一种用于羊传染性脓疱病毒分离培养和增殖的细胞系及其制备方法和应用的制作方法[0002]羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma, CE)又名羊传染性脓疱性皮炎(Contagious pustular dermatitis),俗称“羊口疮(Orf )”,是由副痘病毒成员羊传染性脓疱病毒(Orf virus, ORFV)感染引起的山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人兽共患传染病，以在患羊的口唇、蹄、乳房、外阴等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状厚痂为特征。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。[0003]该病最早发现于欧洲，目前，几乎所有养羊国家和地区均存在。近年来，羊传染性脓疱病在世界各养羊国家和地区的羊群中均有发生，被认为呈全球性流行的趋势。现有流行病学调查研究资料显示，该病发病率约为50 %，而在敏感羊群中发病率则可达90 %，因此，该病一旦发生，将给养羊户造成重大的经济损失，并严重危害肉羊产业的健康发展，更为严重的是此病可以通过伤口感染饲养人员，表现为感染者手背、指间和前臂部出现疱疹和破溃。例如2005年8月福建省永安市有8名羊场养殖工人因感染羊传染性脓疱病毒而发病。因此，羊传染性脓疱不但严重危害肉羊产业的健康发展，而且威胁人类的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。[0004]目前，羊传染性脓疱病流行地区对此病尚无有效的治疗方法，所以，免疫接种成为了防控该病唯一有效的方法。在国内，虽然羊传染性脓疱弱毒疫苗在青海省畜牧兽医科学院兽医研究所和甘肃省畜牧兽医研究所均研制，但其制造工艺复杂、落后，繁殖羊传染性脓疱弱毒抗原必须用新生牛睾丸原代细胞，但制备这种细胞程序复杂，生产成本过高，生产效率较低下，这就给疫苗厂规模化生产羊传染性脓疱弱毒疫苗带来不便，企业也难以获得丰厚的利润。同时，每次繁殖羊口疮抗原所用的新生牛睾丸品种不一，这就很难使所生产的弱毒疫苗的质量保持稳定，此外，新生牛睾丸还有携带其他病原的潜在危险。因此，研发一种适于羊传染性脓疱病毒增殖的传代细胞系，对疫苗企业具有一定的现实意义。
[0005]为了解决现有技术中的不足，本发明提出了一种用于羊传染性脓疱病毒分离培养和增殖，且同时能够用于羊传染性脓疱病疫苗制备的细胞系，该细胞系是通过对新生牛睾丸原代细胞进行分离和纯化后得到的一种新生牛睾丸支持细胞系。[0006]在本发明中，优选的，所述的新生牛睾丸支持细胞系命名为新生牛睾丸支持细胞系NBSC，分类命名为新生牛睾丸支持细胞系，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:C201438。[0007]本发明的一种用于增殖羊传染性脓疱病毒的新生牛睾丸支持细胞系是通过以下步骤制备得到的:
[0008](I)新生牛睾丸组织收集、处理及消化；
[0009](2)分离、纯化新生牛睾丸支持细胞。
[0010]其中，步骤(1)中新生牛睾丸组织来自健康母牛所生的I日龄未吃初乳的公牛；健康母牛口蹄疫、布氏杆菌病、副结核、牛病毒性腹泻检测为阴性；新生牛屠宰后采集阴囊(阴囊根部结扎，阴囊外部用75%酒精消毒)置恒温箱内，2小时内送回实验室。无菌分离睾丸实质用混合酶消化法制备细胞悬液。
[0011]其中，步骤(2)中分离纯化新生牛睾丸支持细胞所用方法为:将步骤(1)制备的细胞悬液按细胞浓度I~5 XioVml分装到细胞瓶，进行反复差速贴壁法结合高温培养法进行分离纯化新生牛睾丸支持细胞。
[0012]其中，步骤(2)中新生牛睾丸支持细胞分离纯化培养所用的培养液为高糖DMEM细胞液或DMEM/F-12细 胞培养液加2~10%胎牛血清，加青霉素、链霉素各100单位/ml，调PH 至 7.0 ~7.2。
[0013]进一步的，本发明还提出了一种羊传染性脓疱病毒的培养方法，其特征在于包括以下步骤:
[0014](I)选生长良好布满单层的新生牛睾丸支持细胞系，倾去营养液，按原营养液体积的5-15%接种羊传染性脓疱病毒液，吸附10-30分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0~7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37°C、5%C02浓度培养箱中进行培养；
