体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法[0002]轮状病毒(rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，1973年Bishop在胃肠炎病人十二指肠发现(Bishop, Davidson et al.1973)。研究表明，95%以上的儿童在5岁前至少感染过一次轮状病毒，据WHO统计，每年因轮状病毒感染而导致的死亡高达60万，而腹泻病例则高达2亿，仅在美国，每年因轮状病毒感染而造成的经济损失就高达1亿美兀(Hsu, Staat et al.2005; Tate, Burton et al.2011),造成严重的经济负担和社会负担。[0003]轮状病毒为无包膜RNA病毒，基因组由11条双链RNA组成，分别编码6种结构蛋白(VP1-VP4，VP6 和 VP7)和 6 种非结构蛋白(NSP1-NSP6) (Estes and Cohen 1989)。轮状病毒为二十面体对称，其衣壳由三个同心层构成，即由VP1、VP2和VP3构成的核心层，由VP6构成的内衣壳，以及由VP4和VP7构成的外衣壳。其中VP6为组特异性抗原，根据其抗原性不同可将轮状病毒分为A-G 7个组，其中A组轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，该蛋白具有较强的免疫原性，尽管不是中和抗原，却能够产生较好的免疫保护效果(Sahara, Frenchick et al.1994)。VP4和VP7为主要中和抗原，根据二者抗原性的不同可将A组轮状病毒分为不同的P血清型和G血清型，根据二者基因的不同可分为不同的基因型。G型和P型相互独立又相互影响，常见的组合`包括G1P[8]，G2P[4]，G3P[8]和G4P[8]，近年来，G9P[8]和G9P[6]的流行显著增加(Li, Liu et al.2009)。[0004]目前尚无针对轮状病毒的特效药，安全有效的疫苗是控制轮状病毒感染的重要手段。经过多年的研究，历经单价减毒疫苗，多价基因重配疫苗和基因工程疫苗三个阶段，目前已有四种轮状病毒疫苗相继上市，包括惠氏的四价人-猿基因重配疫苗，兰州所的单价减毒疫苗、默克的五价人-牛基因重配疫苗和葛兰素史克的单价减毒疫苗。但这些疫苗均为减毒活疫苗，存在较大的安全隐患，其中惠氏的疫苗由于肠套叠问题上市半年后即被撤回(Murphy，Gargiullo et al.2001);默克和葛兰素史克的疫苗尽管经过大量的临床实验证实其安全性和有效性(Bernstein, Sack et al.1999; Vesikari, Matsonet al.2006;Linhares,Velazquez et al.2008;Vesikari,Itzler etal.2009;Snellingj Andrews et al.2011)，但在亚洲和非洲等轮状病毒死亡率较高的国家和地区的保护效率远低于欧美等发达国家(Armah，Sow et al.2010; Zaman，Anh etal.2010;Madhi，Cunliffe et al.2011)，且越来越多的证据表明，二者接种后均产生排毒并可导致病毒的水平传播(Anderson 2008;Rivera, Pena et al.2011; Yen, Jakob etal.2011)，也有研究表明，免疫缺陷儿童接种疫苗后可产生严重胃肠炎(Steele，Cunliffeet al.2009; Patel, Hertel et al.2010);兰州所的疫苗上市十多年，至今尚未发现严重问题，但仅能预防严重腹泻，不能预防轮状病毒的感染(Fu，Wang et al.2007)。因此，尽管轮状病毒减毒疫苗的研究取得了可喜的结果，但也还存在一定的问题，其安全性和有效性还有待进一步提高，发展更加安全、有效的疫苗势在必行。非复制型疫苗是目前轮状病毒疫苗研究的主要方向，其中基因工程疫苗由于成本低，安全、有效等特点而备受关注。[0005]基因工程疫苗主要指通过基因工程方法表达轮状病毒的抗原，免疫动物或人，从而达到免疫保护的作用。这类疫苗包括核酸疫苗、合成肽疫苗、重组表达抗原疫苗和类病毒颗粒(virus-like particles, VLPs)疫苗。