利用叶下珠治疗慢性炎性和纤维化过程制作方法

H·瓦格纳, A·沃尔马, M·曼斯, R·格布哈特, M·巴尔, G·H·布尼希恩

2002年8月14日

2000年4月28日

1999年4月29日

西迈医药创新中心股份公司

A61K36/185GK1364085SQ00806854

叶下珠 炎性 纤维化 慢性 治疗 利用

1.叶下珠预防或治疗结缔组织增生，尤其是肝脏纤维化的用途2.叶下珠用于维持还原型谷胱甘肽水平的用途3.根据权利要求1或2所述的用途，其减少了平滑肌α-肌动蛋白(SMA)mRNA的表达4.根据权利要求1或2所述的用途，其减少了平滑肌α-肌动蛋白的表达5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，所述平滑肌α-肌动蛋白(SMA)表达减少发生在肝星形细胞中6.根据权利要求5所述的用途，其中将活化肝星形细胞转化为非活化肝星形细胞7.叶下珠用于抑制脂多糖(LPS)诱导型一氧化氮合成酶(NOS)的用途8.根据权利要求7所述的用途，其抑制诱导型NOS蛋白(iNOS)的表达9.叶下珠用于抑制环加氧酶(COX-2)蛋白的表达的用途10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，所用的是自叶下珠分离的组分11.根据权利要求1至10中任一项所述的用途，所用的是自叶下珠分离的一种或多种化学物质，尤其是活性成分12.根据权利要求1至11中任一项所述的用途，所述叶下珠选自amarus叶下珠，霸贝菜，油柑，刺果叶下珠，myrtofolis Moon叶下珠，maderas patensis叶下珠和/或ussuriensis叶下珠13.根据权利要求1至12中任一项所述的用途，其中使用叶下珠的叶，树皮，花，种子，果实，茎，枝，干，根和/或木质部分，更佳的是药用部分14.根据权利要求1至13中任一项所述的用途，所用的是叶下珠的粉碎后或未加工形式，例如颗粒，粉末，沉淀物，萃得物，干燥萃得物和/或浸出物，优选萃得物和干燥萃得物15.根据权利要求14所述的用途，其中使用水、非极性溶剂、较好的是用C5-C10支链的或非支链的烃或其混合物，较好的是正己烷，和/或醇萃取液，尤其是C1-C4短链伯醇或其混合物，尤其是甲醇或乙醇16.根据权利要求1至15中任一项所述的用途，所用的剂型是输液剂，注射剂，片剂，颗粒剂，药膏，药贴，灌肠剂和/或食品补充剂17.根据权利要求1至16中任一项所述的用途，所用的剂型是口服，局部使用和/或胃肠外给药18.根据权利要求1至17中任一项所述的用途，除叶下珠外还使用其他活性物质和和/或合适的添加剂和/或助剂19.根据权利要求18所述的用途，其中使用抗坏血酸和/或α-生育酚

