一种治疗器官纤维化的药物组合物及其制备方法和用途[0002]肺纤维化(Pulmonary fibrosis/PF)疾病是多种原因引起肺部炎症和肺泡持续性损伤及细胞外基质的反复破坏、修复、重建和过度沉积从而导致正常的肺组织结构改变和功能丧失的一类疾病谱，是多种原因引起慢性肺疾病的共同结局，是呼吸衰竭的主要病理基础，其病因和发病机制复杂，其确切的发病机制虽然目前尚未彻底阐明，但多种细胞因子及其网络的调控是其发生发展病理机制的极重要因素。[0003]肺纤维化属于国际关注度极高的一类难治性重大病种，国内外研究认为:纤维化是慢性病久治不愈的根本原因，也是其致残、致死的主因，有近50%的死亡与纤维化有关，而各种慢性肺病久治不愈的根本原因即在于其有纤维化病变。肺纤维化(PF)是器官纤维化中最具代表性、最典型最常发者，其病因复杂，除非典型肺炎可致PF外，很多肺系疾病均可导致PF，至少有150种以上病因与之相关。治疗上，目前尚仅限于非特异性抗炎、免疫抑制剂及糖皮质激素等方法，其共同特点是缺少特异性治疗，且大量使用抗生素和激素，这本身就是导致纤维化和加重纤维化的重要原因。随着其发病率、死亡率的不断上升，PF研究已成为世界关注热点，故寻求中医药等其他疗法已成当务之急。[0004]过去认为器官的纤维化一旦形成，就不能逆转。然而，上世纪九十年代以来，大量实验研究结果表明，包括肺纤维化在内的器官纤维化是可以逆转的。各种器官纤维化之所以都可以经过正确的治 疗和调理发生过程相似的逆转，是因为在细胞水平和分子水平上各种纤维化形成的过程就非常相似，具有殊途同归的特点。这些相似的发生过程提示，一种器官纤维化发生机制的研究结果，也适用于其他各种器官纤维化；对一种器官纤维化的有效治疗方法，对阻止、减轻其他各种组织器官纤维化也是有益的(Border WA.Evidencethat TGF-β should be a therapeutic target in diabetic nephropathy.KidneyInt, 1998，54:1390-1391.)。有鉴于此，国内外许多学者集中力量从一种器官纤维化的逆转开始，逐渐扩展到多种器官纤维化逆转的研究，获得了器官纤维化可以逆转的大量证据，其中包括肺纤维化。[0005]虽然肺纤维化具有治疗可逆性，但目前尚缺乏满意的西医药防治手段，这可能与肺纤维化发病的多因素、病变的多靶点、病理进程的多样性等相关。作为一种典型的复杂性疾病，以单靶点为主的西医化学药物经常显得无能为力，中医药等传统医学在器官纤维化的治疗方面拥有很大的潜力和优势，基于疗效确切的中医药开发抗器官纤维化的药物，特别是开发抗肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化的药物，前景日益广阔。[0006]中医认为肺纤维化属于典型的“本虚标实”病证，其病机为“病已久一本已虚”、“虚、阻相夹”，可归属中医络病范畴(李戎.论艾灸肺俞膏肓俞治疗肺纤维化的中医理论基础与施治依据.辽宁中医杂志，2004，31 (4):291-293.)。杨珂等报道了一种扶正化瘀方，主要成分为绞股蓝、丹参、冬虫夏草，用于抗大鼠肺纤维化，效果明显。专利号:CN201110162621.6，提供了一种治疗肺纤维化的药物组合物，其原料组成为:人参5_15份、丹参5-15份、当归1-11份、黄精5-15份、紫苏子5-15份、白芥子1_11份、枳实1_11份、紫金牛5-15份，可以抑制人胚肺二倍体纤维母细胞2BS细胞株增殖的功效，治疗肺纤维化。专利号:201110162761.3，提供了一种治疗肺纤维化的药物组合物，其原料组成为:人参5_15份、丹参7.5-22.5份、银杏叶7.5-22.5份、天门冬7.5-22.5份、黄精7.5-22.5份、瓜萎皮7.5-22.5份、当归2.5-7.5份、三七2.5-7.5份，可以改善器官纤维化患者临床症状及生存质量。[0007]根据目前的治疗情况而言，中医药在对器官纤维化(尤其是肺纤维化)的治疗上，取得了重大的研究进展，因此，从中医药角度出发研发治疗器官纤维化的新药，已成为当前的研究热点。


