专利名称：：游离酶催化生产生物柴油新工艺的制作方法：脂肪酸短链酯是许多行业如食品、纺织、塑料、化妆品等常用到的化学物质，通常它被当作一种重要的工业添加剂和表面活性剂。1984年美国和德国等国的科学家研究了采用脂肪酸甲酯或乙酯代替柴油作燃料，即采用来自动物或植物脂肪酸单酯(包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯及脂肪酸丙酯等)代替柴油燃烧，得到了令人满意的效果，随后将其命名为生物柴油。生物柴油和传统的石油系柴油相比，具有以下优点(1)以可再生的动物及植物脂肪酸单酯为原料，可减少对石油的需求量和进口量；(2)环境友好，与普通柴油相比，采用生物柴油车辆的尾气中有毒有机物的排放量仅为1/10，颗粒物为20%，0)2和SO2的排放量仅为10%，无SO2和铅及有毒物质的排放；混合生物柴油可将排放物中的含硫物质量分数从5X10_4降低到5X10_6。(3)不用更换发动机，且对发动机有保护作用。目前，工业上生产生物柴油的方法多为化学法生产，即利用酸、碱催化剂在高温高压下催化酯化反应来合成脂肪酸短链酯。化学法的生产过程虽然产率较高，但是也存在许多难以克服的缺点。如高温高压反应能耗高、副反应多，产物色泽深、分离和精制困难等，而且酸碱对设备腐蚀严重，不利于生产。随着生物技术的发展，特别是酶生物技术的发展，为生物催化合成脂肪酸短链酯提供了新的方法。与传统的化学法相比较，酶法具有反应条件温和，特异性强，副反应少，产品质量水平高等优点。特别是利用酶法催化生产生物柴油具有例如反应条件温和，醇用量小、无污染物排放等化学法无法比拟的优点。MamoryIso(MamoruIso,BaoxueChen，MasahiEguchi,etal.Productionofbiodieselfuelfromtriglyceridesandalcoholusingimmobilizedlipase[J].JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic，2001，16:53_58)等人研究了利用多孑L的高岭土微粒固定化Pseudomonasfluorescens(LipaseAK)催化甲醇、乙醇、丙醇、丁醇制备脂肪酸短链醇酯。反应釆用1，4_二氧杂环己烷为溶剂，分别催化三油酸甘油酯和葵花油反应，转化率达到90%。YujiShimada(ShimadaY.，WatanabeY.，SamukawaT.，SugibaraA.，NodaI.L.，FukudaI.-I.，TominagaY.，ConversionofvegetableoiltobiodieselusingimmobilizedCandidaantarcticalipase[J],J.Am.OilChem.Soc.,1999，76:789-793.)等人采用分三段添加甲醇的方法进行反应，使用3个填充固定化脂酶反应柱，每10小时流加Imol甲醇的方法可使转化率达到93%左右。Nelson等人(NelsonL.A.,FogliaΤ.A.,MarmerW.N.,Lipase-catalyzedproductionofbiodiesel[J],J.Am.OilChem.Soc.，1996，73:1191-1195)利用Novozym435(CandidaAntarcticalipase)催化动物油脂甲酯化反应，采用正己烷为溶剂，转化率达到90%以上。MasaruKaieda等人(MasaruK.,TaichiS.,AkihikoK.,EffectofMethanolandWaterContentsonProductionofBiodieselFuelfromPlantOilCatalyzedbyVariousLipasesinaSolvent-FreeSystem[J],J.Biosci.Bioeng.,2001,91:12_15.)利用Rhizopusoryzae脂肪酶，采用无溶剂体系生产生物柴油。发现在无水条件下，脂肪酶几乎不能催化反应；在水含量为4-30衬％的情况下，采用分步加入甲醇的方法，反应最高转化率可以达到80-90N.R.Kamini(KaminiN.R.,IefujiH.,LipasecatalyzedmethanolysisofvegetableoilsinaqueousmedUmbyCryptococcusspp.S~2[J],ProcessBiochem.,2000,37=405-410.)