专利名称：一种表达定向进化l-乳酸脱氢酶的工程菌及应用的制作方法R-扁桃酸及其衍生物是重要的精细化工及多种药物合成的中间体。高纯度手性R-扁桃酸可以用来合成半合成青霉素，头孢菌素，抗癌抗菌素以及抗肥胖药物 ((Preparation of (R) - (-) -mandelic acid and its derivatives from racemates by enantioselective degradation with anewly isolated bacterial strain Alcaligenes sp. ECU0401. Bioprocess. Biosyst. Eng. 2008,31 :445-451.》。R-扁桃酸还可以作为醇类白勺旋光拆分i式齐 11使用〈〈Production of R-(-)-mandelicacid from mandelonitrile by Alcaligenes faecalis ATCC 8750. Appl. Environ. Microbiol. 1991，57 :3028_3032》。苯乙酮酸是合成某些农药(如除草剂苯嗪草酮)和医药产品(如胃长宁)的重要中间体《化工中间体苯乙酮酸的合成初探，上海化工，2000, 2，22-23》。文献报道生物催化法生产R-扁桃酸的途径有三种，一是通过腈水解酶立体选择性的催化外消旋扁桃腈水解《Enantioselective biocatalytic hydrolysis of(R, S)-mandelonitrile forproduction of(R)-(2)-mandelic acid by a newly isolated mutant strain. J Ind MicrobiolBiotechnol. 2010,38 :337-345)) ；二是利用脂肪酶立体选择性的水解外消旋扁桃酸酯《Enzyme-catalysed optical resolution of mandelic acid via RS(+ ) -methyl mandelate innon-aqueous media. Biochemical. Engineering. Journal. 2004，19 101-107》或进行外消旋扁桃酸的酯化《Biocatalytic enantioconvergent separation of racemic mandelic acid. Separationand Purification Technology. 2007,53 :178_182》。三是利用微生物的氧化还原酶催化生成 R-扁桃酸〈〈Preparation of (R) -(-) -mandelic acid and its derivatives from racemates byenantioselective degradation with a newly isolated bacterial strain Alcaligenes sp. ECU0401. Bioprocess. Biosyst. Eng. 2008，31 :445-451.》。该类方法可使用外消旋扁桃酸，外消旋苯基-1，2-乙二醇或苯乙酮酸为底物，操作简易，不需添加共底物。其中外消旋扁桃酸来源广泛，价格低廉，使用其作为底物生产高光学纯的的R-扁桃酸具有较好的可行性。施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri SDM，CCTCC No. M206010)含有 NAD 非依赖性L-乳酸脱氢酶(L-iLDH)和NAD非依赖性D-乳酸脱氢酶(D_iLDH)，通过针对性的保留施氏假单胞菌中L-iLDH，去除D-iLDH，可以实现外消旋乳酸及外消旋α -羟基丁酸的拆分 ((Enantioselective oxidation of racemic lactic acid to D-Iactic acid and pyruvic acid byPseudomonas stutzeri SDM. Bioresour. Technol. 2009,100 :1878-188)) ((Kinetic resolution of2-hydroxybutanoate racemic mixtures by NAD—independent L-Iactatedehydrogenase. Bioresour. Technol. 2011，102 :4595-4599)) 但是其中 L-iLDH具有较窄的底物谱，仅对于L-乳酸及L-2-羟基丁酸具有较高的活性，而对于含苯环或长链的2-羟酸无活性或仅具有微弱活性，限制了其在生物催化中的应用。R-扁桃酸与L-乳酸具有类似的结构，利用蛋白质定点突变技术，改变L-iLDH的底物特异性，可以提高其催化S-扁桃酸的活性，通过在不含扁桃酸降解活性的大肠杆菌中外源表达该突变蛋白制备全细胞催化剂，可以实现以外消旋扁桃酸为底物进行手性拆分，生成两种重要的中间体R-扁桃酸和苯乙酮酸。经检索，利用外源表达突变L-iLDH的工程菌株完整细胞催化剂生产R-扁桃酸以及苯乙酮酸的方法未见报道。
本发明的目的是提供一种能够外源表达定向进化L-乳酸脱氢酶的大肠杆菌工程菌及其应用该工程菌制备的全细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分，同时生产手性纯R-扁桃酸以及苯乙酮酸。本发明所述表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌，其特征在于所述工程菌是一种能够外源表达定向进化的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌，由如下方法构建获得(1)设计并合成PCR引物，自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri SDM) CCTCC No. M206010菌株的基因组中扩增L-iLDH的基因IldD (Genbank序列号GU373722)；其中所述引物是上游引物IldU iAAGCTTATGATCATTTCCGCCTCTACC,下游引物11 dD CTCGAGTCAGACGTCAGCAGACGTTG ；(2)选取L-iLDH蛋白质序列中的108位的缬氨酸作为目标位点，设计并合成含有突变位点的PCR引物，通过PCR反应，将IldD基因第323的胸腺嘧啶核苷酸(T)改变为胞嘧啶核苷酸(C)，即相应于将蛋白质序列108位的缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)，得到突变L-iLDH基因mlldD ；其中所述引物是上游引物ImU TTCACCCTTTCCACCGCGTCGGTCT,下游引物ImD GGGAATCCCTTTCTTGTCTGCCGC ；使用DNA连接酶进行PCR反应产物的自连接，将直线型的产物重新连接为环状，完成蛋白质编码基因的定点突变；(3)以含有T7启动子和氨苄青霉素抗性的大肠杆菌宿主适用表达载体pETDuet-1 出发，将突变L-iLDH基因mlldD序列通过T4 DNA连接酶连接至表达载体，构建表达载体 pETDuet-1-mlldD ；(4)使用化学转化的方法将表达载体pETDuet-1-mlldD转化至大肠杆菌C43 (DE3) 所制备的感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性的固体LB培养基上，筛选得到含有连接突变L-iLDH基因表达载体的转化子，即得到表达突变蛋白的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌。