一种治疗脂肪肝的中药组合物及其制备方法和用途[0002]非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，普通成人NAFLD患病率10%~30%，其中10%~20%为NASH，后者10年内肝硬化发生率高达25%。
[0003]本发明的第一个目的在于提供一种治疗脂肪肝的中药组合物。[0004]本发明的第二个目的在于提供该组合物的制备方法。[0005]本发明的第三个目的在于提供该组合物在制备治疗脂肪肝药物中的应用。[0006]本发明的目的是通 过如下技术方案实现的:[0007]—种治疗脂肪肝的中药组合物，该中药组合物由如下重量比的原料药组成:
[0008]柴胡5-50重量份、积壳5-50重量份、茵陈15-150重量份、桅子4_50重量份、大黄2-30重量份、泽泻15-150重量份、白术8-100重量份、半夏4_50重量份、厚朴4_50重量份、薏该仁10-120重量份、白蘧仁2-30重量份、滑石8-100重量份、陈皮6_80重量份、川弯
4-50重量份、香附6-80重量份、白苟10-120重量份、甘草2_30重量份。
[0009]进一步,其原料药组成为:
[0010]柴胡6_45重量份、积壳6_45重量份、茵陈18-120重量份、桅子5_40重量份、大黄3-25重量份、泽泻18-120重量份、白术10-80重量份、半夏5_40重量份、厚朴5_40重量份、薏苡仁12-100重量份、白蘧仁3-25重量份、滑石10-80重量份、陈皮8_70重量份、川芎
5-40重量份、香附8-70重量份、白苟12-100重量份、甘草3_25重量份。
[0011]进一步,其原料药组成为:
[0012]柴胡7-30重量份、积壳7-30重量份、茵陈20_90重量份、桅子6_30重量份、大黄4-20重量份、泽泻20-90重量份、白术12-60重量份、半夏6_30重量份、厚朴6_30重量份、薏苡仁15-70重量份、白蘧仁4-20重量份、滑石12-60重量份、陈皮10-50重量份、川芎6_30重量份、香附10-50重量份、白苟15-70重量份、甘草4-20重量份。
[0013]进一步,其原料药组成为:
[0014]柴胡8-20重量份、积壳8-20重量份、茵陈22_50重量份、桅子7_20重量份、大黄4-10重量份、泽泻22-50重量份、白术12-30重量份、半夏7_20重量份、厚朴7_20重量份、薏苡仁18-40重量份、白蘧仁4-10重量份、滑石12-30重量份、陈皮10-30重量份、川芎7_20重量份、香附10-30重量份、白芍18-40重量份、甘草4-10重量份。
[0015]更进一步，其原料药组成为:
[0016] 柴胡10重量份、枳壳10重量份、茵陈30重量份、桅子9重量份、大黄6重量份、泽泻30重量份、白术15重量份、半夏9重量份、厚朴9重量份、薏苡仁20重量份、白蘧仁6重量份、滑石15重量份、陈皮12重量份、川芎9重量份、香附12重量份、白芍20重量份、甘草6重量份；
[0017]或，柴胡9重量份、枳壳15重量份、茵陈25重量份、桅子12重量份、大黄5重量份、泽泻40重量份、白术13重量份、半夏12重量份、厚朴8重量份、薏苡仁30重量份、白蘧仁5重量份、滑石25重量份、陈皮11重量份、川芎12重量份、香附11重量份、白芍30重量份、甘草5重量份；
[0018]或,柴胡15重量份、积壳9重量份、茵陈40重量份、桅子8重量份、大黄8重量份、泽泻25重量份、白术25重量份、半夏8重量份、厚朴12重量份、薏苡仁18重量份、白蘧仁8重量份、滑石13重量份、陈皮20重量份、川芎8重量份、香附20重量份、白芍18重量份、甘草8重量份。
[0019]本发明所述大黄为制大黄；白术为炒白术；白芍为炒白芍。
[0020]本发明中药组合物可以直接将上述比例的原料药粉碎后混合制得，也可以按常规方法提取制备，还可以进一步纯化精制，还可以进一步加入常规辅料按常规制剂工艺制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、口服液、混悬液、乳浊液、注射剂。