目前类病毒颗粒疫苗的有效性和安全性已在HBV、HEV和HPV疫苗上得到了充分的证实，已经成为世界公认的新一代最具研究价值的候选疫苗。RV-VLPs疫苗的研究始于上世纪八十年代，且大量的动物实验结果表明，RV-VLP疫苗具有较好的保护性，并可介导广泛的异型保护。[0006]RV-VLP指由结构蛋白构成的在形态结构上与天然病毒颗粒相似，且保留了病毒颗粒的天然构象却不含病毒核酸的类病毒颗粒。该颗粒分为两类，即:一类是由VP2、VP4、VP6.VP7构成的三层颗粒，或由VP6和VP4、VP7构成的双层颗粒，可刺激机体产生中和抗体(Crawford, Estes et al.1999; Jiang, Estes et al.1999);另一类是由 VP2 和 VP6 构成的双层颗粒，以及由VP6构成的单层颗粒，由于不含中和抗原，因此不能刺激机体产生中和抗体，但由于可以刺激机体产生较强的细胞免疫，因此也具有较好的保护效果(Coste，Sirardet al.2000; Yuan, Geyer et al.2000;Nguyen, 1sef et al.2003),由于 VP6变异性相对较小，因此该颗粒可以产生广泛的异型保护。相对第一类颗粒，第二类颗粒由于具有同样的保护效果，但成分较少，大大降低了其工艺难度和成本，因此更受青睐。[0007]VP2/6-VLP疫苗研制的关键是能够大量高效的制备均一的VLP样品。目前常用的是昆虫-杆状病毒表达系统，在该系统中共表达轮状病毒结构蛋白VP2、VP6可以自发形成VLP (Bertolott1-Ciarlet, Ciarlet et al.2003),但真核表达系统成本高,周期长,操作复杂，表达量低，并且组装 过程中常常非特异性包裹杂蛋白和核酸，难以实现高效、可控的组装(Palomares and Ramirez 2009);尽管目前也有对轮状病毒类病毒颗粒的体外组装进行了异性的研究，但其得率较低，限制了 RVVLP疫苗的进一步发展。[0008]而原核表达系统具有成本低，操作简便等优势，但原核表达系统由于缺少特定的翻译后修饰，导致很多蛋白在原核系统表达中形成包涵体。目前，已有研究通过原核系统表达轮状病毒的结构蛋白，包括VP6、VP4、VP7，但或以包涵体的形式表达，不能有效复性(Zhao, Chen et al.2011)，或融合表达(Choi, Basu et al.2000)，尽管融合表达有助于目的蛋白的纯化，但融合蛋白的切除往往需要价格昂贵的酶，不适合大规模生产。[0009]因此，本领域仍然需要具有低成本，能够实现体外高效、可控的组装，可大规模生产的轮状病毒结构蛋白和类病毒颗粒的制备技术。


[0010]本发明的目的是提供一种新的制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法，该双层颗粒由轮状病毒VP2蛋白和VP6蛋白组成。
[0011]本发明人经研究出人意料的发现，轮状病毒结构蛋白VP6在大肠杆菌内能够以可溶形式表达，纯化后的VP6以三聚体形式存在，可自组装形成单层类病毒颗粒6-VLP，也可与病毒样颗粒或非病毒样颗粒状态的VP2共组装形成双层类病毒颗粒2/6-VLP，且VP6蛋白及其类病毒颗粒可用于预防或减轻轮状病毒感染引起的临床症状。
[0012]因此，本发明涉及A组轮状病毒VP6蛋白，该蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化；含该蛋白的类病毒颗粒2/6-VLP的体外组装；VP6蛋白及其类病毒颗粒在预防或减轻轮状病毒感染引起的腹泻中的用途。具体如下:
[0013]1.本发明涉及一种从大肠杆菌中纯化轮状病毒VP6蛋白的方法，包括该蛋白在大肠杆菌表达系统中的表达和含有该蛋白的裂解上清的纯化。
[0014]在一个优选实施方案中，获得VP6蛋白的方法包括:
[0015]a)在大肠杆菌表达系统中表达VP6蛋白；
[0016]b)将表达了 VP6蛋白的大肠杆菌裂解，分离得到上清液；
[0017]c)向b)上清液中加入0.05%~0.5%的聚乙烯亚胺(PEI)或其类似物，也可加入10~80mM的金属离子如MnCl2、MgCl2、CaCl2、CuCl2、AlCl3等，沉淀核酸和部分杂蛋白，分离得到上清液；
[0018]d)向c)上清液中加入硫酸铵，经充分沉淀，收集沉淀；