[0015](2)培养40~72h，细胞病变(CPE)达到75%以上时收获病毒，置_20°C冰箱反复冻融两次，然后进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验合格后，用Reed-Muench法测定病毒毒价，即可得到羊传染性脓疱细胞病毒液。
[0016]在所述的方法中，优选的，所述的新生牛睾丸支持细胞系为新生牛睾丸支持细胞系NBSC，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCCNO:C201438o
[0017]本发明通过试验发现，本发明的新生牛睾丸支持细胞系NBSC可以连续传代20代以上，且16代以内其生长增殖特性保持不变。该细胞系对接种羊传染性脓疱病毒较为敏感，用该细胞系所增殖的病毒滴度较采用新生牛睾丸原代细胞高约I个病毒滴度，并且比采用MDBK细胞系高1.9个病毒滴度。利用该细胞系分离ORFV病毒可以保证病毒的均一、稳定，同时可以避免因多次利用原代细胞而使所分离的病毒带有其他病原的风险。利用该传代细胞系制备疫苗简化了生产工艺、缩短了生产周期，降低了生产成本，同时还保证了制备得到的羊传染性脓疱病疫苗的质量保持稳定，因此，本发明的提出对羊传染性脓疱病疫苗的规模化生产具有一定的现实意义。

[0018]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0019][实施例1]牛睾丸支持细胞的分离、培养及鉴定
[0020]1.1牛睾丸支持细胞的分离、培养
[0021]选健康母牛(体质健康且口蹄疫、布氏杆菌、副结核、牛病毒性腹泻检测为阴性)所生的的健康公牛犊，屠宰后采集阴囊(阴囊根部结扎，阴囊外部用75%酒精消毒)，恒温箱内，2小时内送回实验室。在无菌条件下取出新生牛睾丸放入玻璃皿中，用加双抗D-hanks洗漆睾丸2~3次，除去附睾、脂肪垫及睾丸白膜。用眼科镊子和剪刀将睾丸实质分成大小一致的小块，在D-hanks液中轻轻吹打数次，静置5~lOmin，去除上清，获得曲精细管小段。将小组织块放入5mL离心管中加入10倍体积的含0.P/oIV型胶原酶、0.25%胰酶的消化液4°C消化12小时或过夜，用等体积含10%血清的DMEM培养液终止消化。用吸管柔和吹打数次后，用200目铜网过滤。收集消化液1000r/min离心10min，去除上清，用无血清培养液漂洗2次，去除上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养液制成细胞悬液。台盼蓝染色判断细胞活力，血细胞计数板计数，调整细胞浓度。将细胞悬液以I~5X IO5个/ml的密度接种到培养瓶中，5%C02、37 °C、饱和湿度培养箱中培养6h后，给细胞换液，弃未贴壁细胞，加入含10%FBS的高糖DMEM培养液，置38°C，5%C02,饱和湿度的培养箱中继续培养。由于睾丸曲细精管中只有精原细胞和支持细胞，在差速贴壁过程中，6h内精原细胞无法贴壁生长，因此可以保证分离纯化到的细胞都为睾丸支持细胞。同时精原细胞在38°C温度下不容易生长，很快凋亡。利用这一特性，用差速贴壁结合高温培养将用该方法培养细胞传代3次进行细胞鉴定和睾丸支持细胞纯度鉴定。
[0022]1.2新生牛睾丸支持细胞的鉴定
[0023]研究表明，波形蛋白是区分支持细胞和精原干细胞的标志性蛋白(AumiillerG,Schulze C, Viebahn C.1ntermediate filaments in Sertoli celIs[J].MicroscRes Tech.1992Janl;20(l):50-72.Dufour JM,Rajotte RV,Seeberger K,KinT, Korbutt GS.Long-term survival of neonatal porcine Sertoli cells innon-1mmunosuppressed rats [J].Xenotransplantation.2003Nov;10(6):577-86.)，SCF和⑶NF也是鉴定支持细胞的标记基因(Allard EK, Blanchard KT, BoekelheideK.Exogenous stem cell factor (SCF) compensates for altered endogenous SCFexpression in2,5-hexanedione-1nduced testicular atrophy in rats.BiolReprod.1996Jul ;55(1):185-93.)。本发明发明人根据文献方法对支持细胞进行波形蛋白免疫组化染色。同时提取支持细胞的总RNA反转录后，检测支持细胞的标志基因SCF和GDNF的表达情况。
[0024]鉴定结果表明，标志基因SCF和⑶NF检测扩增到预期大小的片段，测序结果也证实扩增得到的片段为SCF和GDNF基因。波形蛋白免疫组化检测支持细胞纯度较高，结果表明支持细胞阳性率达到90%以上。