采用Cryptococcusspp.S_2lipase催化反应，利用正己烷为溶剂，通过改变体系中水含量，使反应不需要流加甲醇，转化率一步达到80.2%。以上方法仍然停留在实验室研究阶段。TaichiSamukawa等人(SamukawaT.，KaiedaM.，MatsumotoT.，BanK.，KondaA.，ShimadaY.，NodaH.，FukudaH.，PretraetmentofimmobilizedCandidaantarcticalipaseforbiodieselfuelproductionfromplantoil[J],J.Biosci.Bioeng.,2000,90:180-183.)的研究表明，固定化酶的预处理可以大大提高反应速度和转化率。当利用油酸甲酯浸泡NOVOZyme4350.5小时，然后利用豆油冲洗残留在固定化酶上的油酸甲酯，并利用豆油浸泡酶12小时；这样的处理可以使酶的初始反应速度提高3-5%，总转化率可以提高10%。台湾清化大学吴文藤等人研究专利(ChenJ.W.，ffu,W.T.，Pretraetmentofimmobilizedlipaseforbiodieselproduction[P],PatentNo:US6398707B1,2002.)中，利用碳数大于3的长链醇和油分别预先浸泡固定好的脂肪酶进行预处理，可以提高脂肪酶的催化活性8-10倍；并且，当作为催化剂的酶失活后利用生物柴油浸泡一定时间后，酶的活性可以在一定程度上得到恢复。目前国内外的酶法生产生物柴油工艺均采用Novozyme435,NovozymeTLIM,NovozymeRMIM等固定化酶作为催化剂。但商业固定化酶价格均较高，限制了酶法生产生物柴油技术的市场推广。固定化载体难于重复利用，催化剂失活后载体后处理会造成固体垃圾污染。若使用游离脂肪酶催化生物柴油反应则可避免上述问题，但是甲醇等短链醇对游离脂肪酶具有很强的失活作用，同时游离脂肪酶难于回收利用，因此，目前直接利用游离脂肪酶催化生产生物柴油的研究较少，且反应转化率较低，并无实际应用价值。
本发明的目的是提供一种利用游离脂肪酶催化合成脂肪酸短链酯(生物柴油)的方法。本发明的技术方案包括将游离脂肪酶和添加剂按比例混合后用于反应催化剂，反应器采用搅拌罐式反应器，多次分批加入短链醇进行反应，反应结束后，停止搅拌，使游离脂肪酶连同添加剂沉降分离，移出上层油相(生物柴油)后再次加入油脂反应。主要技术内容如下1.游离脂肪酶与添加剂的混合将游离脂肪酶与添加剂按11-2质量比例充分混合均勻，作为反应催化剂待用。2.脂肪酸短链酯的合成将原料油加入反应器，预热至35-45°C;按0.25%-0.4%wt(酶/油)加入混合后催化剂，同时加入原料油重量2%-8%wt的水，充分混合。短链醇采用分次或一次加入，反应共进行20-32小时，反应过程中控制反应温度为35-50°C。3.反应结束后停止搅拌，静置反应液15分钟，待反应液油水两相分离后，移出上层油相(生物柴油)，并按照比例重新加入原料油。本发明中步骤2.3可以重复，以充分利用催化剂。本发明中短链醇与原料油的摩尔比为1-1.21，反应采用搅拌式反应，反应温度为35°C-50°C；反应可以采用间歇式或通过多级串联搅拌式反应器实现连续反应；短链醇分15-30次流加，每小时加入1/15-1/30摩尔当量；反应体系可采用无溶剂或有溶剂体系；催化剂用量为原料油重量的0.25%-0.4%，反应时间为20-30小时。所述溶剂为石油醚，正己烷，环己烷，正庚烷，石化柴油，叔丁醇，丙酮，乙酸甲酯或乙酸乙酯。所述脂肪酶为游离脂肪酶粉、脂肪酶液及脂肪酶发酵液，所述脂肪酶为微生物脂肪酶，或动物脂肪酶。采用的脂肪酶如下Candiasp.99-125脂肪酶，北京凯泰生物技术有限公司生产；Candidaantarctica脂肪酶，sigma等公司商业化脂肪酶。所述添加剂为多羟基糖类及其衍生物，包括环糊精、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精或工业糊精。所述原料油为脂肪酸或生物油脂，包括植物油脂、动物油脂、废弃食用油脂、油厂炼油脚料或微生物油脂。所述短链醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇。所述反应器为搅拌式反应器；所述反应可单级间歇式操作，也可采用多级串联连续操作。CH2OCOR脂肪酶CjH2OHAhocor+3Ch3oh_3ch3cor+chohah2OCORCIh2oh本发明得到的脂肪酸短链酯(生物柴油)的各项指标均达到国家生物柴油标准及德国生物柴油的标准。可以应用于能源领域。