[0008]本发明的目的在于提供一种治疗器官纤维化的新药物组合物及其制备方法和用途。
[0009]本发明提供了一种治疗器官纤维化的药物组合物，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂:
[0010]小肺筋草干品30-40份或鲜品60-100份，大肺筋草干品15-20份或鲜品30-50份，栝楼10-15份，沙参15-18份，石斛10-15份，太子参15-18份，黄芪10-15份，三七3_7份，丹参10-15份，当归9-12份， 金银花10-15份，黄芩9_12份。
[0011]进一步地，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂:
[0012]小肺筋草干品30份或鲜品60-80份，大肺筋草干品15份或鲜品30_40份，栝楼18份，沙参18份，石斛15份，太子参18份，黄芪15份，三七5份，丹参15份，当归12份，金银花15份，黄芩12份。
[0013]更进一步地，所述黄芪为炙黄芪。
[0014]其中，所述药物组合物是由所述重量配比的原料药的水或/和乙醇提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
[0015]其中，所述制剂为经胃肠道吸收制剂。
[0016]本发明还提供了上述药物组合物的制备方法，它包括如下步骤:
[0017](I)按所述重量配比称取原料药；
[0018](2)加水煎煮，合并水煎液，加上药学上可用的辅料或辅助性成分制备成常规制剂。
[0019]本发明还提供了上述药物组合物在制备治疗器官纤维化的药物或辅助用药物中的用途。
[0020]进一步地，所述药物是治疗肺纤维化的药物。
[0021]进一步地,所述药物是提高肺组织内smad7含量的药物。
[0022]进一步地，所述药物是治疗气、阴、血俱亏，热郁咳嗽证型的肺纤维化的药物。
[0023]目前已公认“整体观念”、“辨证施治”、“复方使用”、“复方配伍用药如用兵”是中医最科学最有效的几大优势，其中“复方配伍用药如用兵”是非常科学的中医药原创理论。中医组方中各药如行兵布阵那样环环相扣的严密配伍，是其优于西医化学药配方的有效手段。中医方剂理论认为，每一方剂，不仅需要根据病因病机选择合适的药物妥善配伍，同时也应符合组方的基本结构，即“君、臣、佐、使”的组方配伍理论，所谓“君、臣、佐、使”的组方配伍，就是其建立在对疾病病机的全方位判断基础上的科学配比。中医用方通过多环节、多靶点整合调节的生物学机制，对肺纤维化这样具有发病多因素、病变多靶点、病理进程多样性(“三多”)等复杂特点、治疗困难的疾病或其症状进行调控，可以取得比西医化学药更好、更持久的治疗效果，且避免了西医化学药的毒副作用，而这种疗效是建立在上述中医传统原创理论的正确指导之上的，本发明药物组合物正遵循了这一原则。
[0024]本发明药物组合物中以小肺筋草和大肺筋草共同担当君药，清肺中郁热而治久嗽、宣肺而化痰。栝楼、金银花、黄芩可助君药清热止咳化痰，故命作臣药。太子参与炙黄芪补气，沙参与石斛养阴，可气阴双补，故遣为左路之佐药，从一侧面辅佐君臣增效。三七、丹参、当归三味，既可补血又可活血化瘀，且三七尚可助参芪补气，丹参则堪媲美“四物汤”，故同任右路之佐药，从另一侧面襄助君臣收工。方中未用甘草，不设使药，乃因各药本即甚为协合，无需专使调和而庶药效更为直接、专精。