本发明涉及使用叶下珠来预防和治疗结缔组织增生，维持还原型谷胱甘肽的水平，抑制脂多糖诱导型一氧化氮合成酶和抑制环加氧酶(COX-2)蛋白的表达叶下珠属种类繁多，原产于印度中部和南部，台湾，和美洲的中部和南部区域本发明中，叶下珠包括所有叶下珠属的代表性品种，如霸贝菜，amarus叶下珠等印度的民间药物中已将叶下珠用于治疗多种疾病例如，“K.M.Nadkarni的印度医药(第三版，A.K.Nadkarni修订及增补)”第一卷中认为其具有轻泻、利尿、收敛和清凉的作用类似的，含叶下珠的组合物也被用以治疗黄疸，水肿，淋病，月经过多，和其他相类似的与泌尿生殖道相关疾患已知可用从树干中取得的汁液和油混合作为眼药或治疗溃疡，伤口和红肿等，同样叶子也可治疗骚痒或其他皮肤损伤而且，已知可以从叶下珠中提取多种活性物质叶下珠脂素，次叶下珠脂素，三十烷醇，三十烷醛，repandusinic酸A(参见JP03206044 A；艾滋病-研究-人-逆转录病毒(11/1992)，第8卷(11)，HIV-1逆转录酶…)，phyllanthostatin-1，叶下珠甙，phyllanthocin，phyllanthocin酸(参见EP173 4480；US4,388,457)，叶霉素(phyllamycin)A、B、和C，反爵床脂素(retrojusticidin)B，爵床脂素(justididin)A，B(参见艾滋病周报，25.9.95，艾滋病治疗文摘…)，亚麻酸，亚油酸和蓖麻油酸(参见美国油脂化学家学会杂志81.06.00版，nirure叶下珠中的蓖麻油酸…)，phyllamyricinD，E和F，phyllamyricosideA，B和C(参见天然产物杂志，(11/1996)，vol.59，(11)6种木酚素从…)，putranjivain A(参见化学制药通报(东京)，(04/1995)，vol.43(4)，埃及的…抑制作用)，ursulic酸和niruriside(参见天然产物杂志，02/96 vol.59(2)，Niruriside，一个新型HIV…，Rec.Tray.Chim.(06/1996)，…的合成)迄今已知的治疗效用包括延缓衰老(参见JP08176004)，预防和治疗免疫缺陷疾病如艾滋病，流感，伤风，结核，肝炎，肝硬化(参见US5,529,778；艾滋病周报增刊05.08.96，抗病毒(药物开发)；抑制HIV…)，抗肿瘤(参见US4,388,457)，治疗HIV，乙型肝炎病毒和/或丙型甘油病毒感染，特别是，卡氏肉瘤的局部疗法(参见EP 1734480；US 5,466,455)，蛋白酶抑制剂，弹性酶抑制剂和增白效应(参见JP 09087136)，止痛和消炎效果，酪蛋白酶抑制剂(参见JP 08012566)和与其他植物萃得物联用作为抗感染药物而且，还可用于化妆品中综上所述可知，叶下珠是一类众所周知可用以治疗多种疾病的药用植物有一种病理似乎与多种其他疾病相关，即所谓氧化性应激即有毒的氧化物的累积造成对活细胞的刺激，所述氧化物例如过氧化氢脂质，过氧化氢、单线态氧、羟基/超氧化物阴离子也可能由原位产生或外部进入的自由基引起这些刺激，尤其是所谓的反应性氧(ROS)和过氧亚硝酸根自由基等氧化性应激也可由诸如辐射侵害，生物异源物质和重金属离子侵害或缺血/再灌注(暂时性的向某一组织供血受阻)造成在后一种情况中，很多形式的过氧化物离子是由黄嘌呤氧化酶产生的，该酶是一种分子量为300KD的氧化酶，属于黄素蛋白，催化嘌呤的裂解，因为它的天然的电子受体是氧在生理状态下，这些超氧化物阴离子被超氧化物歧化酶灭活，但在再灌注过程中，这会产生大量的氧自由基氧化性应激对多种急性尤其是慢性疾病的发展起着重要作用，所述疾病例如各种类型的炎症，微血管疾病，纤维化疾病，类风湿关节炎和其他风湿疾病，动脉硬化(低密度脂蛋白(LDL)的氧化)，肿瘤的发展及恶化，老年痴呆症倾向，如扑热息痛的肝损伤等药物引起的急性损伤肝脏，作为人体重要的动力器官，在大量生理及微生理过程中起着重要作用，肝脏的代谢活动(中间代谢)具有重要作用，一方面因为其对其他组织的供给作用，另一方面在于其对药物的化学转化(生物转化)作用(见Pschyrembel，KlinischesW?rterbuch，de