸，然后经过220°C热拉伸， 2. 5min热定型后制得I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维。控制纺丝原液中I型胶原蛋白水溶液和聚乙烯醇水溶液的比例，使最终得到的I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维中含有 109Γ50% (重量)的I型胶原蛋白和509Γ80% (重量)的聚乙烯醇。上述方法所得到的I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维的纤度为广15dtex，断裂强度为广lOcN/dtex，断裂伸长率为10% 40%，初始模量为30 100 cN/dtex。当然，I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维的制备并不局限于上述方法，其它化学纤维的制备方法均可适用。一.用MTT法和直接接触法检测所述I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维的细胞相容性
MTT比色法和直接接触法是细胞相容性实验中最常用的方法，目前广泛的应用于生物医学的多个领域。MTT法的生物学终点是线粒体，由线粒体琥珀酸脱氢酶将MTT分子还原， 生成不溶于水的蓝紫色结晶物(Formazan)，而死细胞则不能进行还原，通过化学发光仪检测其吸光度OD值，即可反映出存活细胞的数量，因此可以准确的反映出实验材料对细胞造
4成的毒性损害程度，并能对材料的细胞毒性做出定量评价。MTT法对试验材料的毒性有较高的敏感性，且比较符合动物体内的毒性实验结果，因此成为一种较好且常用的体外评价材料细胞毒性的方法。直接接触法能直观的观察细胞与实验材料接触后的生长情况，并可观察细胞能否在试验的支架材料上生长、增殖，弥补了 MTT法对细胞形态观察效果不佳。这两种方法的联合使用可以较准确的反映试验材料对细胞造成的毒性反应。
1.用MTT法测定小鼠成纤维细胞(L-929)在I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维浸提液中培养l、2、3、4、5、6、7d的吸光度OD值，计算细胞相对增殖率(Relative Growth Rate，RGR)，判定细胞毒性的级别。具体步骤如下
将实验分为空白对照组、阳性对照组、实验组(I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维组)
1)I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维浸提液的制备
按细胞培养液(浸提介质)与I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维表面积之比为lml/cm2 的标准在37°C，5%C02，湿度95%的无菌条件下浸提4 作为浸提液，加样前加入10%FBS，并配制成50%和100%浓度的I型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维浸提液；
2)接种
将对数生长期的细胞经0. 25%胰蛋白酶消化、吹打成悬液后计数，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制成浓度5 X 104个/ml的细胞悬液，用移液器吸100 μ 1接种于96孔板(S卩5000个细胞/孔)，四周边缘孔不接种细胞，只加入150 μ 1的DMEM培养液，做封闭；
3)加样
细胞接种24h观察见细胞贴壁后，取出96孔细胞培养板，弃原培养液；实验组加入含 10%FBS的50%和100%1型胶原蛋白/聚乙烯醇共聚纤维浸提液，200 μ 1/孔；空白对照组加入含10%FBS的DMEM，200 μ 1/孔;阳性对照组加入0. 5%苯酚溶液(10 μ 18ml/L), 200 μ 1/ 孔；四周边缘孔加入DMEM，200 μ 1/孔；将96孔细胞培养板放入37 °C，5%C02培养箱继续培养每天用倒置显微镜观察各组细胞的生长情况。于加样后的l、2、3、4、5、6、7d分别取出96 孔细胞培养板，弃旧培养液，更换新鲜培养液100 μ 1/孔，在加入MTT液20 μ 1/孔后，置于 370C，5%C02培养箱4h，弃旧液，加入DMS0150 μ 1/孔，用移液器吹打得悬液后用酶标仪测定吸光度OD值，测定波长为490nm，并计算相对增殖率(relative growth rare, RGR)，公式 实验组OD值/空白对照组OD值X 100% ；
4)评价标准
根据RGR值，按下表评分标准评定材料毒性程度级别


本发明公开了一种人工韧带，该人工韧带由I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维编织而成；I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维力学性能优良，且细胞相容性好，无细胞毒性，细胞在其上生长良好，并附着生长，I型胶原蛋白和聚乙烯醇在体内都可以完全生物降解；本发明的人工韧带采用I型胶原蛋白∕聚乙烯醇共聚纤维编织而成，其力学性能与人体韧带相近，能提供正常韧带的功能，满足人正常生理活动的需要，且生物相容性好，植入人体后允许再生新韧带长入，移植物可降解，其降解产物对人体无害并能排除体外，有利于韧带的重建。