[0021 ] 所述常规提取方法包括煎煮提取、回流提取、浸泡提取、超声提取或渗漉提取中的一种或几种方式；
[0022]所述提取溶剂为水或与水互溶的有机溶剂；进一步为甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种；更进一步优选为50-90%的乙醇；更进一步优选为60-80%的乙醇；
[0023]所述纯化精制方法包括水提醇沉、萃取或经过大孔树脂柱、硅胶柱纯化等；
[0024]所述常规辅料包括:填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括:淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括:淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括:硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括:淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括:糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括:甜味剂及各种香精；防腐剂包括:尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括:PEG6000，PEG4000,虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第I版中各剂型记载的辅料)。
[0025]本发明所述中药组合物除以上述原药材形式投料外，还可以采用以提取物(有效部位)形式投料，因此本发明进一步公开了一种治疗脂肪肝的中药组合物:
[0026]一种治疗脂肪肝的中药组合物，该中药组合物由如下重量比的原料药组成:
[0027]柴胡提取物5-50重量份、枳壳提取物5-50重量份、茵陈提取物15-150重量份、桅子提取物4-50重量份、大黄提取物2-30重量份、泽泻提取物15-150重量份、白术提取物8-100重量份、半夏提取物4-50重量份、厚朴提取物4-50重量份、薏苡仁提取物10-120重量份、白蘧仁提取物2-30重量份、滑石8-100重量份、陈皮提取物6-80重量份、川芎提取物4-50重量份、香附提取物6-80重量份、白芍提取物10-120重量份、甘草提取物2_30重量份。
[0028]进一步,其原料药组成为:
[0029]柴胡提取物6-45重量份、枳壳提取物6-45重量份、茵陈提取物18-120重量份、桅子提取物5-40重量份、制大黄提取物3-25重量份、泽泻提取物18-120重量份、炒白术提取物10-80重量份、半夏提取物5-40重量份、厚朴提取物5-40重量份、薏苡仁提取物12-100重量份、白蘧仁提取物3-25重量份、滑石10-80重量份、陈皮提取物8-70重量份、川芎提取物5-40重量份、香附提取物8-70重量份、炒白芍提取物12-100重量份、甘草提取物3_25重量份。
[0030]进一步,其原料药组成为:
[0031]柴胡提取物7-30重量份、枳壳提取物7-30重量份、茵陈提取物20_90重量份、桅子提取物6-30重量份、制大黄提取物4-20重量份、泽泻提取物20-90重量份、炒白术提取物12-60重量份、半夏提取物6-30重量份、厚朴提取物6-30重量份、薏苡仁提取物15-70重量份、白蘧仁提取物4-20重量份、滑石12-60重量份、陈皮提取物10-50重量份、川芎提取物6-30重量份、香附提取物10-50重量份、炒白芍提取物15-70重量份、甘草提取物4_20重量份。
[0032]更进一步，其 原料药组成为:
