专利名称：一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法刘正理等通过系谱追踪发现，目前谷子杂优利用研究中应用的雄性不育系细胞质类型，春谷雄性不育系几乎全部由“长10A”衍生而来，细胞质来源于“泌园母鸡嘴”(Cropscience, 2011, 51 (4) :1655-1663);夏谷雄性不育系几乎全部由“黄米1A”衍生而来，细胞 质来源于“大黄谷”(刘正理等，华北农学报，2006，21 (增刊):103-109)，谷子不育系细胞质类型过于单一，而细胞质呈母系遗传，因此不育系胞质类型的单一必然导致杂交种细胞质类型的单一。由于细胞质存在有专化性侵染病害，一旦遇专化性病害侵染，将会给谷子生产上带来毁灭性损失。传统的谷子雄性不育系的培育方法是依据性状互补的原则，以不育系做母本，选用能弥补不育系缺点的常规品种做父本进行杂交，利用杂交后代分离的不育材料，进行套袋自交，经过连续多代的选择，从中选育不育系。这种传统的不育系选育方法具有选育速度快、后代易稳定的优点，但由于母本均为原有的不育系，而细胞质呈母系遗传，因此，选育的不育系的细胞质类型仍为原有类型，通过这种方法选育的不育系并没有创制出新型细胞质类型的不育系。因此，传统的不育系选育方法不但不能解决不育系细胞质类型过于单一的问题，反而由于人们对骨干不育系的集中利用，使胞质来源单一的问题日益严重；同时，由于选用的常规材料多为育成品种的杂交后代，仅具有一些能克服不育系缺点的普通性状，缺少特殊的有益性状，导致选育的不育系不但胞质类型单一，而且缺乏谷子生产急需的抗除草剂等特殊有益性状，遗传基础也非常狭窄，与常规品种亲缘关系越来越近，不易配制强优势杂交种。到目前为止，在谷子上，未见开展不同胞质类型不育系培育的报道，更未见培育不同胞质类型抗咪唑乙烟酸不育系的报道。
本发明的目的在于克服上述谷子雄性不育系细胞质类型单一、不抗除草剂的技术缺陷，而提供一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法。本发明的原理是将谷子育种材料细胞质来源进化树与谷子育种材料的母本衍生进化图结合，在确定对进化树进行纵切的特定遗传相似系数的基础上，对现有谷子育种材料的细胞质类型进行划分；将现有不育系的不育基因导入到含有抗咪唑乙烟酸基因的谷子正常可育株中，创制桥梁亲本，通过桥梁亲本将不育基因和抗咪唑乙烟酸基因遗传给后代；以桥梁亲本为父本，以不同胞质类型、具有目标性状的系列常规材料做母本，通过母本代换创制出了将新型胞质与不育基因、抗咪基因聚合到一起三交I代，然后在喷施除草剂杀除不抗除草剂后代的基础上，对抗除草剂的不育后代连续套袋自交4-6代，辅之以连续的人工定向选择，即可培育出不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系。本发明主要的发明点在于对不同细胞质来源的谷子育种材料类型进行划分、利用桥梁父本将不育基因和抗咪唑乙烟酸除草剂基因遗传给后代、利用母本代换创制系列不同胞质类型的三交I代，进而培育不同胞质类型抗除草剂的谷子雄性不育系。本发明提供了一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于包括以下步骤I.谷子育种材料细胞质类型的划分；II.桥梁父本的创制；III.不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂三交I代的创制；IV.不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子雄性不育系的创制。所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征 在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分包括如下步骤(I)细胞质来源进化树的构建；(2)母本衍生进化图的构建；(3)特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类；(4)谷子育种材料细胞质类型的确定。所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(I)所述的细胞质来源进化树的构建包括如下步骤①叶片组织的培养与获取将谷子育种材料的种子种于育苗盘中获得谷子幼苗，于4叶期分别剪取育种材料的叶片组织；②全基因组DNA的提取采用CTAB法提取步骤①中叶片组织的全基因组DNA ；③PCR扩增采用20 μ I反应体系，利用线粒体特异引物对步骤②提取的基因组DNA进行37个反应循环PCR扩增；④多态性检测利用凝胶电泳法对步骤③中线粒体的PCR扩增产物进行多态性检测；⑤细胞质来源进化树的生成对步骤④中电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现的带记为“0”，生成由“I”和“O”组成的原始矩阵，用NTSYS-PC2. I软件进行数据分析，用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类分析，生成细胞质来源的进化树。