专利名称:用叶下珠定向刺激免疫系统的制作方法图1是1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼(DPPH)和本发明叶下珠萃得物的自由基清除实验结果;图2是DPPH和维生素C的自由基清除实验结果,用作比较;图3是DPPH和α-生育酚的自由基清除实验结果,用作比较;图4是溴化3-[4,5-二甲基噻唑-2-噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓(MTT)和本发明叶下珠萃得物的自由基清除实验结果;图5是MTT与维生素C的自由基清除实验结果,用作比较;图6是细胞色素和本发明叶下珠萃得物的自由基清除实验结果,用作比较;图7是细胞色素与维生素C的自由基清除实验结果,用作比较;图8是3′[1-[(苯基氨基)-羰基]-3,4-四唑鎓]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠水合物/吩嗪硫酸二甲酯(XTT/PMS)和本发明叶下珠萃得物的自由基清除实验结果;图9是XTT/PMS与维生素C的自由基清除实验结果,用作比较;图10是叶下珠萃得物对LPS诱导的MNC的作用(萃得物1-4);图11是叶下珠萃得物对LPS诱导的MNC的作用(萃得物5-6);图12是作为对照的内毒素检测;图13是叶下珠萃得物对非诱导MNC的作用(萃得物1-4);图14是叶下珠萃得物对非诱导的MNC作用(萃得物5-6);图15是叶下珠萃得物对树状细胞的作用(LAT NO.00120514);图16是叶下珠萃得物对树状细胞的作用(LAT NO.00130514);图17是叶下珠萃得物对树状细胞的作用(LAT NO.00140514);图18是叶下珠萃得物对树状细胞的作用(LAT NO.00150514)。实施例1本发明干燥萃得物的制备(组分1;批号9810H)由2kg印度Madras Phyllanthus amarus药用部分制取450g粉末。该450g粉末在Soxhlet仪中用3L蒸馏正己烷蒸馏萃取12小时。过滤并真空蒸发后制得25g干燥的正己烷萃得物,其中的主要组分是亲脂性的木酚素、甾醇和色素。该萃得物呈灰棕色糊状,不溶于水和甲醇,可溶于乙酸乙酯。实施例2干燥甲醇萃得物的制备(组分2;批号9810M)在Soxhlet仪中,用3L蒸馏甲醇继续萃取实施例1中不溶于正己烷的残留植物残渣12小时。过滤并真空蒸发后得50g干燥的甲醇萃得物。其中的主要组分是类黄酮、寡聚棓单宁和酚羧酸。该深棕色粉末不溶于水,几乎全溶于甲醇。实施例3水性上清液的制备(组分3;批号9810W)将甲醇萃取(实施例2)后的不溶性植物残渣(约375g)浸泡在2.5L热蒸馏水中,低温(4℃)浸泡12小时。然后滴加2.5L乙醇(100%(=1∶1))以沉淀出高分子量的二糖和糖蛋白,然后7500rpm超离心分离。上清液经冷冻干燥得15g干物质。其主要组分是寡聚棓单宁和其它水溶性聚合物。所得是一种红棕色粉末,可溶于水,不溶于有机溶剂。实施例4水沉淀物的制备(组分4批号9810pp)将实施例3中的乙醇沉淀和离心分离所得聚合物溶于热水,冷冻干燥。于是,由450g粗制粉末起始物制得了5g萃得物。其主要组分是高分子量的多糖和糖蛋白。所得产物呈棕色粉末,不溶于水。实施例5无叶绿素甲醇粗提物的制备(组分5批号9901Mcf;P1159)在Soxhlet仪中,用500ml蒸馏甲醇12小时萃取100g由药用部分制得的叶下珠粉末。过滤并真空蒸发得15g干燥萃得物,将其溶于300ml热的蒸馏水/甲醇1∶1混合物。在80℃水浴,间或搅拌,将该溶液浓缩至一半体积。通过纤维素纸热(80℃)过滤去除油状沉淀。在滤液中加入热(80℃)蒸馏水至300ml,再过滤。滤液经冷冻干燥得约10g干燥甲醇萃得物,其外观呈棕色糊状,可溶于甲醇。实施例6无叶绿素水萃得物的制备(组分6批号9901Wcf)在80-100℃的水浴中,用500ml蒸馏水1小时萃取由药用部分制得的50g叶下珠粉末,间或搅拌。用纤维素纸过滤热溶液。在(约400ml)滤液中加入100ml蒸馏甲醇。在80℃水浴,间或搅拌,将混合物蒸发至一半体积。用纤维素纸趁热(80℃)过滤去除油状沉淀。滤液经冷冻干燥得3g干燥水萃得物。该萃得物为红棕色粉末,可溶于甲醇。实施例7DPPH自由基清除实验将实施例5制得的本发明萃得物P11599配制成7种不同的浓度,用自由基清除实验研究其捕获自由基的能力。即测定515nm处稳定自由基DPPH(1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼)与相应非自由基性1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼之间的颜色改变。为此必须将被测物质的DMSO系列稀释液与DPPH的甲醇溶液在37℃保温30分钟,然后测定颜色改变,该实验进行一式两份。根据结果计算SC50,即DPPH的自由基50%被捕获时的样品浓度。用DMSO作为阴性对照,维生素C作为阳性对照,还对α生育酚进行了测定。