专利名称：用于检测分枝杆菌的引物和pcr-dhplc试剂盒的制作方法分枝杆菌属(Mycobacterium)，除结核分枝杆菌复合群(包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)和麻风分枝杆菌外，统称为非结核分枝杆菌。据目前所知，自然界中有致病性和非致病分枝杆菌共200多种。结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织(WHO)专门发布了全球结核控制战略，并把每年的3月M号定为世界防治结核病日。结核分枝杆菌复合群 (Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)是人及哺乳动物的结核病原菌，包括结核 ^feff · ( X^AM^WM^tfM, Mycobacteriumtuberculosis, Μ. tuberculosis), 41^ 枝杆菌(牛型结核分枝杆菌，Mycobacteriumbovis, M. bovis)，卡介苗 BCG (Mycobacterium bovis BCG，BCG)，非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum, Μ. africanum)和田鼠分枝杆菌(Mycobacteriummicroti，M. microti)。其中，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌为主要的人畜结核致病菌。与结核分枝杆菌复合群对应的是各种非结核分枝杆菌，目前已发现上百种，广泛存在于土壤、环境、动物中。临床上，各种非结核分枝杆菌感染患者的临床症状及病理变化与MTC引起的结核病极为相似，但多数非结核分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性；因此， 鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染在临床诊疗中就有着非常重要的作用。由于非结核分枝杆菌感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性，因此准确鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染对动物结核病确诊也非常重要。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，我国现有活动性肺结核患者451万，菌阳肺结核患者196万。分枝杆菌培养阳性者中，结核分枝杆菌占86. 4%，牛结核分枝杆菌占2. 5%，非结核分枝杆菌占11. 1%。而1990年第三次全国结核病流调时非结核分枝杆菌仅占4. 9%，由此可见，非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。非结核分枝杆菌患者对大多数一线抗结核药物耐药，采用目前标准的化疗方案治疗无效。传统的分枝杆菌菌种鉴定和药敏实验方法建立在培养基础上，烦琐、费时，需1 2月时间，不能满足临床开展早期有效化疗的需要，使非结核分枝杆菌患者经长期规则化疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治患者，细菌可能在局部播散。因此，分枝杆菌的快速鉴定对结核病的早期诊断、 鉴别诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。目前国内外用于诊断分枝杆菌的检验方法，大体上可分为3类第一类是细菌学检验方法，如染色镜检、细菌培养和动物接种等；第二类是采用免疫学方法检测结核菌的特异性抗体，如皮内变态反应、酶联免疫吸附实验(ELISA)和补体结合实验(CF)方法等；第三类是采用分子生物学检验方法，如PCR-RFLP、PCR-核酸探针、多重PCR等。由于分枝杆菌生长缓慢，细菌分离培养周期长(常需数周时间)，传统的细菌学检查方法难于适应进出境检验检疫快速通关需求，也不利于疾病临床诊疗。皮内变态反应是世界动物卫生组织(OIE)推荐的牛结核病诊断方法，也是目前在进出境动物检疫、牛结核病疾病防控、根除等方面常采用的方法，但由于试剂质量以及非典型分枝杆菌的干扰等原因，常造成非特异性反应。ELISA和CF方法等免疫学方法在特异性方面尚存在争议，国内目前尚缺乏可靠的免疫学诊断试剂。随着分子生物学技术的发展，国内外众多实验室开展了结核、副结核PCR方法研究，但检测方法和试剂盒缺乏规范化、标准化是影响PCR结果准确性的关键。世界卫生组织于2006年10月发表报告指出，世界迫切需要投资研究更有效和费用更低的结核病诊断方法，尽早发现病情尽早治疗，以减少这种疾病对人类、特别是对发展中国家人口的危害。
本发明的主要目的在于，提供一组检测分枝杆菌的核苷酸序列。本发明的又一目的在于，提供一种针对分枝杆菌的检测试剂盒，具体而言，提供一种分枝杆菌pcr-dhplc检测试剂。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一对用于检测分枝杆菌的引物，其特征在于，其中的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。一组用于检测分枝杆菌的核酸，其特征在于，该组核酸包括核苷酸序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物对，以及作为阳性对照的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的PCR扩增产物；一种用于检测分枝杆菌的PCR-DHPLC试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR 缓冲液；检测分支杆菌的上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；检测分支杆菌的下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；dNTP ；MgCl2 ；Taq DNA 聚合酶；双蒸水； 阴性对照灭菌生理盐水；阳性对照携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQID No. 3所示。如上所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在应用时，按照以下终浓度配置PCR 反应液10 X PCR 缓冲液；0. 2 μ mol/L检测分支杆菌的上游引物；0. 2 μ mol/L检测分支杆菌的上游引物；0.2 μ mol/L 探针；0. 2mmol/L dNTP ；2. 5mmol/L MgCl2。 通过对引物、Mg2+浓度、Taq酶浓度以及PCR变性和退火温度的优化，建立了最适的PCR反应体系和PCR反应条件。PCR-DHPLC检测试剂盒最适PCR反应体系见下表1。 表1PCR-DHPLC检测试剂盒最适PCR反应体系本发明涉及一对用于检测分枝杆菌的引物，其中的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。一种用于检测分枝杆菌的PCR-DHPLC试剂盒，包括PCR缓冲液；检测分支杆菌的引物对；dNTP；MgCl2；Taq DNA聚合酶；双蒸水；阴性对照灭菌生理盐水；阳性对照携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明提供了一种快速检测分枝杆菌感染的试剂盒及应用该试剂盒的PCR-DHPLC检测方法，其特异性好，灵敏度高，操作简单，高通量，对于临床辨别分枝杆菌感染与其它致病原具有重要实用意义。