所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(2)所述的母本衍生进化图的构建为利用系谱追踪法将谷子育种材料按步骤(I)中进化树的排列顺序进行纵向排列，通过逐代向上追踪育种材料的母本，直到追踪到农家品种为止，依据系谱将同一母本衍生的育种材料按照衍生关系逐步连接起来，形成母本衍生进化图。所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类为将步骤(2)构建的谷子育种材料的母本衍生进化图与步骤(I)中构建的谷子育种材料的胞质来源进化树相结合，并进行比较分析，确定基本能将同一母本衍生系统聚为一个分枝的特定遗传相似系数，在该遗传相似系数下对步骤(I)中构建的谷子育种材料的胞质来源进化树进行纵切，将谷子育种材料进行胞质来源的分子聚类，分子聚类图中每个分枝代表一个胞质类群。所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(4)所述的谷子育种材料细胞质类型的确定是将步骤(3)中的分子聚类图与步骤(2)中构建的母本衍生进化图结合，将胞质来源分子聚类图中的每个分枝与对应的母本衍生系统逐一进行对比，确定每个类群材料的细胞质类型，完成对谷子育种材料细胞质类型的划分。所述的ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(I)所述的细胞质来源进化树的构建中步骤①中所述的谷子育种材料为延谷12、长高117A、大同29紫、冀谷26、冀谷30、坝谷214、安9217、保182、冀谷12、石06-766、延谷13、冀谷20、冀谷22、谷65、冀谷21、大同27、赤谷10、承谷12、大同30、豫谷6、大同14、郑9188、大同28、铁8240、锦谷12、锦谷14、朝438、公谷68、铁487、铁谷6、复532、晋汾I、沧156、济谷13、长高229A、S80、冀谷29、公谷70、石 206065、大同 29 绿、安 2491、兴谷 88、晋 15、晋汾 3、沧 344、Y61、石 02399、C138、C208、朝谷12、K523、L70、铁大粒黄、K359、朝谷13、谷83、衡968、济9403、冀谷27、济9409、鲁谷10、济谷 12、济谷 11、谷 6、石 02521、石 98700、石 207382、石 207393、石 02530、石 207286、安4852、谷 3、冀谷 25、石 207191、长高 146A、石 207226、石 206058、公谷 65、C164,203184 早、安2367、石202242、谷57、冀谷24、谷丰2号、石06-439、谷38、小香米、冀谷19、K1130、坝 谷214-2、谷11、K1011、长农36、冀谷28、长农35、晋谷35、太选5号、太选2号、晋谷21、谷95、晋谷29、朝谷14、K660、美国大头、谷10、K546、朝绿-I、晋谷16、石98622和石97672共111 份。所述的ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(2)所述的母本衍生进化图的构建中111份谷子育种材料中12份来源于同一母本材料沁源母鸡嘴、13份材料来源于同一母本材料黄软谷、63份材料来源于同一母本材料日本60日、6份材料来源于同一母本材料硬穗谷、5份材料来源于同一母本材料黑枝谷，12份材料未追踪到其母本，便于研究命名为系谱丢失I型和系谱丢失II型。所述的ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类中特定遗传相似系数为0. 74，在该遗传相似系数下对步骤(I)中所述的细胞质来源进化树的构建中所构建的进化树进行纵切，将其纵切为7个分枝，每个分枝代表I个胞质来源的分子类群，这样将胞质来源进化树纵切为7个类群，纵切结果与母本衍生进化图一致性达98. 2%。