经测定,P11599的SC50为6.2μg/ml,维生素C的为10μM,α生育酚的为18μM(参见图1-3)。由此可见,作为自由基清除剂,P11599优于α生育酚,与维生素C相当。实施例8MTT自由基清除实验10.6mM浓度的MTT(溴化3-[4,5-二甲基噻唑-2-噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓)与不同浓度的本发明实施例5萃得物P11599或与作为参照的维生素C在37℃保温1小时,然后用光度法测定因样品作用引起的吸光度改变。结果显示,P11599具有极高的抗氧化能力,接近于较强的还原剂维生素C(参见图4和5)。实施例9细胞色素C自由基清除实验150μM细胞色素C与不同浓度的本发明实施例5萃得物P11599或与作为参照的维生素C在37℃保温0.5小时,然后用光度法测定因样品作用引起的吸光度改变。结果显示,P11599具有极高的抗氧化能力,接近于较强的还原剂维生素C(参见图6和7)。实施例10XTT/PMS自由基清除实验500μM/0.21μM的3′[1-[(苯基氨基)-羰基]-3,4-四唑鎓]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠水合物/吩嗪硫酸二甲酯(XTT/PMS)与不同浓度的本发明实施例5萃得物P11599或与作为参照的维生素C在37℃保温1小时,然后用光度法测定因样品作用引起的吸光度改变。结果显示,P11599具有极高的抗氧化能力,接近于较强的还原剂维生素C(参见图8和9)。实施例11单核细胞(MNC)的制备用50ml Perfusor针筒的蝴蝶针抽取空腹健康人的血样,刺人在此前14天中没有用过药,每10ml血样中加入100μl肝素。室温下在Lekosept Bluecaps中加入15ml Ficoll-Hypaque,1000g离心2分钟。Ficoll集于分离盘下。用针筒加入15ml上述肝素化血样,然后加入15ml无菌0.9%NaCl溶液。最后,20℃、2200rpm离心15分钟。于是,从上到下分层如下血浆/MNC环/Ficoll/分离盘/Ficoll/红细胞等。用移液管吸取MNC环,加入Bluecaps,加NaCl溶液至50ml。然后将此洗涤三次,每次都用等渗盐水重悬细胞沉淀,然后离心。每次倾出上清液。留下的细胞沉淀即MNC,加入MNC培养基。实施例12叶下珠对特异性表面分子表达的刺激将新鲜分离的MNC培养于培养皿中的营养培养基中。然后用白介素4(500U/ml)和GM-CSF(1000U/ml)刺激,MNC于是进一步发育为树状细胞。培养6天后,细胞表现出典型的树状细胞形态,并表达HLA-DR、CD54(ICAM-1)、CD80(B7.1)和CD86等表面分子(标志)。这些标志是树状细胞的特征。加入TNF等细胞因子可进一步增强树状细胞标志的表达。经如此处理,树状细胞可表达成熟的标志CD83,未受刺激的细胞是不表达该标志的。经一系列实验发现,不同的叶下珠萃得物均能刺激树状细胞标志的表达。以上实验结果可参见图15-18。实施例13对TNFα合成刺激作用的测定将实施例11所得MNC与不同浓度的本发明实施例1-6的样品共培养,用ELISA测定TNFα浓度。48孔培养板的每孔中加200μl MNC悬液,浓度为5×106个细胞/ml MNC培养基(RPMI培养基+1%L-谷氨酰胺+1%AB血清+1%青霉素/链霉素+1%人白蛋白+1%HEPES),向其中加入100μl LPS溶液(40ng/ml NMC培养基)和100μl叶下珠稀释液。叶下珠稀释液为实施例1-6萃得物的稀释液,稀释度为500、100、10、1和0.1μ/ml,由储备液制得。作为对照,用MNC培养液取代100μl叶下珠稀释液。48孔培养板在培养箱内37℃培养20小时,然后于-80℃冷冻,经3轮冻融循环后进行TNFα试验。用ELISA测定所得TNFα浓度,以抗人TNFα作为第一抗体,抗TNF-Bi作为第二抗体,利用450/690nm处的颜色反应。结果,本发明的某些萃得物显著刺激LPS引起的TNFα合成(图10,11)。然而,部分萃得物中含有内毒素(Endosafe Inc.USA的LAL测试测得;图12)。所以,作为该试验的继续,在脱毒柱上对萃得物继续纯化。该柱先用5ml 1%脱氧胆酸盐溶液、5ml水和5ml生理盐水洗涤。然后上样,暗培养2小时,然后用生理盐水洗脱。内毒素留在柱上。各活性萃得物4、5和6即使在去除内毒素后仍表现出明显的TNFα合成作用。
若取消LPS刺激仍可获得类似的结果。此时,与以上实验一样,用未纯化的叶下珠稀释液,但用100μl MNC培养基代替100μl LPS溶液(参见图13,14)。
以上结果显示本发明的萃得物可显著刺激TNFα的合成。
本发明涉及用叶下珠定向刺激免疫系统,最好是刺激肿瘤坏死因子、树状细胞和吞噬细胞。
用叶下珠定向刺激免疫系统制作方法
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