专利名称：稻瘟病抗性基因Pia-C功能特异性分子标记及其方法与应用的制作方法水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是对水稻生产危害最严重的病害之一,每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素的影响，鉴定 结果容易造成误差，目标基因的选择效率往往较低。随着分子标记技术的产生以及利用，其方便、直接、不受环境影响等优点使得该技术的应用价值及前景越来越受到关注。在育种方面，通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的分子标记来对目标基因进行选择，不仅选择可靠性高，而且还大大加快了育种步伐。水稻稻痕病抗病基因Pia被定位于第11染色体短臂端(Zeng et al. 2011.Characterization and fine mapping of the rice blast resistance gene Pia.Science China Life Sciences 54:372-378)上，并已成功地被克隆(Okuyama et al. 2011.A multifaceted genomics approach allows the isolationof the rice Pia-blastresistance gene consisting of two adjacent NB S-LRR protein genes. Plant Journal66:467-479)。此外，申请人通过图位克隆方法(Map-based cloning),在水稻供体品种C039(Zeng et al. 2011. SCIENCE CHINA 54:372-378)中分离、鉴定到了一个具有独特抗谱的稻瘟病抗性基因Pia-C。对Pia-C的序列分析过程中发现，在包含Pia-C位点的基因组区域中，Pia-C供体品种C039与Pia的供体品种AichiAsahi具有相似的基因组结构，即与参考序列日本晴之间存在着大片段的插入/缺失。进一步的功能互补实验结果证明了 Pia-C属于Pia的等位基因(申请人未发表数据)。研究表明，Pia-C基因的稻瘟病抗性须由2个相邻的NBS-LRR类型的抗病基因共同介导。同时，在水稻群体中，包含该基因的基因组区域存在着基因型的分化，即当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时存在时，该基因型定义为A型；当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因同时不存在时，该基因型定义为N型(基因型与感病水稻参考品种日本晴的相同)。进一步地，在功能性A型品种中，当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因结构和功能与Pia相似时，该基因型定义为A型；当相邻的2个功能性的NBS-LRR基因结构和功能与Pia-C相似时，该基因型定义为C型。Pia-C型所具有的独特抗谱，使之可以广泛地应用于稻瘟病抗性育种计划中。因此，为了加快Pia-C在抗病育种工作中的应用，如在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、抗性基因Pia-C与其他功能基因的聚合育种、以及转基因育种等，开发出准确有效的Pia-C功能特异性分子标记显得尤其重要。
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的是提供一种稻瘟病抗性基因Pia-C功能特异性分子标记Pia-C-FNP。本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia-C功能特异性分子标记Pia-C-FNP的检测方法。本发明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia-C功能特异性分子标记Pia-C-FNP 的应用。本发明目的通过以下技术方案实现一种稻瘟病抗性基因Pia-C功能特异性分子标记Pia-C-FNP，它由Pia-C-IFNP和 Pia-C-2FNP组合而成，分别由引物对SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2，以及SEQ ID NO: 3和SEQ ID N0:4从水稻总DNA中扩增出来的核苷酸序列，分别经特异性酶切之后电泳检测，与稻瘟病抗性基因Pia-C呈特异性带型的分子标记；所述引物对的核苷酸序列如下所示SEQ ID NO. I (5，_3，)TGCAAGCTAATGGCTGGTCGA ；SEQ ID NO. 2 (5’ _3，)TAGACTGGTGTAGTTGCGGAC ；SEQ ID NO. 3 (5’ _3，)GTGCAGTCCTGATCAGTACTC ；SEQIDN0. 4 (5’ _3’)AGAGCCACCAGGCGAACAG ；所述的水稻品种为C039 ；所述稻瘟病抗性基因Pia-C包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pia_C_l和Pia-C-2, 2个编码基因的DNA序列分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示；所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特异性分子标记Pia-C-FNP的检测方法，通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pia-C的等位基因序列与SEQ ID NO. 5及SEQID NO. 6做比对的方法，分析得到能区别于其等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pia-C功能特异性的一对单碱基差异(single nucleotide polymorphism, SNP),再通过设计分别得到 SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQID NO. 4引物，分别对水稻基因组DNA进行扩增、 酶切，分别得到Pia-C功能特异性分子标记Pia-C-IFNP和Pia_C_2FNP，二者组合为Pia-C功能特异性分子标记Pia-C-FNP。优选的，所述的稻瘟病抗性基因Pia-C功能特异性分子标记Pia-C-FNP的检测方法，包括以下步骤(I)通过常规PCR法扩增，获得多个A型和C型水稻品种的Pia-C等位基因的编码区DNA序列。(2)利用多序列比对软件工具(http://multalin. toulouse. inra. fr/multalin/)，将步骤(I)所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到Pia-C型抗性基因所特异的2个SNP，分别位于Pia-C组成基因中的Pia-C-I的NB区域和Pia_C_2的LRR区域，最终导致功能特异性氨基酸的改变；(3)根据步骤(2)所得到的2个SNP，分别设计出引物对SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 2，以及SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 ;并用这2组引物分别对不同水稻品种的总DNA进行PCR扩增反应，得到扩增产物A和扩增产物B ;然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证，分别获得与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的核苷酸片段Pia-C-IFNP和Pia-C-2FNP ；。(4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pia-C抗性基因的功能特异性的分子标记Pia-CFNP。更优选的，步骤(I)中所述的水稻品种为C039、C101LAC、Aichi Asahi 以及 Dongnong363 ; 步骤(2)中所述的序列比对优选为将核苷酸序列翻译成蛋白质序列后进行比对；步骤(3)中所述的扩增产物A的大小为128bp，Sail酶切后大小仍为128bp，表明为C型(相邻的2个功能性的NBS-LRR基因结构和功能与Pia-C相似);扩增产物A经过SalI酶切后为lllbp，表明为A型(相邻的2个功能性的NBS-LRR基因结构和功能与Pia相似)；步骤(3)中所述的扩增产物B的大小为137bp，Pvu II酶切后大小仍为137bp，表明为A型；Pvu II酶切后大小为83bp，表明为C型；步骤(3)中在Pia-C-I的SNP处,根据dCAPS标记的设计原理,设计带有错配碱基的功能特异性引物Pia-C-IFNP-F JBSEQ ID NO. I所示；在该SNP下游100_200bp处设计功能特异性下游引物Pia-C-IFNP-R，如SEQ ID NO. 2所示；根据CAPS标记的设计原理，在在Pia-C-2的SNP上游60-100bp处设计功能特异性上游引物Pia-C_2FNP_F，如SEQ ID NO. 3所示；在上述SNP下游60-100bp处设计功能特异性下游引物Pia-C-2FNP-R，如SEQ ID NO. 4所示。步骤(3)中所述的PCR扩增反应，其中扩增产物A的PCR扩增反应体系如下本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pia-C功能特异性分子标记及其方法与应用。该分子标记由Pia-C-1FNP和Pia-C-2FNP组成。本发明通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pia-C的等位基因序列与SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6序列做比对的方法，分析得到能区别于其他感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因功能特异性的一对单碱基差异。再通过设计，分别得到SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，以及SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物，对水稻DNA扩增，分别得到Pia-C功能特异性分子标记Pia-C-1FNP和Pia-C-2FNP，二者组合则可准确地检测功能性的Pia-C。本发明可在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种中的得到应用。