[0033]柴胡提取物10重量份、枳壳提取物10重量份、茵陈提取物30重量份、桅子提取物9重量份、制大黄提取物6重量份、泽泻提取物30重量份、炒白术提取物15重量份、半夏提取物9重量份、厚朴提取物9重量份、薏苡仁提取物20重量份、白蘧仁提取物6重量份、滑石15重量份、陈皮提取物12重量份、川芎提取物9重量份、香附提取物12重量份、炒白芍提取物20重量份、甘草提取物6重量份；
[0034]或，柴胡提取物9重量份、枳壳提取物15重量份、茵陈提取物25重量份、桅子提取物12重量份、制大黄提取物5重量份、泽泻提取物40重量份、炒白术提取物13重量份、半夏提取物12重量份、厚朴提取物8重量份、薏苡仁提取物30重量份、白蘧仁提取物5重量份、滑石25重量份、陈皮提取物11重量份、川芎提取物12重量份、香附提取物11重量份、炒白芍提取物30重量份、甘草提取物5重量份；
[0035]或，柴胡提取物15重量份、枳壳提取物9重量份、茵陈提取物40重量份、桅子提取物8重量份、制大黄提取物8重量份、泽泻提取物25重量份、炒白术提取物25重量份、半夏提取物8重量份、厚朴提取物12重量份、薏苡仁提取物18重量份、白蘧仁提取物8重量份、滑石13重量份、陈皮提取物20重量份、川芎提取物8重量份、香附提取物20重量份、炒白芍提取物18重量份、甘草提取物8重量份。
[0036]上述提取物可以是按常规方法提取制备得到的提取物，还可以是经进一步纯化精制制备得到的有效部位；
[0037]所述常规提取方法包括煎煮提取、回流提取、浸泡提取、超声提取或渗漉提取中的一种或几种方式；
[0038]所述提取溶剂为水或与水互溶的有机溶剂；进一步为甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种；更进一步优选为50-90%的乙醇；更进一步优选为60-80%的乙醇；
[0039]所述纯化精制方法包括水提醇沉、萃取或经过大孔树脂柱、硅胶柱纯化等。
[0040]本发明还提供了上述中药组合物在制备治疗脂肪肝药物中的应用。
[0041]进一步，所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝。
[0042]更进一步，所述中药组合物在制备改善非酒精性脂肪肝肝脏纤维化药物中的应用。
[0043]本发明研究表明，本发明组合物可显著改善非酒精性脂肪肝脏的症状；通过提高脂联素受体AdipoR2mRNA、AdipoRlmRNA表达达到改善非酒精性脂肪肝的效果；并对改善肝脏纤维化具有一定的作用。
[0044]实验例I本发明组合物对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏病理变化的影响
[0045]I实验材料
[0046]1.1实验动物
[0047]清洁级健康雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXK (京)2012-0001 )，体重约180土 10g，45只，词养于北京中医药大学东直门医院SPF级动物实验中心。采用标准化光照及饮食。
[0048]1.2高脂饲料
[0049]高脂饲料购自北京科澳协力饲料有限公司(许可证号SCXK (京)2009-0012)。高脂饲料由88%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油组成，为SPF级饲料，真空包装，IOKg/包，钴60灭菌，常温保存。(普通饲料的热量组成为:碳水化合物、脂肪、蛋白质分别占65.5%、10.3%和24.2% ;高脂饲料热量组成为:碳水化合物、脂肪、蛋白质分别占总热量的53%、27.4%和
19.6%ο)
[0050]1.3实验药物
[0051]本发明药物组合物，按实施例1方法制备，至Iml药液相当于2g生药量。
[0052]1.4主要试剂
[0053]10%水合氯酵(北京化学试剂有限公司)，甲醛溶液分析醇(国药集团化学试剂有限公司)，二甲苯(北京化学试剂有限公司)，伊红染料、苏木精(北京化学试剂有限公司)，油红O试剂(Sigma)，生理盐水(北京双鹤药业有限责任公司)。