所述的ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(4)所述的谷子育种材料细胞质类型的确定中将步骤(3)中所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类中构建的分子聚类图与步骤(2)中所述的母本衍生进化图的构建中所构建的母本衍生进化图相结合，进行逐一对比，确定各类群材料的胞质类型，分别为来源于“泌园母鸡嘴”的Q型，来源干“日本60日”的R型，来源干“黄软谷”的H型，来源干“硬穗谷”的Y型，来源于“黑枝谷”的S型，还有两种由于系谱丢失，追踪不到母本来源，分别定名为M I型和M II型。所述ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤II所述的桥梁父本的创制为以谷子高度雄性核不育系做母本，以谷子抗咪唑こ烟酸材料做父本配置杂交组合，成熟后收获杂种I代种子；种植杂种I代种子于3-5叶期，喷施咪唑こ烟酸除草剂杀死假杂种，正常成活的植株为含有不育基因和抗咪唑こ烟酸基因的真杂种，即桥梁父本。所述ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤II桥梁父本的创制中所述的谷子高度雄性核不育系材料为长高229A、长高146A、长闻117A等其中的一个。所述ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤II桥梁父本的创制中所述的谷子抗咪唑こ烟酸材料为M200、M117、M302、M195、M150等其中的ー个。所述ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤III所述的谷子不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂三交I代的创制为以步骤I中划分的不同胞质类型的谷子育种材料为母本，以步骤II创制的桥梁父本为父本配制不同胞质三交组合，获得不同胞质类型抗咪唑こ烟酸三交I代种子。 所述ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤IV所述的不同胞质类型的抗咪唑こ烟酸雄性不育系的创制包括如下步骤①三交I代假杂种和不抗除草剂单株的去除种植步骤III中获得的三交I代种子，于3-5叶期喷施咪唑こ烟酸除草剤，杀除假杂种和其中不抗咪唑こ烟酸的杂交后代，存活下来的为抗咪唑こ烟酸除草剂的杂合可育株和纯合可育株，抽穗期全部套袋自交，蜡熟期从中选择优良单株作为三交2代种子；②后代的选择种植步骤①中获得的三交2代种子，于3-5叶期喷施咪唑こ烟酸除草剤，杀除其中分离的不抗咪唑こ烟酸除草剂的不育株和可育株，存活下来的为抗咪唑こ烟酸除草剂的不育株和抗咪唑こ烟酸除草剂的可育株两种类型，抽穗期选择其中的不育株，全部套袋，蜡熟期按穗行从中选择优良不育单株，作为三交3代种子供下代继续选择；如此连续经过4-6代的套袋自交和选择，可获得稳定的多种胞质类型的抗咪唑こ烟酸谷子雄性不育系。所述的ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤II所述的桥梁父本的创制中以谷子不育系长高229A为母本，以抗咪唑こ烟酸谷子除草剂中间材料M302为父本配制杂交组合进行Y型胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂雄性不育系的创制。所述的ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤III所述的谷子多种胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂三交I代的创制为用Y型胞质谷子育种材料晋谷35为母本，与上述创制的桥梁父本进行杂交，创制Y型胞质的三交I代。所述的ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤II所述的桥梁父本的创制中以谷子不育系长高146A为母本，以抗咪唑こ烟酸谷子除草剂中间材料M195为父本配制杂交组合进行S型胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂雄性不育系的创制。所述的ー种不同胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其特征在于步骤III所述的谷子多种胞质类型抗咪唑こ烟酸除草剂三交I代的创制为用S型胞质谷子育种材料复532为母本，与上述创制的桥梁父本进行杂交，创制S型胞质的三交I代。有益效果利用本发明可培育出不同胞质类型的抗咪唑こ烟酸谷子雄性不育系，丰富了谷子不育系的胞质类型，为培育不同胞质类型的杂交种奠定基础，可解决由于胞质类型单一，容易遭受专化性病害侵染的难题，避免由于细胞质专化性病害的侵染给农业生产带来的巨大损害。