[0025]经分离纯化培养后，最终分离得到一牛睾丸支持细胞系，命名为新生牛睾丸支持细胞系NBSC，该细胞系已于2014年3月19日送交位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO:C201438。 [0026][实施例2]羊传染性脓疱病毒的增殖
[0027]羊传染性脓疱病毒可在牛肾细胞传代细胞系和犊牛、羔羊睾丸原代细胞上培养增殖。初生胎牛肌细胞、初生胎羊真皮细胞、胎牛肺细胞、胎羊陀螺细胞和胎羊肌细胞也可用于羊传染性脓疱病毒的分离培养。其中，牛肾细胞系(MDBK)是最常用的传代细胞系，常用于病毒的初步分尚和传代培养。在羊传染性脓疱病毒分尚培养、传代致弱以及羊传染性脓疱病毒弱毒疫苗生产中最常用的是新生牛睾丸原代细胞。因此，本发明发明人选用，MDBK细胞系、新生牛睾丸原代细胞和新生牛睾丸支持细胞三种细胞接种同一毒株、同一代次的羊传染性脓疱病毒进行平行对比，来比较这三种细胞对该病毒的增值情况。同时，将分离纯化培养的新生牛睾丸支持细胞进行传代培养，进一步研究该细胞系的传代培养特性及利用该细胞系增殖病毒的特性。
[0028] 2.1羊传染性脓疱病毒病毒对MDBK细胞、新生牛睾丸原代细胞和新生牛睾丸支持细胞的敏感性试验
[0029]将生长良好铺满单层的MDBK细胞、新生牛睾丸原代细胞和本发明的新生牛睾丸支持细胞NBSCXCCTCC NO:C201438)各三瓶(营养液体积为IOml )，倾去营养液，按原营养液体积的10%接种羊传染性脓疱病毒0RFV/HB/09株(王光祥等，湖北省羊口疮病毒的分离鉴定，动物医学进展，2012，33 (11):37 — 40，由中国农业科学院兰州兽医研究所保存，提供。)的第F16代细胞毒液Iml/瓶，另外一瓶做对照。病毒吸附30分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0~7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37°C、5%C02浓度培养箱中进行培养，培养40~72h，逐日观察细胞的生长和细胞病变(Cytopathic effect, CPE)情况。当CPE达到75%时收获病毒，置_20°C冰箱冻融两次，然后进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验合格后，用Reed-Muench法测定利用三种不同细胞增殖病毒的TCID5(i/0.1ml。结果见表1所示:
[0030]表1三种细胞对ORFV病毒的敏感性试验结果
[0031]
细胞种类 CPE出现时收获病毒时间收获病毒TCIDW0.lml
__间(h)__(h)__
MDBK 细胞__36__95___
新生牛睾丸原代2472ΙΟ—55
细胞
本发明的新生牛睾 24 65 IO-65丸支持细胞NBSC ___
[0032]试验发现，MDBK细胞在接种病毒后36h出现细胞即呈现折光性增强、变圆、聚堆等细胞病变(Cytopathic effect，CPE)，后期细胞发生皱缩，甚至脱落，CPE达到75%以上，需要95h ;新生牛睾丸原代细胞和新生牛睾丸支持细胞出现细胞病变(Cytopathiceffect, CPE)时间相当都在接种病毒后24小时，但新生牛睾丸原代细胞CPE病变速度较睾丸支持细胞慢。CPE达到约75%新生牛睾丸原代细胞约72小时左右，而分离纯化的睾丸支持细胞在65小时左右。收获病毒，冻融两次后用Reed-Muench法测定利用三种不同细胞增殖病毒的TCID50/0.Iml0结果发现=MDBK细胞增殖ORFV病毒TCID50/0.1ml为10_5_° ;新生牛睾丸原代细胞为10_5 5 ;新生牛睾丸支持细胞为10_6 5。
[0033]以上实验证明，本发明的分离纯化的睾丸支持细胞NBSC对羊传染性脓疱病毒在试验所选三株细胞中最为敏感，且病毒增殖效率最高，病毒滴度比试验和生产常用的新生牛睾丸原代细胞高I个滴度，同时比采用MDBK传代细胞系高1.9个滴度。
[0034]2.2新生牛睾丸支持细胞的传代及其对ORFV的增殖试验
[0035]将分离纯化后鉴定的新生牛睾丸支持细胞NBSC (CCTCC NO:C201438)第三代进行继续传代(每代细胞都按I: 2进行消化传代),每代细胞铺满单层后以Iml/瓶(25ml细胞瓶，营养液体积为IOml)接种0RFV/HB/09株第F16代细胞毒液各两瓶，一瓶做对照，进行细胞传代试验，方法同2.1节。每代细胞统计生长时间(铺满单层)、接种病毒后病变时间、以及测定传代细胞接种病毒后收获病毒毒价，比较不同代次的传代细胞对ORFV增殖差异，结果见表2。
[0036]表2新生牛睾丸支持细胞生长特性及病毒增殖情况
[0037]