专利名称：一种海南霉素的发酵方法海南霉素是白色或类白色粉末，无臭无味，英文名Hainanmycin,分子式C47H80O15H2O,分子量884。海南霉素是中国自主开发的单价离子载体类抗生素兽药，在防止鸡球虫感染和提高反刍动物饲料转化率上具有显著效果，为高效抗球虫药物。它对革兰氏阳性菌如杆菌、球菌有广泛的抗菌谱，对厌氧及某些植物病原菌、水稻纹枯病和油菜菌核病等真菌也有抗菌作用；对革兰氏阴性菌不显活性。南海霉素还能提高饲料转化率，增进肉鸡体重，改善鸡肉品质，促进牛、羊等反刍动物的增长，被称为长肉素。海南霉素是从我国海南岛土壤中分离的一种稠李链霉菌东方变种(Streptomycespadanus Var dangfangeusls)培养液中提取出的,现今制备方法是取沙土管中的孢子，接种于斜面，28°C培养7天，接种2 3代斜面，备用，采用挖块法接种，发酵主要原料为淀粉、鱼粉。此方法孢子需在斜面上培养2-3代，难以保持菌种稳定，发酵单位无法达到生产要求。
本发明针对背景技术中提到的现有发酵海南霉素的不足，提供了一种海南霉素的发酵方法，该方法海南霉素发酵单位稳定，较现有发酵工艺发酵单位高，具备生产要求。本发明采用发酵法生产海南霉素，所用的稠李东方链霉菌(Streptomycespadanus var. dangfangeusls) SDSL-HNl 109 已于 2011 年 9 月 29 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 5308。该SDSL-HN1109菌株是通过以下几个阶段选育出来的 一、从稠李东方链霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls) HNl 菌株出发，经连续亚硝基胍诱变得到比出发菌株产量提高20 %的SDSL-HN337号高产菌株。二、将SDSL-HN337号高产菌株经氮离子注入诱变，得到较SDSL-HN337菌株产量提高15%的SDSL-HNl 109菌株，产量在5210ug/ml左右。本发明采用上述菌种生产海南霉素，其技术方案如下 一种海南霉素的发酵方法，其特征是以稠李东方链霉菌(Streptomyces padanusvar. dangfangeusls) SDSL-HN1109 CGMCC NO. 5308为菌种进行发酵制备，包括以下步骤 (1)将冷藏的稠李东方链霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls)SDSL-HNl 109 CGMCC NO. 5308沙土孢子接种到斜面培养基上，在28°C下培养7天； (2)用无菌水洗下步骤(I)斜面培养所得的孢子，加入甘油配成孢子悬浮液，在-70°C _80°C下保存备用；(3)将孢子悬浮液O. 2ml接种到45-60ml种子培养基中，在28°C培养40 42小时，得种子液；
(4)将种子液按照10 20%的接种量接种到发酵培养基中，在28°C培养90 144小时，得发酵液。上述方法中，稠李东方链霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls)HNl 109沙土孢子的制备方法是将菌种进行斜面培养，用接种针将所得孢子刮下，送入灭菌的沙土管中，搅动沙土，使粘附在接种针上的孢子与沙土充分混合，塞紧棉塞，敲松沙土，将沙土管放入真空干燥器内，常温下保持真空度O. 08 O. IMpa连续抽干40 60分钟，然后敲松沙土，将沙土管放入盛有变色硅胶的干燥器中，置于O 8°C冰箱中保藏备用。 上述方法中，斜面培养基组分包括玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸钙O. 8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,琼脂2. 0wt%,饮用水余量。在配制斜面培养基时，玉米淀粉在70 80°C糊化10分钟再与其他成分混合。上述方法中，种子培养基组分包括玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙
O.8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%，饮用水余量，pH7. 4 7. 9。上述方法中，发酵培养基组分包括豆油6 10wt%，黄豆饼粉2. O 3. 0wt%，葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸镁O. 08wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,氯化钠