Gruyter Verlag，1986.pp.935-937)氧化性应激可能主要发生在肝脏这包括一个由多种抗氧化剂还原型化合物组成的库例如L-抗坏血酸，类胡萝卜素，二氢硫辛酸，尿酸，谷胱甘肽或α-生育酚，通过多种酶的活性来避免自由基的产生(例如超氧化物歧化酶，过氧化物酶，象谷胱甘肽过氧化物酶，过氧化氢酶等)氧化性刺激同时对肝脏器官的很多功能都有不良影响肝脏对这种刺激的反应常常是结缔组织增生，这会进一步发展为永久性肝损伤，例如发展为肝癌在这方面，胆酸与肝损伤的病理过程尤其相关对肝脏的明显损伤会逐步地将瘢痕损伤发展为完全的死亡而导致机体的死亡在上述所有的疾病中，细胞和组织中氧化刺激和防御体系的平衡很重要其重要的预防和治疗意义在于，一方面使健康的肝脏免受氧化性刺激，另一方面增强病害的肝脏使之能战胜已存在的氧化性刺激具有肝脏保护作用的化合物有时却是有害的，因为它们会因毒性太大而不适用于已患病的肝脏本方面的目标在于，制造一种物质能作用于肝脏，并具有预防和治疗的作用本发明涉及使用叶下珠来预防和治疗结缔组织增生，尤其是诸如肝脏、肺、肾、胰脏、小肠、内分组织、脾脏、男性或女性的泌尿生殖道、关节的纤维变性，诸如一些慢性炎症例如类风湿关节炎，或慢性心肌疾病，和肝硬化(纤维化病变的晚期)本发明的用途特别适用于纤维化和肝硬化，尤其是肝纤维化的肝硬化在这方面，慢性炎症会造成组织萎缩和严重的疤痕形成，导致进行性组织功能丧失因此，抑制或避免结缔组织增生可减少的严重的疤痕形成，并保持器官功能叶下珠预防和改善肝纤维化的活性可能来源于抗氧化效应，肝脏的纤维化通常是由病毒感染造成例如，所有已知的肝炎病毒(A，B，C，D，E，也许还有G型肝炎)对肝细胞有很强的指向性据推断，即使是现用的抗病毒药物也不能清除病毒，而只能抑制其复制(病毒抑制作用)即使病毒在外周血中已消失了(低于可测水平)，但在肝组织中经常还可检测到这样，叶下珠可以通过其预防和治疗效应在肝再生中发挥有益的作用这有助于通过降低肝中结缔组织增生而削弱慢性炎性过程此前还没有发现能在如此早的阶段抑制退行性进程的药物本发明还涉及使用叶下珠维持还原型谷胱甘肽的水平出人意料的是发现叶下珠的萃得物对肝中的还原型谷胱甘肽水平有很强的维持作用实验中发现，在因叔丁基过氧化氢引起脂类过氧化作用增强的肝功能细胞(肝细胞)中，加入叶下珠的萃得物不仅能抑制脂质过氧化的进一步发展，还能几乎完全消除内源性的脂质过氧化在与未经处理的比较实验中，可看到肝细胞中还原能力的明显增强，提示改善了胞内还原型谷胱甘肽水平的维持在一个更好的实施例中，叶下珠用于减少平滑肌α-肌动蛋白(SMA)mRNA和SMA蛋白的表达在纤维化的肝脏中，其细胞分裂加快，发生胞外基质的累积就肝硬化而言，这种胞外基质的累积对肝纤维化的进一步发展十分重要胞外基质的累积源于一种特殊的肝细胞—肝星形细胞(HSC)—的活化，其活化形式就称为活化HSC与非活化HSC相比，活化HSC表达更多的平滑肌α-肌动蛋白(SMA)mRNA和SMA蛋白，这也就是为什么可以通过SMA的表达测定HSC的活化现在在系列的实验中出人意料的发现经叶下珠萃得物处理后，HSC中可萃取SMA