专利名称：一种用于分离荔枝霜疫霉病菌的培养基的制作方法蒸枝(Litchi chinensis Sonn.)是著名的岭南佳果,在北纟韦18° 31°均有种植，分布遍及海南、广西、云南、福建、贵州、四川、广东、台湾等8省区。2008年全国种植面积约900万亩，超过约820万亩的荔枝，成为种植面积最大的热带水果。我国的荔枝产量超过全球产量的60%。荔枝霜疫霉病是荔枝一种主要病害，该病害可以危害荔枝的花和果，花期发病，造成大量的枯花，幼果期发病，引起落果，成熟期发病，引起果实腐烂。在鲜果运输销售期，此病继续发展，也严重影响鲜果的贮运和外销，进而影响了荔枝产业的可持续稳定发展。药剂防治是目前防治该病最有效的方法之一。 蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)以菌丝体和卵抱子在病叶、病果及土壤中越冬，为翌年的初侵染病源。翌年春末夏初产生孢子囊，随风雨传播，孢子囊产生的游动孢子侵入寄主叶片和果实为害。为了对荔枝霜疫霉病菌进行相关研究，以及调查病原菌的越冬菌量和田间发病情况，做好病害的预测预报，通过分离而获得纯化的荔枝霜疫霉病菌是必要的。常规的病原菌分离方法是《植病研究方法》介绍的用75%乙醇和O. 1%升汞液表面消毒处理。实际工作中，在实验室进行分离的样本往往不是新鲜样品，是经田间采样后存放有一定时间的病残体，这些荔枝病组织中就不可避免的常常带有其他杂菌，按常规方法进行分离组织病原菌时，由于这些杂菌的生长较荔枝霜疫霉病菌迅速，杂菌的菌丝常将荔枝霜疫霉病菌覆盖，而快速生长的细菌也会抑制荔枝霜疫霉病菌的生长。传统病原菌分离方法中，利用普通培养基从病组织中分离荔枝霜疫霉时，采集的病组织若不消毒或是消毒时间短，造成培养时有杂菌污染，达不到分离纯化的目的。若消毒时间太长，往往在杀死杂菌的同时，也会把要分离的病原菌杀死，造成病原菌分离率往往不太闻。
本发明的一个目的是提供一种杀菌剂、用于分离荔枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的培养基、和分离蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)的方法。本发明所提供的杀菌剂，其活性成分为如下I)或2)所示I)由苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素组成；2)由苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素组成。上述杀菌剂，所述I)所示杀菌剂中，所述苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素的质量分数比为(10-20): (10-50): (50-100): (50-100)，具体为 10 10 50 :50，或 15 20 70 70，或 20 50 :100 :100 ；上述杀菌剂，所述2)所示杀菌剂中，所述苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素的质量分数比为(10-20): (10-50): (50-100): (50-100)，具体为 10 10 50 :50，或 15 20 70 70，或 20 50 :100 100o本发明所提供的用于分离蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Koet al)的培养基，为如下I或II所示I、是向白云豆培养基中添加权利要求I或2中所述I)所示杀菌剂得到的；II、是向白云豆培养基中添加权利要求I或2中所述2)所示杀菌剂得到的。上述I所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为IOyg/mL-20 μ g/mL,具体为10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述多菌灵在所述白云豆培养基中的浓度为10 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL>70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL、 70 μ g/mL 或 100 μ g/mL ；上述II所示培养基中，所述苯醚甲环唑在所述白云豆培养基中的浓度为IOyg/mL-20 μ g/mL,具体为10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述咪鲜胺在所述白云豆培养基中的浓度为10 μ g/mL-50 μ g/mL,具体为10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述白云豆培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述青霉素在所述白云豆培养基中的浓度为50 μ g/mL-100 μ g/mL,具体为50 μ g/mL、70 μ g/mL 或 100 μ g/mL。上述培养基在分离蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko et al)中的应用也属于本发明的保护范围。本发明所提供的分离蒸枝霜疫霉病菌(Peronophythora Litchi Chen ex Ko etal)的方法，包括如下步骤用上述任一所述培养基培养样本，得到荔枝霜疫霉病菌；所述样本为感染荔枝霜疫霉病菌的植物的叶片或果实。本发明的白云豆选择性培养基成本低廉、制作简便，且对细菌具有非常好的抑制作用。实验证明，用本发明的白云豆选择性培养基分离荔枝霜疫霉的方法，解决了荔枝霜疫霉等植物病原卵菌分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题；该方法分离效率高、可靠、省时、省力。图I为三种抗生素对植株叶片表面细菌的抑制作用。图2为三种抗生素对果皮表面的细菌抑制作用。图3为荔枝霜疫霉病的症状(摄于广西北流)

一、不同浓度的三种真菌抑制剂对荔枝霜疫霉的抑制作用以二甲基甲酰胺为多菌灵的溶剂，以丙铜或甲醇为苯醚甲环唑和咪鲜胺的溶剂，分别配制5000 μ g/mL的三种药剂母液10ml，三种药剂的称量量依次为50. 6mg、52. Omg和
51.5mg ;将这三种母液分别配制系列浓度为50 μ g/mL>20 μ g/mL和10 μ g/mL的多菌灵，咪鲜胺和苯醚甲环唑的带毒白云豆平板，以加有溶剂的平板为对照；然后采用菌丝生长速率法测定荔枝霜疫霉对三种真菌抑制剂的敏感性。将荔枝霜疫霉菌株在白云豆平板上于25°C预培养7d，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含有三种药剂系列浓度的白云豆带毒平板中央(各浓度含等量有机溶剂)，于25°C下黑暗培养，7d后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径(菌落直径减去菌饼直径5_)，每处理重复3次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率(％)，抑制率(%) = [(对照菌落增长直径-处理菌落增长直径)/ (对照菌落增长直径)]X 100。测定了供试的三种真菌抑制剂对荔枝霜疫霉的毒力，结果如表I所示，不同浓度的多菌灵对荔枝霜疫霉的抑制率均低于10%，因此可以采用10-50 μ g/mL的多菌灵作为选择性药剂；苯醚甲环唑50 μ g/mL浓度的药剂对荔枝霜疫霉的抑制率在20%左右，20 μ g/mL浓度的苯醚甲环唑对荔枝霜疫霉的生长反而有促进作用，10 μ g/mL的浓度对荔枝霜疫霉也没有抑制作用，因此，可以采用10-20 μ g/mL浓度的苯醚甲环唑作为选择性药剂；咪鲜胺50 μ g/mL浓度的药剂对荔枝霜疫霉有促进作用，抑制率为-68. 7%。20和10 μ g/mL浓度的咪鲜胺对荔枝霜疫霉均没有抑制作用，所以也可以采用10-50 μ g/mL的咪鲜胺为分离荔枝霜疫霉中使用的选择性药剂。表I三种真菌抑制剂对荔枝霜疫霉的抑制作用


本发明公开了一种用于分离荔枝霜疫霉病菌的培养基。该培养基为如下Ⅰ或Ⅱ所示Ⅰ、是向白云豆培养基中添加由苯醚甲环唑、多菌灵、利福平和青霉素组成的杀菌剂得到的；Ⅱ、是向白云豆培养基中添加由苯醚甲环唑、咪鲜胺、利福平和青霉素组成的杀菌剂得到的。本发明的白云豆选择性培养基成本低廉、制作简便，且对细菌具有非常好的抑制作用。实验证明，用本发明的白云豆选择性培养基分离荔枝霜疫霉的方法，解决了荔枝霜疫霉等植物病原卵菌分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题；该方法分离效率高、可靠、省时、省力。