[0054]1.5主要仪器
[0055]全自动石赌包埋机(Leica),全自动石错切片机(Leica),显微镜(Olympus),显微照相系统(Olympus),冰冻病理切片机(Leica),分析天平,超低温保存冰箱(Sanyo),电子天平(上海第二天平仪器厂)，标尺。
[0056]1.6主要试剂的配制
[0057]油红O染液:油红O原液30ml，蒸馏水20ml，二者混合lOmin，真空过滤待用。
[0058]磷钥酸水溶 液:磷钥酸lg，蒸馏水100mL，混匀待用。
[0059]2实验方法
[0060]2.1分组设计
[0061]适应性饲养一周后，开始给予高脂饲料喂养造模，自造模之日起，采用随机数字表法，随机选取9只大鼠作为正常对照组。其余大鼠以高脂饲料造模，至第7周，采用随机数字表法，将造模大鼠随机分为模型组8只、干预组27只。干预组又分为本发明组合物低剂量组(10ml/kg) 9只、中剂量组(20ml/kg) 9只、高剂量组(30ml/kg) 9只。
[0062]2.2造模方法
[0063]以高脂饲料饲养大鼠12周的方法诱导非酒精性脂肪肝(NAFLD)。模型组与干预组每天给予充足的高脂饲料让其自由进食。
[0064]2.3给药方式
[0065]于造模后第4周随机麻醉后处死模型组大鼠I只，取肝脏组织作病理检测，观察造模情况。干预组在高脂饲料喂养6周后，即自第7周开始以本发明组合物干预治疗，低剂量组按10ml/kg、中剂量组按20ml/kg、高剂量组按30ml/kg分别灌胃给药,分别相当于60Kg体重成人用药量的6倍、12倍、18倍；正常对照组与模型组大鼠予以生理盐水按10ml/kg灌胃，各组均每日灌胃I次。实验至12周末(即疗程6周)，禁食不禁水24小时后，腹主动脉取血后取材。
[0066]2.4观察各组大鼠肝脏组织病理形态学变化
[0067]于造模第4周随机选取I只大鼠，取材进行HE染色、油红O染色及Masson三重染色观察肝脏病理形态。至疗程6周末，禁食不禁水24小时后，称重，10%水合氯酸(0.35ml/100g)腹腔注射麻醉，剖开腹腔，肉眼观察肝脏的形态、色泽等情况，并于冰上快速摘取肝脏，生理盐水清洗，称肝湿重，按照前述方法计算肝指数，取肝脏右叶1/2用锡纸包裹，快速送病理科制作冰冻切片，行油红O染色；并取肝脏右叶其余1/2，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋 ，常规切片作HE染色和Masson三重染色。显微镜下观察，每张切片取5个IOX 10低倍镜视野。
[0068]2.4.1油红O染色方法
[0069]①用蒸馏水浸洗冰冻切片?，②60%异丙醇浸洗0.5min ;③油红O染液染色15min ；
④60%异丙醇漂洗5s;⑤流水冲洗，再用蒸馏水洗；⑥苏木素复染0.5min.自来水冲洗，再用蒸馏水洗；⑧中性树胶封固。
[0070]2.4.2HE 染色方法
[0071]①肝脏组织用4%多聚甲醛固定24~48h 50%、60%、70%、80%、90%、95%酒精梯度脱水各30min，100%酒精30minX2次；③二甲苯透明Ih ;④二甲苯、52°C石蜡等量混合液预浸30min，再浸蜡3h ;⑤包埋，再于4°C冰箱过夜。作4 μ m切片，46°C捞片后，放入72°C烘箱内烤片4h ;⑥二甲苯脱蜡5~10minX2次；? 100%酒精5minX2次，95%、90%、85%、80%、75%酒精各5min，自来水洗3min ;⑧苏木精染色3min，自来水冲洗lmin，1%盐酸酒精分化20s，自来水冲洗2min终止分化并反蓝，伊红染色30s，自来水洗30s，70%、80%、90%、95%酒精各脱水lmin、100%酒精脱水2minX2次，二甲苯透明2minX2次；⑨中性树胶封固。
[0072]2.4.3Masson三重染色方法
[0073]①石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗；②地衣红染液染色60min，蒸馏水洗3min ;③苏木素染液染色5min，再用盐酸分化水洗返蓝，蒸馏水洗丽春红、酸性复红液染色IOmin ；