[0019]e)将d)中沉淀在高盐缓冲液中重新溶解，分离得到溶液，其中含纯度至少85%的VP6蛋白；
[0020]f )将e)中纯度至少85%的VP6蛋白经色谱层析进一步纯化,可得到纯度大于98%的VP6蛋白，经鉴定，纯化后的VP6蛋白在溶液中以非颗粒形式存在。
[0021]2.本发明再一方面涉及轮状病毒双层类病毒颗粒2/6-VLP的体外组装工艺。
[0022]在一个优选实施方案中，2/6-VLP的体外组装工艺如下:将纯化后的VP6蛋白与非颗粒状态的VP2蛋白混合，并将缓冲液更换至组装缓冲液，主要包括以下方面:
[0023]a)组装缓冲液的pH介于3.0~7.0，优选ρΗ4.0~6.4，最优选ρΗ6.4:
[0024]b)组装缓冲液中含0-2M盐，优选NaCl，更优选150mM~1M NaCl，最优选300mMNaCl ；
[0025]c)VP2蛋白和VP6蛋白的质量比介于1:1~1:10，优选1:2~1:3，最优选1:2.6 ；
[0026]3.本发明再一方面涉及VP6、6_VLP和2/6-VLP在预防或减轻轮状病毒感染引起的腹泻中的用途。免疫途径包括但不限于皮下免疫和肌肉注射，佐剂包括但不限于铝佐剂和弗氏佐剂。
[0027]本发明中相关术语的说明及解释
[0028]根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于:ER2566, BL21(DE3)，TGI, DH5α 及 JM109。
[0029]根据本发明，术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括:质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
[0030]根据本发明，术语“色谱层析“包括但不限于:离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析以及亲和层析色谱。
[0031 ] 根据本发明，在本发明获得VP2和VP6蛋白的方法中，缓冲液是指可在一定范围内维持pH值稳定的溶液，包括但不限于，Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。
[0032]根据本发明，所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压匀浆、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现；
[0033]根据本发明，在本发明获得VP6蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、KC1、NH4C1、(NH4) 2S04中的一种或几种，优选NaCl。
[0034]根据本发明，在本发明获得VP6蛋白的方法中，所用聚乙烯亚胺及其类似物是指表面带正电荷的聚合物，包括但不限于直链聚乙烯亚胺、支链聚乙烯亚胺及其衍生物，其分子量介于1300~750000，优选分子量750000的聚乙烯亚胺。
[0035]根据本发明，在本发明获得VP6蛋白的方法中，所用二价和三价金属离子包括但不限于 Ca2+、Μη2.、Mg2.、Zn2+、Cu2+ 和 Al3.等，优选 Ca2+ 和 Mn2+,最优选 Ca2+。
[0036]根据本发明，获得类病毒颗粒2/6-VLP的方法中，缓冲液是指能在一定范围内维持弱酸性pH (pH3.0~7.0)稳定的溶液，包括但不限于，磷酸盐缓冲液，MES缓冲液，柠檬酸盐缓冲液等等。
[0037]发明的有益效果
[0038]目前轮状病毒VLP制备均米用真核表达系统，应用最多的是昆虫-杆状病毒表达系统。
[0039]在真核表达系统中表达的VP2、VP6蛋白构象更接近天然蛋白，能够在体内自发形成VLP，但是真核表达系统表达周期长，操作复杂，表达量低，组装过程中常常非特异性包裹杂蛋白和核酸，特别是多蛋白共表达过程中会形成不同类型的病毒样颗粒，后期纯化困难，难以实现高效、可控的组装，再加上高昂的成本，给大规模工业化生产带来了极大困难。