[0025]以上君臣佐各组药味职司分明，相辅相成，充分发挥了中医学所独有的复方配伍用药如排军布阵般的思辨性科学研究方法论精髓，可共奏滋阴补气、养血活血、清肺止嗽之功效，并可改善肺部状况，对于本发明药物组合物所针对的肺纤维化特殊证型有着良好的治疗效果，为临床用药提供了一种新的选择。

[0026]本发明中所述小肺筋草，又名肺风草、肺痨草、肺痈草，为百合科植物肺筋草的全草或根；所述大肺筋草又名 脐风草、肺经草，为伞形科植物薄片变豆菜的全草；以上所述两种都并非“石韦”。
[0027]实施例1本发明药物组合物的制备
[0028]取小肺筋草干品30克，大肺筋草干品15克，栝楼18克，沙参18克，石斛15克，太子参18克，炙黄芪15克，三七5克，丹参15克，当归12克，金银花15克，黄芩12克。各药味按量称取，掺以足量的净水，武火煎沸后改文火再煎煮10分钟至12分钟，收集水煎液后，再加水煎煮2次，合并各次水煎液，即得汤剂。
[0029]本发明中，小肺筋草与大肺筋草均可用鲜品，其药效更佳，但其用量则需增加至干品重量的2倍到2.5倍。
[0030]实施例2本发明药物组合物的制备
[0031]取小肺筋草干品40克,大肺筋草干品20克,栝楼10克,沙参15克,石斛10克，太子参15克，炙黄芪10克，三七3克，丹参10克，当归9克，金银花10克，黄芩9克。先以70%v/v乙醇提取2次后，合并醇提液，药渣再以水煎煮2次，合并水煎液。分别将醇提液、水煎液浓缩后，混合，再加入适当糊精、可溶性淀粉，制粒，即得颗粒剂。
[0032]实施例3本发明药物组合物的制备
[0033]取小肺筋草干品40克,大肺筋草干品15克,栝楼18克,沙参18克,石斛15克，太子参18克，炙黄芪15克，三七7克，丹参15克，当归12克，金银花15克，黄芩12克。先以70%v/v乙醇提取2次后，合并醇提液，药渣再以水煎煮2次，合并水煎液。分别将醇提液、水煎液浓缩后，混合，再加入适量糊精、可溶性淀粉，制粒，压片，即得片剂。[0034]实施例4本发明药物组合物的制备
[0035]取小肺筋草干品30克，大肺筋草干品20克，栝楼18克，沙参18克，石斛15克，太子参18克，炙黄芪15克，三七5克，丹参15克，当归12克，金银花15克，黄芩12克。各药味按量称取，将蜈蚣酒洗去头足备用；掺以足量净水，以武火先煎麻黄、清半夏，再加入其余所有药味,至沸，改文火,再煎10分钟至12分钟后，收集水煎液，再加水煎煮2次，合并滤液，浓缩、干燥后，加入适量微晶纤维素，混匀后，装胶囊，即得胶囊剂。
[0036]实施例5本发明药物组合物的制备
[0037]取实施例1制备的汤剂，静置，取上清液，浓缩后，干燥，粉碎，备用；取适量聚乙二醇4000，熔融后，将上述药粉加入熔融基质中，75-85°C下保温；采用各型滴丸机，滴口内/外径及滴速适度，将其滴入二甲基硅油中，收集滴丸，即得滴丸剂。
[0038]以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
[0039]试验例本发明药物对大鼠实验性肺纤维化的治疗作用
[0040]1.实验动物和材料
[0041]1.1实验动物
[0042]健康SD大鼠80只，雌雄各半,体重180±20g,实验前单笼驯养I周,饲养温度和湿度分别为25°C和70%左右。
[0043]1.2实验药品
[0044]本发明药物组合物:由实施例1制备的汤剂，配成1.5g生药/ml的药液；
[0045]泼尼松:南通制药厂生产，用时研成粉末，以生理盐水溶解配成50%的混悬液。
[0046]博莱霉素A5 (BLMA5):天津河北制药厂，15mg/支,用时以无菌生理盐水稀释成4mg/ml的溶液。
[0047]艾灸条:成都市滨江灸条厂，国药准字号Z20027034。
[0048]氯化钠注射液:张家港市制药厂，100ml/瓶。