⑤冰醋酸水溶液浸洗lmin，蒸馏水洗；⑥磷钥酸水溶液浸洗5min至胶原纤维为无色；⑦冰醋酸水溶液浸洗30s，再在亮绿染液染色Imin ;⑧冰醋酸水溶液浸洗30s 无水乙醇脱水，二甲苯透明；⑩中性树胶封固。
[0074]3实验结果
[0075]于造模第4周，随机取材I只，行HE染色和冰冻切片油红O染色，光镜下观察可见肝脏组织弥漫性大泡性脂肪变，肝细胞气球样变，胞浆内充满着大量大小不等脂滴，可见片状红染区域，提示NAFLD造模成功。
[0076]于干预结束取材，进行病理观察分析如下所述。
[0077]3.1肉眼观察
[0078]正常对照组:肝脏外观形态大小正常，呈红褐色，表面光滑有光泽，边缘锐利，质韧，与周围组织无粘连，肾周和附睾周围含有少量脂肪组织。
[0079]模型组:肝脏体积明显增大，肝叶形态饱满，重量明显增加，呈红黄相间或略显苍白，包膜紧张，表面粗糙，呈油腻感，边缘圆钝，质地软，与周围组织有明显粘连，肾周和附睾周围含有大量脂肪组织。
[0080]本发明组合物低剂量组:肝脏体积明显增大，肝叶形态饱满，重量明显增加，呈砖红色或红黄白相间，表面粗糙，呈油腻感，边缘钝，质地软，与周围组织轻度粘连，肾周和附睾周围含有大量脂肪组织。
[0081]本发明组合物中剂量组:肝脏体积增大，肝叶形态略饱满，重量增加，呈砖红色或红黄白相间，表面略粗糙，略呈油腻感，边缘略顿，质稍韧，与周围组织稍有粘连，肾周和附睾周围含少有量脂肪组织。
[0082]本发明组合物高剂量组:肝脏体积近似正常对照组，呈砖红色，表面略光滑，稍油腻感，边缘略锐利，质稍韧，与周围组织无粘连，肾周和附睾周围含少有量脂肪组织。 [0083]3.2HE染色结果
[0084]正常对照组:肝脏组织结构完整、清晰，汇管区小动脉、小静脉及胆管结构正常，肝索以中央静脉为中心呈放射状排列，结构清楚，界板完整，肝索与肝窦比例正常，肝细胞沿着肝窦呈放射状，排列整齐，肝细胞为单核或双核，核结构清晰无异常，胞浆粉染，颗粒大小均匀一致，无明显炎症改变。
[0085]模型组:肝脏组织可见重度弥漫性大泡性脂肪变，肝细胞气球样变，肝索排列紊舌L无放射状排列，肝细胞肿胀，胞浆内充满着大量大小不等脂滴，肝细胞核明显偏位，炎症明显，肝细胞内可见中性粒细胞浸润，小叶内可见部分坏死灶，炎性细胞浸润至汇管区，可见大量炎性细胞聚集。
[0086]本发明组合物低剂量组:肝脏组织可见肝组织轻度弥漫性大泡性脂肪变，肝细胞气球样变明显减少，部分肝细胞内有细小脂滴，肝细胞肿胀不明显，未见肝细胞坏死和炎性细胞浸润。
[0087]本发明组合物中剂量组:肝细胞脂肪变不明显，无气球样变，肝小叶和肝血窦结构清晰，细胞结构完整，未见肝细胞坏死和炎性细胞浸润。
[0088]本发明组合物高剂量组:肝细胞脂肪变不明显，无气球样变，肝小叶和肝血窦结构清晰，细胞结构完整，未见肝细胞坏死和炎性细胞浸润。
[0089]3.3Masson三重染色结果
[0090]正常对照组:肝小叶结构完整，无纤维组织增生。
[0091]模型组:可见汇管区、汇管区周围、窦周纤维化，纤维间隔内纤维组织增生明显，有炎细胞浸润，但未形成假小叶。
[0092]本发明组合物低剂量组:肝纤维化较模型组减轻，炎性细胞浸润及结缔组织形成减少，纤维间隔变薄，未见假小叶。[0093]本发明组合物中剂量组:肝纤维化较模型组明显减轻，炎性细胞浸润及结缔组织形成明显减少，纤维间隔显著变薄，未见假小叶。
[0094]本发明组合物高剂量组:肝纤维化较模型组明显减轻，炎性细胞浸润及结缔组织形成明显减少，纤维间隔显著变薄，未见假小叶。
[0095]3.4油红O染色结果
[0096]正常对照组:肝脏背景呈淡蓝色，无明显脂滴着色，未见明显红色区域。
[0097]模型组:肝组织可见大片红色区域，颜色较深，显示肝细胞胞浆内脂滴弥漫、分布密集，肝小叶内脂滴融合成片，小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为43-54%。
