专利名称：用于治疗缺血组织的sdf-1递送的制作方法图10是示例基线和初次注射后30天的左心室射血分数的图。所有组显示左心室射血分数未改善。对于全部数据点，N = 3。数据以平均值土SEM表示。详细描述除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本申请所属领域技术人员通常理解的相同的含义。在本文全部公开内容中所涉及的所有专利、专利申请、公布的申请和出版物、Genbank序列、网站以及其他公开材料除非另外注明其整体均被引入作为参考。在本文术语具有多个定义的情况下，本部分的定义占据主导。除非另外限定，本文所用的所有技术术语均具有与本申请所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。分子生物学术语的通常理解的定义可在，例如，Rieger等，Glossary of Genetics Classical andMolecular,5th edition, Springer-Verlag New York,1991 ;和 Lewin, Genes V, OxfordUniversity Press New York, 1994 中找到。本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。这些技术在本领域是周知的，并在如下方法论专著中被详细描述，如 Melecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd ed.,vol. 1-3,ed. Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y. ,1989 ；和 Current Protocols in Melecular Biology, ed. Ausubel GreenePublishing and ffiley-Interscience, New York, 1992 (定期更新)。核酸的化学合成法在例如，Beaucage and Carruthers, Tetra. Letts. 22 1859-1862,1981 和 Matteucci 等，J. Am. Chem. Soc. 103 :3185,1981中被论述。核酸的化学合成可在例如商用自动化寡核苷酸合成仪中进行。免疫学方法(例如，抗原特异性抗体的制备、免疫沉淀和免疫印迹)在例如，Current Protocols in Immunology, ed. Coligan 等，John ffiley& Sons, New York,1991 jPMethods of Immunological Analysis,ed. Masseyeff等，John Wiley & Sons,NewYork, 1992中被述及。基因转移和基因治疗的常规方法也可适用于本申请。参见，例如GeneTherapy !Principles and Applications, ed. T.Blackenstein, Springer Verlag,1999 ；Gene Therapy Protocols(Methods in Molecular Medicine), ed. P.D. Robbins, HumanaPress,1997 ；和 Retro-vectors for Human Gene Therapy, ed.C.P. Hodgson, SpringerVerlag,1996。在参考URL或其他这样的标识符或地址时，要理解的是，这样的标识符可发生改变，并且因特网上的具体信息是易变的，但通过搜索因特网可找到等同的信息。其引用证明了这种信息的可用性和公众传播性。如本文所用，“核酸”指包含至少两个共价连接的核苷酸或核苷酸类似物亚单元的多核苷酸。核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或DNA或RNA的类似物。 核苷酸类似物可商业获得，并且制备包含这种核苷酸类似物的多核苷酸的方法是已知的(Lin 等(1994)Nucl. Acids Res. 22 :5220-5234 ;Jellinek 等(1995)Biochemistry 34:11363-11372 ;Pagratis 等(1997)Nature Biotechnol. 15 :68-73)。核酸可以是单链的、双链的或其混合物。对于本文的目的，除非另外说明，核酸是双链的或其从上下文看是明显的。如本文所用，“DNA”意为包括所有类型和大小的DNA分子，包括cDNA、质粒和包括修饰核苷酸和核苷酸类似物的DNA。如本文所用，“核苷酸”包括核苷一磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。核苷酸还包括修饰核苷酸，如但不限于，硫代磷酸核苷酸和脱氮杂嘌呤核苷酸以及其他核苷酸类似物。如本文所用，术语“对象”或“患者”指大DNA分子可导入的动物。包括高等生物，如哺乳动物和鸟类，包括人类、灵长类、哨齿类、牛、猪、兔、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、猫、狗、马、鸡等。如本文所用，“大型哺乳动物”指具有至少IOkg的一般成年体重的哺乳动物。这种大型哺乳动物可包括，例如，人类、灵长类、狗、猪、牛，并且意为不包括小型哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠和其他啮齿类。如本文所用，“给予对象”是这样的程序将一种或多种递送剂和/或大核酸分子一起或分别导入或施用于对象，使得对象中存在的目标细胞最终接触该剂和/或大核酸分子。如本文所用，“递送(delivery) ”,其与“转导(transduction) ”交替使用,指将外源核酸分子转移至细胞中从而其位于细胞内的过程。核酸递送是与核酸表达不同的过程。如本文所用，“多克隆位点(MCS) ”是质粒中包含多个限制酶位点的核酸区域，该限制酶位点中的任一个均可联合标准重组技术用于消化载体。