mRNA和SMA蛋白的数量显著下降经叶下珠萃得物处理的HSC还表现出显著的细胞生长抑制这意味着存在这样的可能性，将纤维化肝脏中的活化HSC逆转为非活化HSC，从而延缓肝纤维化的进程本发明还涉及使用叶下珠抑制脂多糖(LPS)诱导的一氧化氮合成酶(NOS)，尤其是抑制诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，和使用叶下珠抑制环加氧酶蛋白(COX-2)的表达LPS是一个包括多种由脂质和多糖部分结合而成的复合物脂多糖存在于革兰氏阴性细菌细胞壁的外膜，主要由三个组份形成脂质A，寡聚糖核心和O-特异性侧链脂质A将脂多糖锚定于细菌细胞壁中，还引起细菌细胞壁成分的免疫活化LPS的协助诱导肝脏细胞中iNOS和COX-2的表达，也就是为什么这两种蛋白含量升高的受刺激细胞可用作纤维化肝细胞的模型系统iNOS和COX-2被认为是炎性过程(例如退行性变化的肝脏中发生的)的强力介导因素出人意料的是，在比较实验中发现，经受LPS刺激的肝细胞经叶下珠处理后，表现出iNOS蛋白和COX-2蛋白的表达速率明显下降本发明还包括在上述用途中使用从叶下珠中分离的组份分离的组份在此指叶下珠中次要的叶下珠成分已被用如层析法，蒸馏法，沉淀，萃取，过滤或其他方法去除这尤其指利用层析，蒸馏，沉淀或萃取方法从中分离萃得物和组份根据本发明的用途还包括使用从叶下珠中分离的一种或多种化学物质，尤其是活性物质这还包括从叶下珠萃得物或其他萃得物(即所谓天然物质分离物)中分离的单组份使用这些分离的活性物质有一个优点，较之于全萃得物或片剂，使用量较少而特异性通常更高本发明的一优选实施方式中，所述叶下珠选自叶下珠属的amarus叶下珠，霸贝菜，油柑，刺果叶下珠，myrtofolis Moon叶下珠，maderas patensis叶下珠和/或ussuriensis叶下珠根据本发明的用途，可使用叶下珠的叶、树皮、花、种子、果实、茎、枝、干、根和/或木质部分、更佳的是药用部分，也就是植株的全部地上部分叶下珠也可以粉碎或未加工的形式来使用，例如全叶，颗粒，粉末，沉淀物，萃得物，干燥萃得物和/或浸出物，其中萃得物和干燥萃得物更好根据本发明而得的叶下珠制剂包括从上述植物部位之一中得到的粉末或颗粒制品，植物萃得物，植物部位的粉碎物，粉末，经如己烷，水，甲醇和/或其他醇等其他溶剂处理后的残渣这也包括为获得干燥萃得物而进行的过滤和真空蒸发其他方法包括用水和/或醇和/或极性溶剂进行的多相萃取通常的是用如纤维素过滤器进行的过滤，沉淀，较好的使用乙醇，或用超离心分离，和浸出操作也可在升高的或下降的温度下进行这里尤其合适的是使用叶下珠的水、非极性或醇萃得物，其中醇萃取宜使用短链(C1-C4)伯醇或其混合物，尤其是甲醇或乙醇，非极性溶剂宜用C5-C10的支链的或非支链的烃，或其混合物尤其是正己烷其他适于作为萃取剂的是乙酸乙酯或合适的有机溶剂/水混合物，尤其是甲醇/水混合物或乙醇/水混合物合适的萃取过程是已知的，例如美国专利4,673,575号，或美国专利4,937,074号根据本发明的用途，叶下珠最后制成一种或多种药物的形式(见R?mp，LexikonChemie，1.4版)，例如输液剂，注射剂，片剂，颗粒剂，药膏，药贴，灌肠剂或制成一种或多种食品/食品补充剂这些包括常规的医疗和治疗的运用，还包括食品补充，在这些情况下有可能使用叶下珠用于预防和功能性的抗氧化剂作为食品中的天然无害的补充剂，表现出上述治疗和功能性保护效应根据本发明的叶下珠用途，可通过口服，局部使用和/或胃肠道外使用在一优选实施例中，除叶下珠外，还使用了其他一种或多种活性物质和/或合适的添加剂和/或助剂活性物质指适合本发明目的的治疗活性物质，例如被认为是抗氧化剂或抵抗氧化性刺激的活性物质的维生素C或生育酚，尤其是α-生育酚，以及例如消炎物质它们与叶下珠一起组成所谓的组合物必须指出，在这方面，本发明的用途不只限制一次只用叶下珠的一种形式，从中分离的一种组份或活性物质对于一种用途，也可能联合用从叶下珠中得到的不同的形式和/或组份和/或活性物质助剂和添加剂是指就本发明目的而言，已知可为治疗或食品补充的用途而添加，从而得到或获得相应作用的物质，例如佐剂、崩解剂和润滑剂、添充剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂等以下实施例及图表是为了详细描述本发明而不是限制本发明