O.2 wt%，饮用水余量，ρΗ7· 4 7. 9。上述步骤(2)中，制得的孢子悬浮液中，每毫升孢子悬浮液含有IXlO8 IXIOiq个孢子。上述步骤(2)中，甘油的浓度为20wt%，甘油与无菌水的体积比为1:1。上述步骤(3)中，优选的，孢子悬浮液O. 2ml接种到50ml种子培养基中。本发明通过诱变选育得到了高产量的稠李东方链霉菌变异菌株，利用此菌株发酵制备海南霉素，发酵结果稳定，重复性好，海南霉素产量大大提高。此外，与现有工艺相比，本发明在制备发酵种子时仅需要一次斜面培养，避免了传2 3代斜面，保证了菌种的纯度，避免了菌种污染，简化了操作，并且优化了发酵培养基组成及接种量，进一步的提高了海南霉素的产量。菌种保藏信息
稠李东方链霉菌(Streptomyces padanus var. dangfangeusls) SDSL-HN1109 已于2011年9月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为 CGMCC NO. 5308。

本发明在生产时，将选育所得海南霉素产生菌种放入沙土管中进行保存，其保存方法是将菌种进行斜面培养，用接种针将所得孢子刮下，送入灭菌的沙土管中，搅动沙土，使粘附在接种针上的孢子与沙土充分混合，塞紧棉塞，敲松沙土，将沙土管放入真空干燥器内，常温下保持真空度O. 08 O. IMpa连续抽干40 60分钟，然后敲松沙土，将沙土管放入盛有变色硅胶的干燥器中，置于O 8°C冰箱中保藏备用。 所用斜面培养基为玉米淀粉1. 0wt%,酵母粉1. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,琼脂 2. 0wt%o下面以上述制得的沙土孢子为菌种，进行发酵生产海南霉素，通过下列实施例进一步的解释、详述本发明。若无特别说明，下述实施例中所用培养基的组分含量均为重量百分比。实施例I
I、孢子斜面培养
在无菌条件下，用接种勺在沙土管内取出一勺沙土均匀散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均匀，瓶口用棉塞塞紧，外扎纱布，在28°C下培养7天；
所用斜面培养基为玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,琼脂2. 0wt%，饮用水余量。2、孢子悬浮液制备
使用50ml无菌水洗下培养所得的斜面孢子，然后加入等体积无菌的20wt%甘油，混合均匀后，制得孢子悬浮液，每毫升悬浮液中约含IO9个孢子，将悬浮液分装与5ml耐低温带盖塑料管中，在-70°C _80°C保存备用。3、种子液制备
按50ml种子液接种O. 2ml孢子悬浮液的比例接种种子培养基，在28°C培养40小时，得种子液。种子培养基为玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,饮用水余量4取.4 7.9。4、发酵培养
将种子液按发酵培养基体积的10%接入发酵培养基中，在28°C下培养90小时，发酵单位为3852u/ml。所用配方为豆油6wt%，黄豆饼粉2. 0wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸钙
O.5wt%，酵母粉O. 5wt%，硫酸镁O. 08wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,氯化钠O. 2 wt%，饮用水余量，pH7. 4 7. 9。实施例2
I、孢子斜面培养在无菌条件下，用接种勺在沙土管内取出一勺沙土均匀散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均匀，瓶口用棉塞塞紧，外扎纱布，在28°C下培养7天；
所用斜面培养基为玉米淀粉I. Owt%,酵母粉I. Owt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. Owt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,琼脂2. Owt%，饮用水余量。2、孢子悬浮液制备 使用50ml无菌水洗下培养所得的斜面孢子，然后加入等体积无菌的20wt%甘油，混合均匀后，制得孢子悬浮液，每毫升悬浮液中约含IO9个孢子，将悬浮液分装与5ml耐低温带盖塑料管中，在-70°C _80°C保存备用。3、种子液制备
按50ml种子液接种O. 2ml孢子悬浮液的比例接种种子培养基，在28°C培养40小时，得种子液。种子培养基为玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,饮用水余量4取.4 7.9。4、发酵培养