“限制酶消化”指用仅作用于核酸分子特定位置的酶催化切割核酸分子。这些限制酶中许多可商业获得。这种酶的应用为本领域技术人员所周知。载体常利用在MCS中进行切割的限制酶被线性化或片段化(fragmented),从而使外源序列能被连接至载体。如本文所用，“复制起点”(常被称为“ori”)，是开始复制的特定核酸序列。可选地,如果宿主细胞是酵母,可应用自主复制序列(ARS)。如本文所用，“可选择标记或可筛选标记”赋予细胞可识别的变化，能够容易识别包含表达载体的细胞。一般而言，可选择标记是赋予能够进行选择的性质的标记。阳性可选择标记是标记的存在能够进行其选择的标记，而阴性可选择标记是其的存在阻止其选择的标记。阳性可选择标记的实例是药物抗性标记。通常，包含药物选择标记有助于转化体的克隆和识别，例如，赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、ze0cin和组氨醇抗性的基因是有用的可选择标记。除赋予能够基于条件的实施区分转化体的表型的标记外，还考虑其他类型的标记，包括可筛选标记，如GFP，其基础是比色分析。可选地，可以利用可筛选酶，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还将直到如何利用可能联合FACS分析的免疫学标记。所用的标记不被认为是重要的，只要其能同时用编码基因产物的核酸表达。可选择和可筛选标记的进一步实例对于本领域技术人员是周知的。术语“转染”用于指细胞摄取外源DNA。当外源DNA已被导入细胞膜内时，细胞已被 “转染”。许多转染技术在本领域是周知的。参见，例如，Graham等，Virology52 :456(1973)；Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989) ;Davis 等，Basic Methodsin Molecular Biology (1986) ;Chu 等,Gene 13:197(1981)。这些技术可用于将一个或多个外源DNA部分如核苷酸整合载体和其他核酸分子导入适当的宿主细胞中。该术语涉及化学转染程序、电转染程序和病毒介导的转染程序。如本文所用，“表达”指将核酸翻译成肽或转录成RNA——该RNA例如可翻译成肽、多肽或蛋白质——的过程。如果核酸源自基因组DNA，表达可以——如选择适当的真核宿主细胞或生物——包括mRNA的剪接。对于宿主细胞中要表达的异源核酸，其必须首先被递送到细胞中，然后只要进入细胞就最终位于核中。如本文所用，"基因治疗"包括将异源DNA转移至患有治疗或诊断所针对的疾病或病症的哺乳动物——特别是人类——的细胞。DNA以这样的方式被导入所选择的目标细胞所述方式使得异源DNA被表达，从而生成被编码的治疗产物。可选地，异源DNA可以某种方式介导编码治疗产物的DNA的表达；其可编码以某种方式直接或间接介导治疗产物表达的产物，如肽或RNA。基因治疗也可用于递送编码基因产物的核酸以替代缺陷基因或补充其所导入的哺乳动物或细胞生成的基因产物。导入的核酸可编码治疗化合物，如其生长因子抑制剂、或肿瘤坏死因子或其抑制剂，因此如哺乳动物宿主中通常不产生或不以治疗有效量或在治疗有用时间产生的受体。编码治疗产物的异源DNA可在导入患病宿主的细胞前被修饰，以便增强或另外改变产物或其表达。如本文所用，“异源核酸序列”一般是这样的DNA :所述DNA编码其表达所在的细胞在体内通常不产生的RNA和蛋白质，或介导或编码通过影响转录、翻译或其他可调控生物化学过程改变内源DNA表达的介导物。异源核酸序列也可被称为外源DNA。任何本领域技术人员认为或考虑对其表达所在的细胞是异源或外源的DNA在此均包括在异源DNA内。异源DNA的实例包括但不限于，编码可追踪标记蛋白如赋予药物抗性的蛋白质的DNA、编码治疗有效物质如抗癌剂、酶和激素的DNA和编码其他种类蛋白质如抗体的DNA。异源DNA编码的抗体可被分泌或表达在异源DNA所导入的细胞的表面上。如本文所用，术语“心肌病”指任何原因引起的心肌(即，实际的心脏肌肉)功能退化。心肌病对象常处于心律失常、突发心源性死亡或心脏衰竭引发的入院或死亡的危险。如本文所用，术语“缺血性心肌病”是由于氧输送至心肌不足引起的心肌虚弱，冠状动脉疾病是最常见的病因。如本文所用术语“缺血性心脏病”指任何这样的病症其中由于其血液供应缺乏或相对不足造成心肌损伤或工作低效；最常由动脉粥样硬化引起，其包括心绞痛、急性心肌梗塞、慢性缺血性心脏病和猝死。如本文所用，术语“心肌梗塞”指心脏肌肉(心肌)的区域损伤或死亡，其由向该区域的血液供应阻塞引起。如本文所用，术语“6分钟步行测试”或“6MWT”指测量患者6分钟时间内在平坦、坚硬的表面上可快速步行的距离^MWD)的测试。其评价了运动(exercise)过程中涉、及的所有系统的整体和综合反应，包括肺和心血管系统、全身循环、外周循环、血液、神经肌肉单元和肌肉代谢。其未提供关于运动涉及的各个不同器官和系统的功能或运动限制(exercise limitation)机制的具体信息,这对于极量心肺运动测试是可能的。自定步速(self-paced)的6MWT评估了功能性能力的亚极量水平。(参见,例如，AM J Respir CritCare Med,Vol.166.Pp 111-117(2002))如本文所用，“纽约心脏协会(NYHA)功能分级”指对心脏衰竭程度的分级。其基于患者在身体活动过程中受限的程度将患者置于四个等级其中一个；限制/症状针对正常呼吸和呼吸短促或心绞痛的不同程度治疗对象心肌病的方法包括向对象心肌组织弱化的、缺血性的和/或梗塞周边的区域直接给予或在其中局部表达有效引起下列参数中至少一种的功能性改善的SDF-1量左心室容积、左心室面积、左心室维度、心脏功能、6分钟步行测试或纽约心脏协会(NYHA)功能分级。
用于治疗缺血组织的sdf-1递送制作方法
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