上述步骤中大肠杆菌感受态细胞的制备方法可参考科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中大肠杆菌感受态制备方法。5上述步骤中的LB培养基配方为每升蒸馏水中含有5克酵母粉，10克蛋白胨，10 克氯化钠，调节PH值为7. 5，121°C湿热灭菌20分钟。固体LB培养基配方为在上述配方中加入15克琼脂粉。本发明所述表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用。其中所述表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌的全细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分，同时生产手性纯R-扁桃酸以及苯乙酮酸。进一步的，所述工程菌的全细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分的方法是(1)制备表达定向进化L-乳酸脱氢酶工程菌的完整细胞催化剂平板培养将构建的高表达突变L-iLDH的大肠杆菌工程菌划线接种于固体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37°C进行培养12小时，挑取单菌落；种子培养将挑取的单菌落接种至5毫升液体LB培养基，培养基含有浓度为1毫克/毫升的氨苄青霉素，在37°C培养8 10小时；诱导培养将工程菌种子以体积比的接种量接种至LB培养基中，37°C培养； OD62tlIim达到0. 5 0. 7时，加入终浓度为0. 8 1. 2毫摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)，开始诱导突变蛋白进行表达；继续在30 37°C诱导蛋白表达6 10小时后，终止培养；分离并收集菌体，用PH 7. 4磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，得到作为催化剂的表达定向进化L-乳酸脱氢酶工程菌的完整细胞悬液；(2)将上述催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入20 25毫摩尔/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为20 40克/升；催化剂完整细胞浓度为80 120克湿细胞/升，在30 42°C，pH 6. 5 7. 5条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、催化剂与氧气充分混合，并以120转/分钟 180转/分钟振荡培养36 48小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。上述步骤( 优选的实施方式是将上述催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合， 加入25毫摩尔/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为40克/ 升；催化剂完整细胞浓度为100克湿细胞/升，在37 42°C，pH 7. 0条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、催化剂与氧气充分混合，并以150转/分钟振荡培养40 45小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。利用高效液相色谱(HPLC)测定转化液中R-扁桃酸的含量及R-扁桃酸的对映体过量值样品处理待测样品用两倍体积的高氯酸(5% )酸化，4°C静置2小时后，12000转 /分钟离心15分钟，离心上清用0. 22微米的水相滤膜过滤，然后HPLC分析样品；R-扁桃酸及苯乙酮酸的含量测定采用AgilentllOO色谱系统，色谱柱为离子交换柱(300X7. 8毫米，Aminex HPX-87H column，美国Bio-Rad公司)，分析条件为以10毫摩尔/升硫酸为流动相，柱温，流速为0. 4毫升/分钟，进样量5微升，采用示差折光检测器(RID)进行检测；R-扁桃酸对映体过量值测定采用Agilent 1100色谱系统，色谱柱为手性柱 (150X4. 6 毫米，DAICEL CHIRALCEL 0J-RH，日本 Daicel 公司)，以纯水(含 0. 1 %醋酸)乙腈(体积比为90 10)作为流动相，柱温15°C，流速为0. 4毫升/分钟，进样量1微升， 采用二极管阵列检测器(DAD)进行检测，波长设定为205纳米。其中上述对映体过量率的计算公式为本发明公开了一种表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌，是一种能够外源表达定向进化的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌；其是以商业大肠杆菌C43(DE3)为基础，通过转入含有突变NAD(烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)非依赖性L-乳酸脱氢酶基因的表达载体pETDuet-1-mlldD，使其能够高表达相应的突变蛋白，具有S-扁桃酸降解活性。本发明还公开了所述工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用，是以所构建工程菌完整细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分，同时生产手性纯R-扁桃酸以及苯乙酮酸，具有底物利用率高、产物浓度高、光学纯度高以及后提取简便等优点。