有益效果本发明采用游离脂肪酶同添加剂混合共同催化生产生物柴油。本发明的有益效果如下(1)采用添加剂连同游离脂肪酶作为反应的催化剂，利用添加剂对游离脂肪酶的保护作用，降低了短链醇对游离脂肪酶的毒性作用，增加了酶的使用寿命，提高了反应转化率；(2)由于添加剂的作用，增加了油水两相的混合程度，并提高了游离脂肪酶在反应体系内的分散程度，提高了反应转化率。反应转化率大幅度提高，可达到85%-92%。(3)由于添加剂的作用，使得反应后反应液能够迅速分相，并保证游离脂肪酶和添加剂全部沉降在水相，使得游离脂肪酶可重复利用。游离脂肪酶可重复利用5-8批次。降低了反应的催化剂成本。与其他酶催化生产生物柴油技术相比较，本方法采用了游离脂肪酶催化，节省了固定化成本，从而降低了催化剂成本。节省了固定化载体及固定化工艺的成本。与化学法相比，本发明反应工艺简单，稳定性良好，反应条件温和、能耗低，反应过程无污染排放，可以使用含有大量游离脂肪酸的废油作为原料，降低了生产成本。同时，由于采用了生物催化剂，反应特异性强，副产物少，节省了后期的分离提取费用。产品的色泽浅、脂肪酸短链酯含量高。澄清透明，产品质量高，成本低，从而为脂肪酸短链酯(生物柴油)的工业化生产提供了一种新的方法。具体实施例方式例1实验室采用三口烧瓶为反应器，添加600g酸价为133mgK0H/g的地沟油为原料，预热至40°C，加入油重2%的水后充分混合，保持温度40°C，将活力为20，000U/g的游离脂肪酶2.4g同环糊精4.Sg充分混合后加入反应器。甲醇分15次加入，每2小时加入4.6g。反应过程维持水浴温度40°C，反应结束后停止搅拌，静置反应液15分钟，待反应液油水两相分离后，移出上层油相(生物柴油)，并按照比例重新加入原料油。搅拌反应30小时后反应转化率为92%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶。游离脂肪酶重复利用8批次。例2基本方法通例1以600g酸价为133mgK0H/g的地沟油为原料，水含量为油重的2%，添加酶活力为20，000U的游离脂肪酶2.4g，葡萄糖4.8g。40°C水浴加热，甲醇分30次加入，每1小时加入2.3g。搅拌反应30小时。反应转化率95%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶。例3基本方法通例1以600g酸价为166mgK0H/g的地沟油为原料，水含量为油重的2%，添加酶活力为50，000U的游离脂肪酶1.Sg,乳糖3.6g。甲醇分15次加入，每2小时加入4.6g。40°C水浴加热，搅拌反应30小时。反应转化率93%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶。例4基本方法通例1:添加色拉油(AV=0.52mgK0H/g)600g。水含量为油重8%，添加酶活力为50，000U的游离脂肪酶1.8g，添加环糊精3.6g。甲醇分30次加入，每1小时加入2.3g。40°C水浴加热，搅拌反应30小时。反应转化率83%。采用sigma商业化脂肪酶例5基本方法通例1添加油脂厂酸化油(AV=85mgK0H/g)600g。水含量为油重3%，酶活力为50，000U的游离脂肪酶1.8g，添加葡萄糖3.6g。甲醇分15次加入，每2小时加入4.6g。40°C水浴加热，搅拌反应30小时。反应转化率88%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶例6基本方法通例1以600g酸价为166mgK0H/g的地沟油为原料，水含量为油重的2%，酶活力为20，000U的游离脂肪酶2.4g，环糊精4.8g。甲醇分15次加入，每2小时加入4.6g。40°C水浴加热，搅拌反应30小时。单批反应转化率93%。反应后静置分离生物柴油相，并加入新原料油继续反应，游离脂肪酶共重复使用8次，反应平均转化率为82%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶例7基本方法通例1600g酸价为133mgK0H/g的地沟油，水含量为油重的2%，添加酶活力为20，000U的游离脂肪酶2.4g，环糊精4.Sg。乙醇分15次加入，每1小时加入4.6g。40°C水浴加热，搅拌反应15小时。反应转化率89%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶。例8基本方法通例1600g猪油为原料，水含量为油重的2%，添加酶活力为20，000U的游离脂肪酶2.4g，环糊精4.Sg。