[0098]本发明组合物低剂量组:可见红色区域减少，颜色变浅，小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为35-45%。
[0099]本发明组合物中剂量组:可见红色区域显著减少，颜色明显变浅，小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为2-10%。
[0100]本发明组合物高剂量组:可见红色区域显著减少，颜色明显变浅，小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为2-8%。
[0101]4 结论 [0102]上述肝脏病理观察结果显示，模型组呈现典型的NAFLD表现，本发明组合物可使其明显改善。
[0103]实验例2本发明组合物对非酒精性脂肪肝大鼠AdipoR2、AdipoRl表达的影响
[0104]I实验材料
[0105]1.1实验动物及药物
[0106]同实验例I。
[0107]1.2主要试剂
[0108]超纯RNA提取试剂盒(CWbi0.C0.Ltd), HiF1-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(Cffbi0.C0.Ltd), PCR Mixture (CWbi0.C0.Ltd), DNasel (CWbi0.C0.Ltd), DEPC (Sigma),扩增引物(北京环亚泰克生物医学技术有限公司)，DNA Marker (Santa Cruz),组织裂解液(北京索莱宝科技有限公司)，琼脂糖(Promega)。
[0109]1.3主要仪器
[0110]超纯水系统(Mi 11 ipore ),高速低温离心机(Eppendorf ), PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司)，电泳仪(Amersham),垂直电泳槽(Amersham),凝胶成像图像分析系统(MediaCybernetics),半干转膜仪(Amersham),电热恒温水浴箱(北京市六一仪器厂)。
[0111]1.4主要试剂的配制
[0112]丙烯酞胺凝胶贮备液:将29.2g丙烯酞胺溶解在60ml双蒸去离子水中，加入0.SgN, N-亚甲双丙烯酞胺，再用双蒸水定容至100mL，过滤，4°C避光保存于棕色瓶中。
[0113]浓缩胶缓冲液:将6.0g Tris溶解于60ml双蒸去离子水中，用HCl调整PH至6.8，用双蒸水定容至100ml，4°C保存。
[0114]分离胶缓冲液:将18.15g Tris溶解于50ml双蒸去离子水中，用HCl调整pH至
8.8，双蒸水定容至100ml，4°C保存。
[0115]10%SDS:将IOg SDS溶于90ml双蒸去离子水中，再用双蒸水定容至100ml。
[0116]IOX电泳缓冲液:将30.3g Tris、144.09甘氨酸和10.0g SDS用双蒸水定容至1000ml，用时用双蒸水稀释10倍。
[0117]10%过硫酸胺:将1.0g过硫酸胺溶于IOml双蒸去离子水中。
[0118]转移缓冲液:甘氨酸14.4g，Tris3.03g溶于0.4L双蒸去离子水中。
[0119]加样缓冲液:0.5M Tris-HCI (pH6.8) 1.25ml, 10%SDS2.0ml,0.5% 溴酚蓝 0.5ml,甘油2.5ml，蒸馏水3.25ml，混匀后置室温保存。
[0120]DEPC水:将DEPClml溶于1000ml双蒸水中摇匀，置室温下过夜，次日高压20min，冷却后置于4°C冰箱保存。
[0121]L 5引物设计
[0122]脂联素受体AdipoR2、AdipoRl引物由北京环亚泰克生物医学技术有限公司合成。相关引物用Primerf软件在线设计，并在基因库中进行比对，合成引物序列如表1所示。
[0123]表1大鼠肝脏脂联素受体RT-PCR引物序列
[0124]