[0049]乙醚:天津市博迪化工有限公司。
[0050]1.3实验试剂及主要仪器
[0051]试剂盒:免疫组化、原位杂交成套试剂盒购自博士德生物工程有限公司。
[0052]图像采集及分析设备=Leica图像分析系统。
[0053]2.实验方法
[0054]2.1造模方法
[0055]除空白组外，其余3组以烟熏热郁刺激诱咳，即把大鼠放入顶部开放的约40cm X 40cm X 50cm的半封闭容器中，每日被动吸烟2次，每次7支香烟，持续4周，然后再复制肺纤维化大鼠模型，形成其气、阴、血俱亏，热郁咳嗽之体征。
[0056]肺纤维化造模:
[0057]采用国际上通用的博莱霉素(BLMA5)制作大鼠肺纤维化模型，该模型成功率高，为国际肺纤维化研究所通用，方法成熟。具体方法为，在乙醚麻醉下，将大鼠固定于手术板上，消毒后切开颈部皮肤， 逐层分离，充分暴露其气管，用Iml注射器抽取定量的博莱霉素A5稀释液(5mg/kg)，一次性缓慢注入气管内，立即将大鼠固定板直立旋转，使药物充分均匀散布于双肺，消毒，缝合；空白对照组的大鼠手术过程相同，气管内缓慢注射生理盐水(0.2ml/只)，缝合皮肤，几分钟后大鼠即可醒来自由觅食。[0058]2.2动物分组
[0059]实验用大鼠造模成功48只后随机分为4组:模型组、本发明药物组合物组(下称本方组)、本方与艾灸配合治疗组(下称药灸结合组)、激素治疗组(下称泼尼松组)，每组12只。另设空白对照组12只。
[0060]2.3动物治疗
[0061]①本方组造模7天后开始每只每天以本发明药物中剂量组按人剂量的10倍，即5g生药/kg给大鼠灌胃，每日1次，连续治疗一个月。
[0062]②药灸结合组造模后7天起除与本方组一样喂药之外，并固定大鼠，剪背毛，然后取其“肺俞”、“膏肓俞”穴(腧穴定位参照《实验针灸学》及《中国兽医针灸学》取穴)，用艾条施温和灸约10分钟，每天治疗一次，连续治疗一个月。
[0063]③激素治疗组造模后第7天开始每天腹腔内注射泼尼松5mg/kg体重，连续治疗一个月。
[0064]④空白组和模型组除每天采取同样的方法抓取、固定外，并按等容量生理盐水灌胃作为对照。
[0065]⑤治疗过程中，各组动物有不同程度的死亡。治疗结束后断头处死动物，开胸取肺，皆取左中肺，标本立即放入保存液中保存。每组随机取8个标本，备用以作检测。
[0066]3.检测指标与方法
[0067]3.1肉眼观察
[0068]3.1.1 一般情况观察
[0069]观察大鼠的食欲、神态、反应能力、被毛、肌肉及呼吸情况，并每10天称体重I次。
[0070]3.1.2标本的采集与处理
[0071]最后一次治疗后，称体重，断颈处死大鼠，开胸取肺组织，肉眼观察肺组织的形状、色泽、表面的状态、病灶的特征。均取左肺中叶，放入10%甲醛固定液中，常温保存。石腊包埋、切片。
[0072]3.1.3肺系数检测
[0073]肺系数:肺系数(LC)=肺湿重(g) /体重(kg)
[0074]3.2光镜观察
[0075]3.2.1肺组织病理学改变
[0076]对其肺组织进行HE染色，采用光镜观察其肺泡炎及肺纤维化程度。HE染色主要步骤如下:(1)肺组织石蜡包埋、切片；(2)梯度酒精脱蜡至水；(3)苏木素染色Imin ; (4)蒸馏水冲洗10min ; (5)70%盐酸酒精分化2s ； (6)蒸馏水冲洗5min ; (7)伊红复染Imin ；(8)梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；(9)光镜下观察。