[0040] 而原核表达系统特别是大肠杆菌表达系统具有成本低，周期短，表达量大的优势，是重组蛋白最常用、最成熟的表达系统。但在大肠杆菌表达系统中表达的轮状病毒衣壳蛋白往往不能形成正确构象，以包涵体形式表达，而包涵体复性难度大、效率低，难以用于大规模生产。融合表达可实现VP6的可溶性表达，但融合蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶，无法应用于大规模生产。
[0041]本发明在大肠杆菌表达系统中表达了 A组轮状病毒内衣壳蛋白VP6，经过PEI或金属离子沉淀预处理可去除大部分的核酸和部分杂蛋白，而VP6蛋白仍以可溶形式保留于上清中，进一步通过盐析和色谱层析纯化，可获得纯度高于95%的VP6蛋白；经分析，该蛋白在溶液中以三聚体的形式存在，保持了 VP6蛋白的正确构象。该工艺操作简便，成本低廉，得率较高，可应用于大规模工业化生产。通过以上步骤获得纯化后的VP6蛋白可以自组装为单层颗粒6-VLP，也可与颗粒或非颗粒状态的VP2共组装形成双层颗粒2/6-VLP，其工艺简单、可控且组装效率高于95%，显著高于真核表达自组装的效率；经小鼠实验证实，原核表达的VP6蛋白及其类病毒颗粒具有较高的免疫原性和较好的保护性，具有成为轮状病毒候选疫苗的潜力。
[0042]由此可见，本发明具有以下优点:本发明的制备方法既不需要真核表达的高昂成本，复杂工艺，也不需要昂贵的酶，操作简便，成本低廉；纯化工艺中没有经过剧烈的变性、复性，保留了 VP6蛋白的正确构象，该蛋白可自组装形成6-VLP或与VP2共组装形成2/6-VLP,具有较好的免疫原性，且在小鼠实验中表现出较好的免疫保护性；本发明的VP6蛋白和类病毒颗粒的制备方法可用于大规模的工业化生产；本发明的VP6蛋白及其类病毒颗粒可用于预防轮状病毒感染引起的腹泻。
[0043]下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。



[0044]图1显示了实施例1中不同纯化阶段的VP6蛋白经10%SDS_PAGE分离的结果。图1A显示了 PEI沉淀的结果，1:裂解上清，2~9:不同PEI浓度条件下40%硫酸铵沉淀的结果，2:无 PEI，3:0.05%PEI ；4:0.08%PEI ；5:0.1%PEI ；6:0.15%PEI ；7:0.2%PEI，8:0.3%PEI ；
9:0.5%PEI ;图1B显示了金属离子沉淀+40%硫酸铵沉淀的结果，1:20mM MnCl2，2:10mMCaCl2，3:20mM CaC2，4:50mM CaCl2，5:100mM CaCl2 ;其中以 20mM CaCl2 条件下的纯度最高；图1C显示了 20mM CaC12沉淀一25%硫酸铵沉淀一Phenyl-HP纯化的结果，1:菌体裂解上清；2:CaC12沉淀后上清；3:硫酸铵沉淀后溶解上清；4: Phenyl-HP 2M NaCl洗脱组分。结果显示，通过二价离子沉淀、硫酸铵沉淀粗纯后，VP6的纯度由10%左右提高到85%左右，进一步通过疏水层析纯化后其纯度达到98%以上。
[0045]图2显示了实施例2中不同纯化阶段VP2蛋白经10%SDS_PAGE分离的结果。1:菌体裂解上清；2:PEI沉淀上清；3:硫酸铵沉淀后溶解上清；4:SP FF 500mM NaCl洗脱组分。结果显示，通过PEI沉淀、硫酸铵沉淀粗纯后，VP2纯度从5%左右，提高到了约80%左右，进一步通过阳离子交换色谱纯化后其纯度达到95%左右。
[0046]图3显示了纯化后的VP2蛋白和VP6蛋白经SDS-PAGE、分子筛层析和分析超离鉴定的结果。其中图A显示了 SDS-PAGE鉴定的结果，1为分子量Marker ;2_5为纯化后的VP2蛋白，6-9为纯化后的VP6蛋白，其中2&5为上样缓冲液含巯基乙醇，100°C水浴lOmin的结果，3&6为上样缓冲液含巯基乙醇，未经热处理的结果，4&8为上样缓冲液中不含巯基乙醇，100°C水浴lOmin的结果；5&9为上样缓冲液中不含巯基乙醇，无热处理的结果。可见，VP2蛋白和VP6蛋白的纯度均达到95%以上，VP2蛋白以单体形式存在，可能SDS破坏了 VP2单体间的相互作用，而VP6以聚体形式存在。图B显示了纯化后的VP2蛋白和VP6蛋白经Sepherdex200分子筛层析鉴定的结果，VP2蛋白和VP6蛋白的保留时间分别为27.34min和33.91min。图3C显示了 VP2蛋白经分析超离鉴定的结果，其分子量为204.4±5.6KD，接近二聚体的分子量。图3D显示了 VP6蛋白经分析超离鉴定的结果，其分子量为114.9±1.6KD,接近三聚体的分子量。