将种子液按发酵培养基体积的10%接入发酵培养基中，所用配方为豆油8wt%，黄豆饼粉2. 5wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸镁O. 08wt%,磷酸氢二钾
O.02wt%，氯化钠O. 2 wt%，饮用水余量，pH7. 4 7. 9。在28°C下培养120小时，发酵单位为5063u/ml。实施例3
I、孢子斜面培养
在无菌条件下，用接种勺在沙土管内取出一勺沙土均匀散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均匀，瓶口用棉塞塞紧，外扎纱布，在28°C下培养7天；
所用斜面培养基为玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,琼脂2. 0wt%，饮用水余量。2、孢子悬浮液制备
使用50ml无菌水洗下培养所得的斜面孢子，然后加入等体积无菌的20wt%甘油，混合均匀后，制得孢子悬浮液，每毫升悬浮液中约含109_101(1个孢子，将悬浮液分装与5ml耐低温带盖塑料管中，在_70°C _80°C保存备用。3、种子液制备
按50ml种子液接种O. 2ml孢子悬浮液的比例接种种子培养基，在28°C培养40小时，得种子液。种子培养基为玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,饮用水余量4取.4 7.9。4、发酵培养
将种子液按发酵培养基体积的20%接入发酵培养基中，所用配方为豆油1(^丨％，黄豆饼粉3wt%,葡萄糖2. Owt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸镁O. 08wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%，氯化钠O. 2 wt%，饮用水余量，pH7. 4 7. 9。在28°C下培养144小时，发酵单位为6770u/ml。实施例4
I、孢子斜面培养
在无菌条件下，用接种勺在沙土管内取出一勺沙土均匀散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均匀，瓶口用棉塞塞紧，外扎纱布，在28°C下培 养7天；
所用斜面培养基为玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,琼脂2. 0wt%，饮用水余量。2、孢子悬浮液制备
使用50ml无菌水洗下培养所得的斜面孢子，然后加入等体积无菌的20wt%甘油，混合均匀后，制得孢子悬浮液，每毫升悬浮液中含IO8-IO9个孢子，将悬浮液分装与5ml耐低温带盖塑料管中，在-70°C -80V保存备用。3、种子液制备
按45ml种子液接种O. 2ml孢子悬浮液的比例接种种子培养基，在28°C培养40小时，得种子液。种子培养基为玉米淀粉I. 0wt%,酵母粉I. 0wt%,碳酸I丐O. 8wt%,氯化钠O. 3wt%,黄豆饼粉O. 5wt%,葡萄糖I. 0wt%,蛋白胨O. lwt%,硫酸镁O. 05wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%,饮用水余量4取.4 7.9。4、发酵培养
将种子液按发酵培养基体积的20%接入发酵培养基中，所用配方为豆油8wt%，黄豆饼粉2. 5wt%,葡萄糖2. 0wt%,碳酸I丐O. 5wt%,酵母粉O. 5wt%,硫酸镁O. 08wt%,磷酸氢二钾O. 02wt%，氯化钠O. 2 wt%，饮用水余量，pH7. 4 7. 9。在28°C下培养144小时，发酵单位为6870u/ml。实施例5
按照实施例2的方法发酵生产海南霉素钠，不同的是种子培养时，按60ml种子液接种O. 2ml孢子悬浮液的比例接种种子培养基,最终发酵单位为4876u/ml。


本发明公开了一种海南霉素的发酵方法，步骤为将冷藏的稠李东方链霉菌SDSL-HN1109沙土孢子接种到斜面培养基上，28℃培养7天；洗下斜面培养所得的孢子，加入甘油配成孢子悬浮液，在-70℃～-80℃下保存备用；将孢子悬浮液0.2ml接种到45-60ml种子培养基中，28℃培养40～42小时，得种子液；将种子液按照10～20%的接种量接种到发酵培养基中，28℃培养90～144小时，得发酵液。本发明利用高产量的稠李东方链霉菌变异菌株制备海南霉素，发酵结果稳定，重复性好，产量高。此外，在制备发酵种子时仅需要一次斜面培养，保证了菌种的纯度，避免了菌种污染，简化了操作。