[0077]根据Szapiel等的方法确定肺泡炎和肺纤维化的程度。利用HE染色的病理切片将肺泡炎分为四级:无肺泡炎(_);轻度肺泡炎(+ ):肺泡隔因细胞浸润增宽，病变范围局限在全肺的20%以下；中度肺泡炎(++):病变范围占全肺的20%-50% ;重度肺泡炎(+++):呈弥漫性分布，病变范围大于50%。将肺间质纤维化分为四级:无纤维化(_);轻度纤维化(+ ):受累范围小于20% ;中度纤维化(++):受累范围占全肺的20%-50%，肺泡结构紊乱；重度纤维化(+++):受累范围大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。
[0078]3.2.2免疫组化方法及步骤[0079]原理:利用抗原和抗体反应后，加入酶的相应底物，在酶的催化下，发生水解氧化，生成有色产物的显色反应，以揭示组织切片存在的微量抗原，供显微镜结合图像分析进行观察。
[0080]主要操作过程如下:(I)常规脱蜡至水；(2)滴加3%的过氧化氢10分钟去除内源性过氧化物酶；(3)蒸馏水洗涤，枸橼酸抗原热修复20分钟I~2次；(4)滴加正常山羊血清封闭液，每张切片20μ1，室温20min，甩去余液不洗；(5)滴加1: 150比例稀释的一抗4°C过夜；(6)滴加生物素化山羊抗小鼠IgG (二抗)，PBS洗3次;(7)滴加试剂SABC, 20~370C 20分钟，PBS洗4次；(8) DAB显色，镜下控制时间5~30分钟之间；(9)苏木素轻度核复染；(10)梯度酒精脱水、透明、封片。阴性对照组除用PBS代替一抗外，其他步骤相同。
[0081 ] 3.2.3原位杂交方法及步骤
[0082]原理:原位杂交是一种核酸杂交技术，以标记已知序列的DNA或RNA为探针与组织切片细胞中的DNA或RNA在位杂交，检测组织和细胞内特定基因的有无及表达情况，从而对组织细胞内特定的基因进行定性、定位和相对定量分析。
[0083]主要操作过程如下:(1)常规脱蜡至水；(2)滴加3%的过氧化氢10分钟去除内源性过氧化物酶，1%DEPC配的ddH20洗涤5分钟X 3次；(3)暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37°C或室温消化3~30分钟；1%DEPC配的PBS洗涤5分钟 X 3 次；(4) l%PFA/0.1MPBS (PH7.2-7.4)，室温后固定 10 分钟；1%DEPC 配的 ddH20 洗涤5分钟X3次；(5)预杂交:每张切片滴加20 μ I预杂交液置于恒温箱内3~4h (38~42°C )，吸取多余液体，不洗；(6)杂交:每张切片滴加20 μ I杂交液，盖上盖玻片，置于湿盒内放在恒温箱杂交过夜(38~42°C) ; (7)杂交后处理:揭掉盖玻片，37°C 2X SSC洗涤5分钟X 2次；37°C 0.5 X SSC洗涤15分钟X I次；37°C 0.2 X SSC洗涤15分钟X I~2次；
(8)滴加封闭液，37°C 30分钟，甩去多余液体不洗；(9)滴加生物素化鼠抗地高辛，37°C 60分钟，PBS洗涤5分钟X4次；(10)滴加试剂SABC, 37°C 20分钟或室温30分钟，PBS洗涤5分钟X 3次；(11)滴加生物素过氧化素酶，37 0C 20分钟或室温30分钟，PBS洗涤5分钟X 4次；(12) DAB显色，镜下控制显色时间20~30分钟，充分水洗；(13)苏木素核复染；(14)梯度酒精脱水、透明、封片。阴性对照除不加探针杂交液外，余步骤同。阳性细胞胞浆染色或少数胞核染色成棕色或棕黄色。
[0084]4.数据处理
[0085]结果以均数土标准差d 土S)表示，采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差
分析检验。等级资料结果采用Ridit分析。
[0086]5.实验结果
[0087]5.1肉眼观察
[0088]5.1.1 一般情况观察
[0089]表1 一般情况观察结果