[0047]图4显示了实施例4 中RV类病毒颗粒2-VLP的透射电镜结果，视野中可见大量直径50-60nm的类病毒颗粒，与理论值相符。
[0048]图5显示了实施例5中所得类病毒颗粒6-VLP鉴定的结果。A为透射电镜观察结果，可见大量直径70nm左右的颗粒，结构较为松散；B为动态光散射的结果，6-VLP的水花分子动力学半径为40.36nm，颗粒组装百分比为100% ；C为G5000PWXL分子筛层析的结果，6-VLP的保留时间为10.551min，颗粒组装效率高于95%。[0049]图6显示了实施例5中通过两步法组装的类病毒颗粒2/6-VLP鉴定的结果。A为分析型超速离心的结果为pH6.0条件下透射电镜观察的结果，可见直径60nm左右的类
病毒颗粒。
[0050]图7显示了实施例5中不同缓冲体系下2/6-VLP鉴定的结果。A:5(MM MES6.0，可见大量直径70nm左右的单层颗粒；B:50MM MES6.0+150mM NaCl，可见直径70nm左右的单层颗粒和60nm左右的双层颗粒；C:50MM MES6.0+300mM NaCl，可见直径60nm左右的双层颗粒，大小均一 ；D:5(MM MES6.0+500mM NaCl，可见直径60nm左右的双层颗粒，大小均一 ；E:PB5.8+300mM NaCl，可见直径60nm左右的双层颗粒；F:PB6.0+300mM NaCl，可见直径60nm左右的双层颗粒；G:PB6.4+300mM NaCl可见直径60nm左右的双层颗粒，大小均一 ；H:6-VLP对照，可见直径70nm左右的单层颗粒。
[0051]图8显示了实施例5中VP2和VP6不同比例下2/6-VLP鉴定的结果。A为透射电镜观察的结果，在VP2和VP6的质量比介于1:2-1:6的条件下，视野中均为直径60nm左右的双层颗粒2/6-VLP，而在VP2与VP6的质量比为1:10的条件下，视野中则既有直径60nm左右的2/6-VLP，也有直径70nm左右的6-VLP ；B和C为实施例4中通过两步法组装的2/6-VLP分析超离的结果，其沉降系数在251-264S，VP2和VP6的最佳质量比为1:2.6。
[0052]图9显示了实施例5中最佳条件下2/6-VLP鉴定的结果。A为透射电镜观察的结果，可见大量直径60nm左右的类病毒颗粒，为双层结构，大小和形态与理论相符，均匀一致为动态光散射的结果，其水化分子动力学半径为34.27nm，颗粒组装百分比为100% ；C为G5000PWXL分子筛层析的结果，2/6-VLP的保留时间为10.821min，组装效率高于95%。
[0053]图10显示了实施例1中的VP6蛋白，实施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104细胞培养的A组轮状病毒免疫后小鼠血清中VP6抗体的滴度，与培养病毒相比，VP6，6-VLP以及2/6-VLP均具有较高的免疫原性。
[0054]图11显示了实施例1中的VP6蛋白，实施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104细胞培养的A组轮状病毒10ug剂量下经肌肉注射免疫三次后母鼠和乳鼠血清中针对VP6的抗体滴度，其中A为不同免疫组母鼠血清抗体滴度，B为不同免疫组乳鼠血清抗体滴度。
[0055]图12显示了实施例1中的VP6蛋白，实施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104细胞培养的A组轮状病毒母传抗体对乳鼠感染轮状病毒后发生腹泻的情况。
[0056]图13显示了实施例1中的VP6蛋白，实施例5中的6-VLP和2/6-VLP以及MA104细胞培养的A组轮状病毒母传抗体对乳鼠感染轮状病毒后排毒的影响及保护效果，其中A为不同免疫组小肠内溶物通过ELISA检测的病毒滴度的情况，B为不同免疫组与对照组相t匕排毒量降低的比例。
[0057]序列信息
[0058]本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中
[0059]表1:引物列表