利用300ml正己烷作为溶剂，丙醇分30次加入，每2小时加入4.6g。40°C水浴加热，搅拌反应30小时。反应转化率89%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶。例9基本方法通例1:采用200L搪瓷搅拌反应釜为反应器，地沟油(AV=120mgK0H/g)150kg。水含量为油重2%，添加酶活力为20，000U的游离脂肪酶600g，添加可溶性淀粉900g。丙醇分30次加入，40°C水浴加热，搅拌反应30小时，反应温度38°C。反应转化率88%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶。例10基本方法通例1采用5000L搅拌反应釜为反应器，地沟油(AV=177mgK0H/g)4吨。水含量为油重2%，添加酶活力为80，000U的游离脂肪酶4kg，添加葡萄糖6kg。搅拌反应30小时，反应温度38°C。反应转化率90%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶。例11基本方法通例1:采用5000L搅拌反应釜为反应器，添加酸化油(AV=90mgK0H/g)4吨。水含量为油重2%，添加酶活力为80，000U的游离脂肪酶4kg，添加糊精6kg。搅拌反应30小时，反应温度38°C。反应转化率88%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶。例12基本方法通例1采用5000L搅拌反应釜为反应器，添加地沟油(AV=177mgK0H/g)4吨。水含量为油重2%，添加酶活力为80，000U的游离脂肪酶4kg，添加工业糊精6kg。搅拌反应30小时，反应温度38°C。反应转化率92%。采用北京凯泰生物技术有限公司生产的Candiasp.99-125脂肪酶。权利要求一种游离酶催化生产生物柴油新工艺，包括如下步骤(1)游离脂肪酶与添加剂的混合将游离脂肪酶与添加剂按1∶1-2质量比例混合；(2)脂肪酸短链酯的合成原料油加入反应器，预热至35-45℃。按0.25％-0.4％wt(酶/油)加入混合后催化剂，加入原料油重量2％-8％wt的水，混合；短链醇采用分次或一次加入，反应共进行20-32小时，反应过程中温度为35-50℃；(3)反应结束后停止搅拌，静置反应液15分钟，待反应液油水两相分离后，移出上层油相(生物柴油)，并按照比例重新加入原料油。2.根据权利要求1所述的游离酶催化生产生物柴油新工艺，其特征在于所述短链醇与原料油的摩尔比为1-1.21。3.根据权利要求1或2所述的游离酶催化生产生物柴油新工艺，其特征在于所述短链醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇。4.根据权利要求1所述的游离酶催化生产生物柴油新工艺，其特征在于所述脂肪酶为游离脂肪酶粉、脂肪酶液及脂肪酶发酵液，所述脂肪酶为微生物脂肪酶或动物脂肪酶。5.根据权利要求1所述的游离酶催化生产生物柴油新工艺，其特征在于所述原料油为脂肪酸或生物油脂。6.根据权利要求1所述的游离酶催化生产生物柴油新工艺，其特征在于所述原料油为动物油脂、废弃食用油脂、油厂炼油脚料或微生物油脂。7.根据权利要求1所述的游离酶催化生产生物柴油新工艺，其特征在于所述添加剂为多羟基糖类及其衍生物。8.根据权利要求1或7所述的游离酶催化生产生物柴油新工艺，其特征在于所述添加剂为环糊精、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精或工业糊精。9.根据权利要求1所述的游离酶催化生产生物柴油新工艺，其特征在于所述短链醇分15-30次流加，每小时加入1/15-1/30摩尔当量。全文摘要本发明公开了一种利用游离酶催化合成脂肪酸低碳醇酯即生物柴油的工艺。采用环糊精等糖类作为添加剂与游离脂肪酶混合后用于催化反应，采用搅拌式反应器，多次分批加入甲醇，利用无溶剂或有机溶剂体系，在40-50℃范围内生产生物柴油，15-30小时反应转化率可以达到80-96％；反应后游离酶同添加剂易于沉降回收，可重复使用5-8次。与同类酶催化生产生物柴油技术相比较，本方法具有成本低、转化率高、操作简便、生产稳定等优点。文档编号C12P7/64GK101812485SQ201010150750公开日2010年8月25日申请日期2010年4月20日优先权日2010年4月20日发明者王芳,王萌,聂开立,谭天伟,邓利,鲁吉珂申请人:北京化工大学