同时本发明由于将不育基因和抗咪唑こ烟酸基因聚合在谷子不育材料中，通过喷施咪唑こ烟酸除草剤，杀除不育系繁种田的杂草，可有效的解决不育系繁种田人工除草费エ费时的难题。图1-1和图1-2是谷子育种材料线粒体的PCR扩增多态性检测图谱； 图中，M为Marker ;V1_V111分别代表111份谷子育种材料延谷12、长高117A、大同29紫、冀谷26、冀谷30、坝谷214、安9217、保182、冀谷12、石06-766、延谷13、冀谷20、冀谷22、谷65、冀谷21、大同27、赤谷10、承谷12、大同30、豫谷6、大同14、郑9188、大同28、铁8240、锦谷12、锦谷14、朝438、公谷68、铁487、铁谷6、复532、晋汾I、沧156、济谷13、长高229A、S80、冀谷29、公谷70、石206065、大同29绿、安2491、兴谷88、晋15、晋汾3、沧344、Y61、石 02399、C138、C208、朝谷 12、K523、L70、铁大粒黄、K359、朝谷 13、谷 83、衡 968、济 9403、冀谷 27、济 9409、鲁谷 10、济谷 12、济谷 11、谷 6、石 02521、石 98700、石 207382、石 207393、石 02530、石 207286、安 4852、谷 3、冀谷 25、石 207191、长高 146A、石 207226、石206058、公谷 65X164,203184 早、安 2367、石 202242、谷 57、冀谷 24、谷丰 2 号、石 06-439、谷38、小香米、冀谷19、K1130、坝谷214-2、谷11、K1011、长农36、冀谷28、长农35、晋谷35、太选5号、太选2号、晋谷21、谷95、晋谷29、朝谷14、K660、美国大头、谷10、K546、朝绿-I、晋谷16、石98622、石97672的DNA ；A为标准条帯，“帯”的顔色深于或同于“A”的条带记为“1”，浅于1”的条带记为“0”。图2-1、2_2和2-3是111份谷子育种材料的细胞质来源进化树的三个组成部分，三者按顺序拼接在一起即得进化树全图；图中，0.55,0. 66,0. 78,0. 89、I. 00 为遗传相似系数图3-1、3_2和3-3是111份谷子育种材料的母本衍生进化图的三个组成部分，三者按顺序拼接在一起即得母本衍生进化图全图；图中，用实线连接的是母本来源明确的材料；用虚线连接的是母本来源不明确，但分子聚类将它们与相应的实线部分聚为ー个类群的材料；沁源母鸡嘴、黄软谷、日本60日、硬穗谷、黑枝谷、系谱丢失I型和系谱丢失II型代表育种材料不同母本的来源。图4-1、4_2和4-3是111份谷子育种材料的细胞质来源的分子聚类图的三个组成部分，三者按顺序拼接在一起即得分子聚类图全图；图中，0. 55,0. 66,0. 78,0. 89、I. 00为遗传相似系数；L代表对进化树进行纵切的特定遗传相似系数0. 74 ;B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7表示在特定遗传相似系数0. 74下对进化树纵切后形成的7个分子类群。图5是谷子育种材料细胞质类型划分图
图中，BI分子类群和沁源母鸡嘴母本衍生系统对应，定位Q型；B2分子类群和黄软谷母本衍生系统对应，定位H型；B3分子类群和日本60日母本衍生系统对应，定位R型；B4分子类群和硬穗谷母本衍生系统对应，定位Y型；B5分子类群对应的母本衍生系统系谱丢失，定位M I型；B6分子类群和黑枝谷母本衍生系统对应，定位S型；B7分子类群对应的母本衍生系统系谱丢失，定位M II型；a对应图4-1，b对应图4-2，c对应图4_3 ;d对应图3-1，e对应图3-2，f对应图3-3。下面结合具体实施例对本发明作进ー步阐述，但不以任何方式限制本发明的范围。



本发明公开了一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法，其包括以下步骤(1)谷子育种材料细胞质类型的划分；(2)桥梁父本的创制；(3)不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂三交1代的创制；(4)不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子雄性不育系的创制。通过该方法培育出不同胞质类型不育系，不但丰富了现有不育材料的胞质类型，为培育不同胞质类型的杂交种奠定基础，可解决以前由于胞质类型单一，容易遭受专化性病害侵染的难题，避免由于细胞质专化性病害的侵染给农业生产带来的巨大损害。而且本发明培育的谷子不育系还具有抗咪唑乙烟酸特性，解决了不育系繁种过程中除草困难的难题。